GBT28099-2011水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法.pdf 9页

'ICS65．020．01B16蝠园中华人民共和国国家标准GB／T28099--2011水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv．oryzicDf口(Fangeta1．)Swingseta1．2011-12-30发布2012—06—01实施宰瞀徽紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会厦19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载月U吾GB／T28099--2011本标准按照GB／T1．1--2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：易建平、林石明、周国粱、粟寒、印丽萍、孔德英、许志刚、胡白石。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法。本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定。2规范性引用文件GB／T28099--201下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T0800．1进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3水稻细菌性条斑病菌基本信息中文名：水稻细菌性条斑病菌(稻黄单胞菌稻生致病变种)。学名：Xanthomonasoryzaepv．oryzicola(Fangeta1．，1956)Swingseta1．，1990，简称Xoc。异名：Xanthomonascampestrispv．oryzicola(Fangeta1．，1956)Dye1978；Xanthomonasoryzicola(Fangeta1．，1956)Dowson1943；Xanthomonastranslucensf．sp．oryzicola(Fangeta1．，1956)Bradbury1971。病害英文名：bacterialleafstreakofrice。属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，7变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthon∞nodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanthomonas(Dowson，1939)。病菌主要在病种子和病草上越冬，其次在水稻再生苗或李氏禾等杂草上越冬。病菌主要借雨水、流水等传播，带菌种子是远距离传播的主要途径之一。水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A。4方法原理根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定。5主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。三羟甲基胺基甲烷盐酸盐(Tris—HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(sDs)、十六烷基三甲基溴化胺(cTAB)、三氯甲烷、异戊醇、乙醇、蛋白酶、溴化乙锭、酵母粉、琼脂、蛋白胨、牛肉浸膏、营养肉汤、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠。培养基和试剂配方见附录B。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28099--2016仪器用具超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养皿、三角瓶、剪刀、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。7检测与鉴定7．1现场检疫按照SN／T2122和sN／T0800．1规定的程序进行现场检疫并抽取样品。7．2实验室检测7．2．1有症叶片的分离有症叶片用无菌水冲洗后取病斑前沿2mm～7mm部分用70％酒精表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，置于无菌载玻片上，加一滴无菌水，不加盖玻片，置于显微镜下观察喷菌现象，如观察到喷菌现象，从喷菌处用接种环取一环处理液在NA(PsA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d～5d。7．2．2无症叶片的分离取10张无症叶片，剪碎研磨后提取DNA，进行PCR检测，DNA提取程序和PCR检测程序见附录c。阳性样品进行病菌分离。另取无症叶片10张，无菌水冲洗叶面，70％酒精表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，加入适量无菌水，静置15rain，用接种环取处理液在NA(PSA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d～5d。7．2．3从种子中分离种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测，100g种子磨碎后置于200mL含有0．01％Tween20的无菌水中4℃过夜，取100pL处理液在PSA培养基平板上涂布，重复3个平板，27℃培养2d，每个平板用1mL无菌水洗下，取洗板液用于PCR检测，阳性样品进行病菌分离。取种子处理液lmL在无菌水中系列稀释三次，分别取稀释和未稀释的处理液100pL在NA(PsA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d～5d。7．3鉴定方法7．3．1形态特征鉴定NA培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色；NBY培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，牿液状；PSA培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定。7．3．2生理生化鉴定病菌能使明胶液化，使石蕊牛乳胨化，使阿拉伯糖产酸；不还原硝酸盐，产生氨和硫化氢；不产生吲哚；可分解蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和乳糖等产生酸，但不产生气体；对青霉素、葡萄糖反应钝感。也可用BIOLOG微生物自动鉴定系统进行鉴定。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7．3．3PCR方法鉴定GB／T28099--2011制备分离物108CFU／mL细菌悬浮液，1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测程序见附录C。7．4致病性测试三种鉴定方法之一为阳性的分离物进行致病性测试。