GBT28103-2011小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法.pdf 9页

'ICS65．020．01B16圆亘中华人民共和国国家标准GB／T28103—2011小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofwheatstreakmosaicvirus2011—12—30发布2012—06—01实施宰瞀徽紫瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“”。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置本标准按照GB／T1．1--2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归El。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭京泽、廖芳、刘跃庭、张裕君、刘勇、崔铁军、王金成。GB／T28103—20” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了小麦线条花叶病毒(wheatstreakmosaicvirus)检疫鉴定方法。本标准适用于禾本科植物种子和苗木中的小麦线条花叶病毒检疫鉴定。2规范性引用文件GB／T28103—2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3小麦线条花叶病毒基本信息小麦线条花叶病毒wheatstreakmosaicvirus，属于马铃薯Y病毒科Potyyiridae，小麦花叶病毒属Tritimovirus。缩写：WSMV。小麦线条花叶病毒传播途径有：汁液摩擦传播；种传；介体传播。该病毒容易通过汁液摩擦方式近距离扩散。该病毒能通过带病小麦种子的调运远距离传播。该病毒的传毒介体为小麦卷叶螨Aceriatosichella，成虫和若虫均可带毒传染，卵不传病毒。小麦线条花叶病毒其他信息参见附录A。4方法原理小麦线条花叶病毒的形态学特征、分子生物学特性和血清学特性是该病毒检疫鉴定方法的主要依据。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法、植物病毒免疫电镜检测方法、反转录聚合酶链式反应检测方法，确定样品中带有的小麦线条花叶病毒。5仪器设备、用具及试剂5．1仪器设备酶标仪、洗板机、恒温水浴锅、普通冰箱(o℃～4℃)、20℃低温冰箱、一80℃超低温冰箱、植物光照培养箱(温度可调范围为0℃～50℃)、超净工作台、电子天平(1／lo000g)、微量榨汁机、透射电子显微镜、低速离心机(转速为3000r／min～5000r／min)、PCR仪、纯水仪、电泳仪、凝胶成像系统。5．2用具可调微量移液器(2．5pL、10pL、100pL、1000pL、5000ttL)和相应的吸头、酶联板、封口膜、pH计或pH试纸条(广泛试纸和精密试纸)、1．5mL离心管、PCR反应管、容量瓶(500mL、1000mL)、解剖刀片、镊子、剪刀、吸水纸、白瓷盘、记号笔、标签、一次性手套。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28103—20115．3试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定的检测试剂(见附录B)。反转录聚合酶链式反应检测试剂(见附录c)。植物病毒免疫电镜检测试剂(见SN／T1840)。6现场检测按照SN／T2122的规定进行检疫并抽取种子和种苗样品。7实验室检测对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)，检验程序见附录B。对样品进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定，检验程序见附录C。对样品进行植物病毒免疫电镜(IEM)测定，检验程序见SN／T1840。在电镜下观察到弯曲线状病毒粒子，测定其大小为15nmX700nm，病毒粒子周围有抗体晕圈，则IEM测定结果为阳性。否则IEM测定结果为阴性。8结果判定样品经过DAS—ELISA、RT-PCR测定或IEM测定，其两种或两种以上测定结果均为阳性，则判定该样品带有小麦线条花叶病毒。否则判定样品不带有小麦线条花叶病毒。9样品保存与结果记录9．1样品保存在适宜环境中保存已鉴定带有小麦线条花叶病毒的样品。如叶片应在超低温冰箱中单独保存或冻干保存；生长的苗木应在植物光照培养箱中单独培育；种子应在干燥条件下保存。9．2结果记录与资料保存记录各项数据，包括样品的种类、来源和样品状况，检测的时问、地点、方法和结果，测定人员的签字。DAS—ELISA的测定结果应保存吸光值数据报告，RT-PCR测定结果应保存电泳照片，IEM测定结果应保存病毒粒体照片。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1形态学特征附录A(资料性附录)小麦线条花叶病毒其他信息病毒粒子形态为弯曲线状，无包膜，长690nm～700nm，直径11nm～15nm。A．2地理分布GB／T28103—2011最初报道于美国，目前在美洲、北非、中东、中亚、东亚、东南亚以及欧洲、澳大利亚均有发生。