铜胁迫下麻疯树的生理响应研究毕业论文.doc 16页

'铜胁迫下麻疯树的生理响应研究毕业论文目录1.前言………………………………………………………………………………...12.材料与方法…………..…..………………………………………………….……..32.1材料…………………..….…………..……………..………………..……………32.1.1植株种子……………….……………....…………………………………….....32.1.2实验仪器…………………………...…..…………………………………...…..32.1.3实验药品…………..………………………………..…………………………..32.1.4培养液及培养基质…………………………..………..…………………..……32.2方法……………………………………………..……..…………………….……42.2.1种子的萌发实验………………………………..……..………………..………42.2.2幼苗前期培养…………………………………..………..……………..………42.2.3铜离子胁迫培养……………………………………..…..……………..………42.2.4指标测定……………………………………………..…..………..……………43.结果与分析………………………………………..………..………..……………63.1铜离子对麻疯树幼苗外部形态的影响…………….……..…..…………………63.1.1铜离子对麻疯树幼苗茎围生长的影响……………..…………....……………63.1.2铜离子对麻疯树幼苗株高生长的影响………………..………………………63.1.3铜离子对麻疯树幼苗叶片生长的影响………..…………………….………...63.2铜离子对麻疯树幼苗生理生化的影响………………………..…..……….……73.2.1铜离子对麻疯树幼苗丙二醛（MDA）的影响……………...………….………73.2.2铜离子对麻疯树幼苗叶绿素a、b、总叶绿素的影响………….………….…73.2.3铜离子对麻疯树幼苗可溶性糖的影响…………..……………………………84.讨论………………………………………………………………….……….…….95.结论……………………………………………………………………….………11参考文献……………………………………………………………………………12致谢…………………………………………………………………………………14 红河学院本科毕业论文(设计)1.前言重金属污染,实际上主要涉及汞、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属,也指具有一定毒性的一般重金属如锌、铜、钴、镍、锡等。而随着矿质资源的开发与利用，大量的重金属元素被释放进入环境，对土壤、水体造成污染。土壤重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性的特点，并通过接触、食物链等途径直接或间接危害人类健康，轻则发生怪病（水俣病、骨痛病等），重者就会死亡等。如铜：土壤中的铜通过物理或化学和生物变化，成为不同形态的铜，影响土壤的正常功能。当人体铜摄入量不足时可引起缺乏病，但摄入过量却又可能造成中毒，包括急性铜中毒、肝豆状核变性、儿童肝内胆汁淤积等病症。明显降低植物的生物产量和经济产量[1-3]。鉴于重金属的危害，许多科学家积极研究治理土壤重金属污染的方法和途径：(1)改变重金属在土壤中的存在形态,使其固定，降低其在环境中的迁移性和生物可利用性，如：石灰，腐殖质，有机质；(2)从土壤中去除重金属,使其存留浓度接近或达到背景值。围绕这两种治理途径,已提出相应地物理、化学和生物的治理方法。如：翻土、热处理、电渗、吸附法、土壤淋洗等。生物修复法是近几年发展起来的，有微生物和植物两部分。由于不同作物种类或品种对重金属的吸收能力可以相差10～10000倍。因此，在污染土壤的改良和利用方面，筛选出对重金属有较高吸收率的植物，利用植物对重金属的超富集作用，是一种较便宜且方便的作法。利用植物吸收重金属减少环境污染，一些植物对重金属有较高的吸收率，连续多年种植可减少土壤中重金属的含量，但关键是发现合适的植物。而国内外已见报道的重金属超富集植物已有480多种，得到广泛认同的Cu超富集植物只有四十左右种[4]。在国外，Ebbs等在1997年研究发现，印度芥菜是一种很有潜力的特别适合Zn、Cd、Cu、Pb中等污染土壤修复的植物；而Baker等发现，他们的盆栽试验也证明该植物有很强的吸收、转运和积累Zn、Cd能力等等；在国内，束文圣[5]等2001年在湖北铜绿山调查发现鸭跖草是Cu的超富集植物。其它还有典型的有酸模、海州香薷等等。李君[6]等研究Cu、Pb污染土壤对马蹄金叶片的生理指标影响效果不明显。但是，对于能源植物在铜污染土壤中的修复能力研究鲜有报道，仅见王国庆[7]等研究红麻在水培营养液中对Cu的吸收和富集效应，发现红麻有可能实现对轻度Cu污染土壤的植物稳定和吸取修复。