30d～45d龄期大小的IR24或汕优63种植在12h光照／黑暗的循环条件下，最适温度为28℃～32℃／22℃(白天／夜晚)。用无菌生理盐水配制108CFU／mL细菌悬浮液，无菌接种针蘸取菌液后针刺接种于叶片中部，每张叶片针刺两个点，共接种30张～40张叶片。接种植株用塑料袋保湿24h，12h光照／黑暗的循环条件下30℃培养，接种48h～72h后观察症状，最长至14d。初始症状为接种点出现红色条斑，通常10d后显症，病斑边缘为线条形，沿叶脉扩展。如果产生典型症状，从接种病斑上再次分离病菌，培养基上形态特征相符或PCR检测为阳性即可认为接种分离物为水稻细菌性条斑病菌。8结果判定从样品中分离得到的可疑分离物用形态特征，生理生化或PCR检测等三种方法之一进行鉴定；阳性分离物进行致病性测试，出现典型症状，判定为检测出Xoc；其余情况判定为未检出Xoc。9样品保存阳性种子样品至少保存6个月，至少1000粒，以备复核、谈判和仲裁；阳性的植物材料及时销毁处理；分离菌株应妥善保存，将菌株转接到NA试管斜面上，28℃培养48h。然后置于4℃冰箱中保存，定期(30d)转接；或在菌悬液中加入15％～30％甘油于--80℃下保存；必要时可将菌株冻干，--80。CTK期保存。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28099--20”A．1检疫重要性附录A(资料性附录)水稻细菌性条斑病菌其他信息《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》(2007年)中的检疫性有害生物之一，目前国内受害病区已超过11个省。欧洲和地中海国家植物保护组织(EPPO)的A1类检疫性有害生物。目前分布于热带亚洲地区、西非和澳大利亚等地。A．2寄主植物主要寄主是水稻Oryzasativa；其他寄主包括：稻属Oryzaspp．，李氏禾属Leersiaspp．，丝千金子Leptochloafiliformis，圆果雀稗Paspalumorbiculare，茭白Zizaniaaquatica，沼生菰Z．palustris和结缕草Zoysiajaponica。A．3形态特征病菌为革兰氏染色阴性，短杆状，大小(o．4pm～o．6pm)×(1．1／-tm～2．0pm)；无芽孢和荚膜，菌体外具粘质的胞外多糖包围；单生，很少成对，不呈链状；极生鞭毛一根。最适生长温度25℃～28℃，生长温限8℃～38℃。A．4症状特征整个水稻生育期的叶片均可受害。病菌进入气孔在叶片薄壁组织内繁殖，主要感染叶片薄壁组织细胞，局部侵染。病斑初呈暗绿色水渍状半透明的小点，渐形成叶脉间透明条斑，限在叶脉之间延伸，颜色由黄褐转橙褐色，这种透明条斑与白叶枯病的不透明症状差异明显。病斑上常泌出许多露珠状的蜜黄色菌脓(参见图A．1)。病情严重时，许多条斑融合、连接在一起，成为不规则的黄褐色至枯黄色斑块，此时病叶枯萎，变褐，最后死亡，后期的症状与白叶枯病有些相似(参见图A．2)。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载团AI叶片症状圉A2田间症状 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28099--201IB．1NA培养基附录B(规范性附录)培养基和试剂配方蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL，pH6．8～7．0，121℃湿热灭菌15min。B．2NBY(NutrientBrothYeastExtractAgarMedium)培养基S01．1：营养肉汤8g；酵母粉2g；K2HP042g；KH2P040．5g；琼脂18g；蒸馏水950mL。S01．2：葡萄糖5．0g溶解于蒸馏水50．0mL中。S01．3：1mol／L的MgS04·7HzO1mL(2．46gMgS04·7H20溶解于10mL蒸馏水)。三种溶液单独121℃湿热灭菌15min，待温度降到45℃～50℃时混匀后倒制平板。B．3PSA培养基蔗糖10g，蛋白胨10g，谷氨酸钠1g，琼脂17g，加蒸馏水至1000mL，调节；H至6．8～7．0，加热溶解后121℃湿热灭菌15min。B．4TE-缓冲液用Imol／LTris—HCl，pH8和0．5mol／LEDTA母液配制，1mol／LTris—HCI，10mL；0．5mol／LEDTA，2mL；Jl[1水至1000mL。B．510％SDS(十二烷基硫酸钠)10g溶于100mL水。B．6CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)10gCTAB溶于100mL0．7moi／LNaCl溶液中(0．7mol／LNaCI：4．1gNaCI溶于10mL水)。B．75×TAE缓冲液54gTris；27．5g硼酸；0．5mol／LEDTA，pH8，20mL；加水至1L。配制琼脂糖凝胶用0．5×TAE缓冲液。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载c．1DNA提取程序附录c(规范性附录)PCR检测方法GB／T28099--2011叶片样品组织3g～5g在研钵中研磨后取0．1g转入1．5mL离心管，提取DNA；从种子或叶片上分离的菌株，NB培养基中30℃振荡培养过夜，取1．5mL转入离心管，12000r／rain离心10rain，弃上清液，沉淀提取DNA；组织浸出液12000r／rain离心10rain，弃上清液，沉淀提取DNA。DNA提取步骤：加入500pLTE缓冲液悬浮沉淀，加入lo％SDS75pL和i0mg／mL的蛋白酶10pL，37℃轻轻振荡孵育1h；加入5mol／LNaCI120pL，上下颠倒几次充分混匀，加入CTAB(10％CTAB溶于0．7mol／LNaCl溶液中)100ffL；充分混匀后65℃孵育20rain；加入等体积(约700pL)的三氯甲烷：异戊醇(24：1)，振荡混匀30rain；室温下15000r／min离心30min，取上层水相转入离心管；加入等体积的异丙醇，室温下15000r／min离心30min，弃上清液，沉淀转入750pL70％乙醇中(乙醇洗前可以放入冰箱中过夜)；14000r／rain离心8rain，沉淀在空气中干燥后溶于50pLTE中(可70℃孵育加快溶解)，4℃冰箱中保存备用。商用kit也可用于样品DNA的提取。C．2引物上游引物XooeF：5-atattgggctggtgggtga一3；下游引物XoocR：5-ttggtacgcgatgccctttgcgacgg-3；扩增产物为338bp。c．3PCR反应体系PCR反应体系(50pL)：10×PCR缓冲液，2．5mmol／L的MgCl。，0．2mmol／L的各种dNTP混合物，2u的TaqDNA聚合酶，25pmol／L的每对引物各1．0pL，2pL的细菌悬浮液或DNA模板。c．4PCR反应条件94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。C．5电泳分析取10pL扩增产物与3pL的6×上样缓冲液混合均匀，在0．5×TAE缓冲液配制的1．5％琼脂糖凝胶中，4V／cm～6V／cm电泳30min，溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察，拍照并保存。C．6PCR结果判定阴阳性对照正常的情况下，如果扩增出338bp的特异性条带表明样品中存在Xoc。'