GBT28106-2011郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法.pdf 7页

'ICS65．020．01B16雷雪中华人民共和国国家标准GB／T28106—2011郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法2011—12—30发布DetectionandidentificationofCurtobacteriumflaccumfacienspv．oortiiCollins&Joffes2012—06—01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局当士中国国家标准化管理委员会及仲 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖吾GB／T28106—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭京泽、魏亚东、张裕君、刘跃庭、刘鹏、罗加凤、廖芳、王金成。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围郁金香黄色疱斑病菌检疫鉴定方法GB／T28106—20{1本标准规定了郁金香黄色疱斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于栽培及其他用途的郁金香球茎、郁金香植株上郁金香黄色疱斑病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T4789．28～2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3郁金香黄色疱斑病菌基本信息中文名：郁金香黄色疱斑病菌。学名：Curtobacteriumflaccumfacienspv．oortii。异名：C07yne妇cfP一“优刀accumfacienspv．oortii(Saaltink8LMaasGeesteranus1969)Dye&Kemp1977，Corynebacterium月accumfncienssubsp．oortii(Saaltink＆MaasGeesteranus1969)Carlson＆Vidaver1982，Coryne6ncfP““moortiiSaaltink＆MaasGeesteranus1969。病害英文名：tulipbacterialcanker，tulipyellowpustule。属原核生物界Procaryotes，厚壁菌门Firmicutes，厚壁细菌纲Firmibacteria，短小杆菌属Curtobac—terium。该病菌随带病球茎调运远距离传播。带病球茎通过无性繁育将该病菌传播给子球。植株问通过带菌病叶扩散传播。郁金香黄色疱斑病菌其他信息参见附录A。4方法原理从病部样品中分离病菌并纯化，然后通过革兰氏染色、生理生化测定进行该病原细菌的鉴定。郁金香黄色疱斑病菌的寄主范围、病害症状特征、生物学特性、生理生化特性(参见附录A和附录B)是该病菌的检疫鉴定依据。5仪器、设备生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、八道移液器，BIOLOG细菌自动鉴定系统。6试剂和培养基无水乙醇、微量发酵管、革兰氏染色液。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28106--2011523培养基：蛋白胨8g，酵母粉4g，硫酸镁(MgSO。·7H。O)0．3g，蔗糖(c，zH：：O。。)10g，磷酸氢二钾(K2HPO。)2g，琼脂18g，水(H：0)1000mL。调整pH值至7．o～7．1，121℃湿热灭菌20rain。BUG培养基。7对照菌株已知标准菌株作阳性对照菌。选用本属不同种的菌株作为阴性对照菌。8检测鉴定8．1现场检测按照SN／T2122的规定进行检疫并抽取样品。若发现郁金香病株矮化，叶片出现银灰色斑，上下表皮开裂，茎杆内部变黄，球茎最外层鳞片上出现白色斑，在球茎储藏后期病斑隆起变黄(参见A．3)，应取样带回实验室做病菌分离鉴定。8．2病原菌分离取带病样品，用脱脂棉蘸取75％乙醇擦拭表面，晾干或用灭菌水冲洗3次。切取病健交界部位组织置于灭菌的培养皿中加少量灭菌生理盐水，用玻棒碾碎，用接种环蘸取悬液在523培养基平板上进行划线分离。每个样品接种不少于3个平板。接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h～72h，检查出现的菌落情况。8．3分离菌的纯化观察523培养基平板上产生的菌落，有黄色、有光泽、圆形、边缘整齐、直径1mm～1．5mm的菌落为可疑菌落。挑取单个可疑菌落，在523培养基平板上划线，接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h～72h。一般连续转接2次～3次可得到纯化的分离菌。8．4革兰氏染色按GB／T4789．282003中2．2规定的方法进行。8．5生理生化测定从郁金香上分离纯化的细菌经过革兰氏染色测定后，若分离菌为革兰氏染色阳性菌，则结合实验条件任选下列一种方法对分离菌进行生理生化测定：——应用B10LOG细菌自动鉴定系统对分离菌进行生理生化测定。按照BIOLOG细菌自动鉴定系统规定的操作方法进行，鉴定结果为Curtobacterium刀accumfaciens，则判定该分离菌的BIOLOG鉴定结果为阳性；——应用微量发酵管对分离菌进行生理生化测定。测定结果与表B．1结果一致，则生理生化测定结果为阳性。否则生理生化测定结果为阴性。9结果评定从郁金香上进行细菌分离纯化，若分离菌经过革兰氏染色为阴性菌，则判定检测结果为样品不带郁金香黄色疱斑病菌。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28106—2011从郁金香上进行细菌分离纯化，分离菌经过革兰氏染色为阳性菌，BIOLOG鉴定结果为阳性，或用微量发酵管进行生理生化测定其结果为阳性，则判定检验样品带有郁金香黄色疱斑病菌。否则判定检验样品不带郁金香黄色疱斑病菌。10菌株和样品的保存分离并鉴定为郁金香黄色疱斑病菌的菌株应转接到523培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低温冰箱中保存，定期转接，以防止病菌死亡；必要时冻干后长期保存。检出郁金香黄色疱斑病菌的样品至少保存6个月；保存期满后，需经灭菌处理。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28106—2011A．1分布附录A(资料性附录)郁金香黄色疱斑病菌其他信息丹麦、荷兰、罗马尼亚、英国、日本、韩国，在我国台湾和杭州有报道。A．2寄主范围郁金香(Tulipgesneriana)。A．3危害症状郁金香黄色疱斑病菌能系统性侵染郁金香，引起郁金香维管束病害，造成郁金香植株叶斑和郁金香球茎黄色疱斑。感染郁金香黄色疱斑病菌的郁金香病株严重时可出现矮化症状，叶片出现银灰色斑，上下表皮开裂，茎杆内部变黄，郁金香球茎最外层鳞片上出现白色斑，在球茎储藏后期病斑隆起变黄。在春季温度低时易于发病。A．4生物学特性菌体杆状，大小(o．4pm～o．6pm)×(0．6,um～3．0pm)；周生鞭毛，革兰氏染色阳性，最适生长温度为25℃～30℃。能水解酪蛋白，能利用乳酸、苹果酸、葡萄糖酸、醋酸盐，不能利用阿拉伯糖、山梨糖、蔗糖、丙酸、甲酸盐。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载附录B(规范性附录)郁金香黄色疱斑病菌的生理生化特性表B．1郁金香黄色疱斑病菌的生理生化特性GB／T28106—2011Curtobacteri“mC．卫accumfaciens项目flaccumfaciensC．albid“研C．citreumC．1uteumC．ptantarumepusillumpv．batae酪蛋白水解+树胶醛糖产酸+Wd+W山梨糖产酸+W蔗糖产酸+W乳酸同化+ND+苹果酸同化+上-_d+葡萄糖酸屑化+醋酸盐利用+注：+；90“以上菌株为阳性；一：90％以上菌株为阴性；d：11％～89％菌株为阳性；w：弱反应；ND：未测定。'