在我国西北的甘肃、陕西等地区曾有发生。A．3寄主范围及症状小麦线条花叶病毒侵染许多小麦品种以及燕麦、大麦、黑麦、一些玉米品种和黍，还侵染多种单子叶杂草，但不侵染双子叶植物。小麦线条花叶病毒引起小麦严重花叶和矮化症状。在小麦苗期，植株叶色变淡，叶片变窄，叶上出现细小褪绿条点及黄色小点，与叶脉平行，并逐渐发展成苍白色断续条纹，部分组织坏死。苍白条纹不规则愈合，在苍白背景的叶片上有残余绿色条纹，叶片是一侧向内纵向卷曲。新叶片上也有褪色条纹，叶脉浊化稍暗。小麦拔节后，节间向下成弧状弯拐，节外复又向上．各节的向地一侧异常膨大造成全茎呈拐节状，此症状在基部1节～3节最为明显。病情严重的植株，全株分蘖向四周匍匐，穗鞘扭卷，不易抽穗或穗而不实。整个病田表现植株松散，外型异常。小麦线条花叶病毒对小麦产量影响大，轻者减产30％～50％，重者颗粒无收。诊断寄主：小麦、大麦、燕麦的所有品种和部分玉米品种表现系统花叶症状并且矮化。该病毒的某些分离物侵染高粱(Sorghumbicolor)偶然出现坏死斑症状。繁殖寄主：冬小麦任何品种都适于做该病毒的繁殖寄主。测定寄主：没有合适的局部斑测定寄主。A．4分子生物学特性小麦线条花叶病毒的核酸为单分子正义ssRNA，长为8．5kb，相对分子量为2．8X106，核酸占病毒粒子质量约为5％。小麦线条花叶病毒的基因组为单分体基因组，RNA的5’端为VPg，3’端为Po|y(A)。基因组编码一个344kDa的多聚蛋白，然后切割成10个产物，分别为40kDa的P1蛋白、44kDa的HC-Pro蛋白、32kDa的P3蛋白、6kDa的6K1蛋白、73kDa的柱状内含体解旋酶、6kDa的6K2蛋白、23kDa的VPg、26kDa的NIa蛋白、64kDa的NIb蛋白及30kDa的外壳蛋白。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28103—2011B．1试剂附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS—ELIsA)方法检测B．1．1包被缓冲液(pH9．6)碳酸钠(NazCO。)1．59g，碳酸氢钠(NaHCOs)2．93g，叠氮化钠(NaN。)0．20g，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至9．6，用蒸馏水定容至1000mL。B．1．2PBST缓冲液(pH7．4)氯化钠(NaCl)8．0g，磷酸二氢钠(KHzPOt)0．2g，磷酸氢二钠(Na：HPO。)1．15g，氯化钾(KCl)0．2g，0．5mLTween-20，叠氮钠(NaNa)0．2g，溶解于900mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至7．4，蒸馏水定容至1000mL。B．1．3样品抽提缓冲液亚硫酸钠(NazS03)20g，2．0gPVP(MW24～4000)，加PBST缓冲液1000mL。B．1．4酶标抗体缓冲液20gPVP(MW24～4000)，BSA2．0g，加PBST缓冲液1000mL。B．1．5底物缓冲液二乙醇胺97mL，蒸馏水600mL，用盐酸调pH至9．8，然后用蒸馏水定容至1000mL。B．1．6底物pNPP(对一硝基苯磷酸钠)B．1．7种子表面消毒液将30％次氯酸钠(NaCIO)100mL溶于900mL蒸馏水中，制成3％种子表面消毒液。B．1．8生物制剂小麦线条花叶病毒检测试剂盒(WSMV特异性抗体和酶标记抗体)。小麦线条花叶病毒阳性质控。小麦线条花叶病毒阴性质控。B．2DAS-ELISA检测B．2．1样品制备B．2．1．1种子类随机抽取或针对性挑选100粒种子，浸入种子表面消毒液中消毒10rnin，用灭菌蒸馏水洗涤种子三次。将种子摆放于铺有湿润吸水纸的白瓷盘内。在植物光照培养箱中，使种子在适宜的发芽温度(20℃～28℃)下催芽长出叶片。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28103—2011用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液，样品质量与抽提缓冲液体积之比为1：10。研磨的植物汁液盛于离心管中，低速离心2min，上清液为待检样品液。B．2．1．2种苗类随机抽取至少20株种苗的叶片0．2g，或针对性采集表现症状的病叶。用微量榨汁机研磨叶片并加入抽提缓冲液，样品质量与抽提缓冲液体积之比为1：10。研磨的植物汁液盛于离心管中，低速离心2rain，上清液为待检样品液。B．2．2检测步骤B．2．2．1在酶联板上设定待检样品孔和对照孔孔位。对照孔包括2个阳性质控孔、2个阴性质控孔、2个空白对照孔。每个待检样品设定两个孔位。B．2．2．2按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释WSMV包被抗体，每孔加入100pL抗体溶液。用封口膜包好酶联板，水浴锅中37℃孵育2h或4℃冰箱过夜。B．2．2．3洗板机洗板3次，洗涤液为PBST缓冲液。B．2．2．4每个待检样品孔加入100pL待检样品液。相应的对照孔中加入100pL阳性质控，100pL阴性质控和100pL样品抽提缓冲液。用封口膜包好酶联板，水浴锅中37℃孵育4h或4℃冰箱过夜。B．2．2．5洗板机洗板4次～6次，洗涤液为PBST缓冲液。B．2．2．6按要求的浓度和需要的体积用酶标抗体缓冲液稀释WSMV酶标抗体，每孔加入100pL酶标抗体溶液，用封口膜包好酶联板，水浴锅中37℃孵育2h～4h。B．2．2．7同步骤B．2．2．3洗板。B．2．2．8按lmg／mL的浓度将oNPP(对一硝基苯磷酸钠)溶于底物缓冲液中(现用现配)。每孔加入100“L底物溶液。室温下避光环境中放置30min～60min。B．2．2．9用酶联仪在405nm波长下测定各孔的吸光值(OD。)。B．3质量控制要求和结果判定B．3．1质量控制要求满足以下条件时，检测结果有效：——空白对照和阴性质控的OD4。。值小于0．15；——阳性质控OD。／阴性质控OD4。。在3～10之间；一重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20％。如阴性质控的OD+。；值小于0．05时，按0．05计算。平均允许率按式(B．1)计算：P一盅高X100％⋯⋯⋯⋯⋯⋯(B．1BODOD／z)‘(1+2)～、’‘7式中：P——平行允许率；OD。——重复样品1；OD。——重复样品2。B3．2结果判定在满足B．3．1的质量要求后，按如下原则作出判定：——样品OD405／阴性质控OD。。。值大于2，DAS-ELISA结果判定为阳性；——样品OD。／阴性质控OD。。；值等于2，判定为可疑，需重做一次或者用其他方法进行验证——样品OD一／阴性质控ODtos值小于2，DAS-ELISA结果判定为阴性。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28103—2011C．1试剂附录c(规范性附录)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测C．1．1饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、MgCIz、3mol／L醋酸钠(pH5．2)、无水乙醇、DEPC、溴化乙锭、琼脂糖、dNTPs、Taq酶、M—MLV反转录酶、RNaseinhibitor、M—MLV反转录缓冲液、Trizol—RNA抽提缓冲液、lo×PCR缓冲液、TAE电泳缓冲液、TE缓冲液、溴酚蓝载样缓冲液。c．1．2RNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒。C．1．3小麦线条花叶病毒阳性对照、阴性对照、DNAladdermarker。C．2实验步骤C．2．1RNA提取将250mg植物材料置于离心管中，液氮冷冻，研碎。悬浮于750pL抽提缓冲液中，继续研磨。再加入等体积的饱和酚：三氯甲烷：异戊醇(25：24：1)，混匀。13000r／rain离心5min，取上清液。加入1／10体积的3mol／L醋酸钠(pH5．2)，2．5倍体积的无水乙醇，一80℃30min以上(或一20℃过夜)。13000r／min离心15min，留沉淀。加入300“L的75％乙醇洗涤。13000r／min离心2rain，弃上清液，重复离心一次，风干。将RNA溶于50pL经DEPC处理的蒸馏水中，作为待检测核酸。分别从WSMV阳性对照、阴性对照中提取RNA。可使用RNA提取试剂盒并按照说明书进行操作。C．2．2引物合成依据文献(DebM＆AndersonJM，2008)所设计的引物序列WSMVL2：5’一CGACAATCAGCAAGAGACCA一3’WSMVR2：5’一TGAGGATCGCTGTGTTTCAG一3’扩增产物大小约为190bp。C．2．3RT-PCR检测C．2．3．1eDNA的合成反应体系为20弘L，包括20tumol／L引物1pL，RNase—freeH。O8．5pL，待检测核酸2弘L，空白对照用RNasefreeH20。88℃水浴10min后，置于冰上，加入10mmol／L的dNTP1pL，40U／t1L的RNaseinhibitor0．5pL，5倍M—MLV反转录缓冲液4pL，100mmol／LDTT2pL，5u／pLMMLV反转录酶1pL，混匀，42℃水浴1h，合成eDNA。同样处理阳性对照、阴性对照和水空白对照。c．2．3．2PCR扩增反应体系50pL，包括10mmol／L的dNTPs1pL，20t-mol／L引物WSMVL2／WSMVR2各lvtL，10倍PCR缓冲液5pL，cDNA2vL，5U／tuLTaq酶l止，双蒸水39pL，进行如下热循环：95℃3min，然后95℃30S，55℃1min，72℃30S，35个循环，最后72℃10min，4℃保存PCR产物。同6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载样处理阳性对照、阴性对照和水空白对照。C．2．4琼脂糖电泳和凝胶成像GB／T28103—2011制备2％的琼脂糖凝胶。取上述PCR产物5pL，加入1pL载样缓冲液，混匀后移人胶孔。样品孔两侧分别加入DNAladdermarker，100V电压下电泳。电泳后的凝胶在0．1％溴化乙锭溶液中染色30rain。在凝胶成像仪下进行分析并拍照，记录实验结果。C．3结果判断阴性对照和空白对照均无扩增条带，待测样品与阳性对照在190bp处均有单一条扩增条带，则判定结果为阳性。阴性对照和空白对照均无扩增条带，阳性对照在190bp处有单一条扩增条带，待测样品无扩增条带，则判定结果为阴性。'