铜对能源植物麻疯树1 红河学院本科毕业论文(设计)胁迫的生理研究还未见报道。麻疯树（JatrophacurcasL.），又名小桐子、膏桐等，为大戟科，麻风树属。属多年木生本油料植物。近些年又发现其种子含油量高，是制造生物柴油的首选，是世界公认的生物能源树。现在是国际上研究最多的能生产生物柴油的能源植物之一。而能源植物是经专门种植，含糖类(碳氢化合物)较高，用于提供能源原料的草本和木本植物。如：续随子、绿玉树、麻疯树、西谷椰子、红麻、巴西橡胶树等。因此，研究能源植物麻疯树在重金属铜环境中的生长生存情况，对于麻疯树在重金属铜污染地区改善土壤环境，增加经济价值有重要意义。本文通过麻疯树幼苗铜胁迫模拟试验，探索麻疯树在铜胁迫环境中的生长情况，对其形态及生理进行研究，为减少重金属的危害，解决重金属污染找到更有效的植物，为生物能源植物在矿区中进行污染修复提供一定参考依据。1 红河学院本科毕业论文(设计)2.材料与方法2.1材料2.1.1植株种子麻疯树种子：江苏沐阳种子发展公司。2.1.2实验仪器电热恒温鼓风干燥箱（DHG—9246A，上海精宏实验设备有限公司），电热恒温培养箱（DNP—9082型，上海精宏实验设备有限公司），实验室PH计（FE20/EL20，梅特勒-托利多仪器上海有限公司），恒温水浴锅（国华电器有限公司），分光光度计（WFJ722型，龙尼柯上海仪器有限公司），超低温离心机（EppendrofCentrifuge5810R,Germany)，电子天平（PL202-S型，梅特勒-托利多仪器上海有限公司），游标卡尺（桂林量具刃具厂）。2.1.3实验药品　硫酸铜（CuSO4）；四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）；硝酸钾（KNO3）；硝酸铵(NH4NO3)；磷酸二氢钾（KH2PO4）；硫酸镁（MgSO4/MgSO4·7H2O）；七水硫酸亚铁（FeSO4·7H2O)；三氯乙酸（C2HCl3O2）；乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8·2H2O）；硫代巴比妥酸（C4H4N2O2S）；碘化钾KI；硼酸（H3BO3）；硫酸锰（MnSO4）；硫酸锌（ZnSO4·7H2O）；钼酸钠（Na2MoO4）；硫酸铜（CuSO4）；氯化钴（CoCl2·6H2O）；葡萄糖（C6H12O6）；浓硫酸（H2SO4）；蒽酮（C14H10O）；无水乙醇（C2H6O）；丙酮（C3H6O）。2.1.4培养液及培养基质完全培养液采用霍格兰培养液。配制方法如下：硝酸钾（KNO3）506mg/L，四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）945mg/L，硝酸铵(NH4NO3)80mg/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）136mg/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O），493mg/L，铁盐溶液2.5ml，微量元素液5ml，pH=6.0。铁盐溶液：七水硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）2.78g，乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8·2H2O）3.73g，蒸馏水500ml，pH=5.5。微量元素液：碘化钾（KI）0.83mg/l，硼酸（H3BO3）6.2mg/L，硫酸锰（MnSO4）22.3mg/L，硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.6mg/L，钼酸钠（Na2MoO4）13 红河学院本科毕业论文(设计)0.25mg/L，硫酸铜（CuSO4）0.025mg/L，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.025mg/L。铜离子溶液用硫酸铜来配置。种子培养基质为（草炭：珍珠岩=3:2），种子萌发后移植到培养袋，基质为经过粗筛的黄土。2.2方法2.2.1种子的萌发实验挑选外观饱满、没有发霉的种子，种植到基质为（草炭：珍珠岩=3:2）的育苗盘中待萌发，浇足水。一星期之后每天浇水，四天后第一株种子萌芽，两周后左右全部萌芽[8]。2.2.2幼苗的前期培养挑选生长良好的麻疯树幼苗，移植到培养袋中。培养基质为黄土。对所有幼苗进行完全培养液浇灌，四天后再次进行浇灌培养。对幼苗进行泼浇多菌灵，灭除菌害，液体为1:1000。2.2.3铜离子胁迫培养待麻疯树幼苗生长稳定后，挑选长势相似的幼苗分组进行重金属铜胁迫培养。将挑选出来的麻疯树幼苗分为六组，每组十株，以后进行铜离子的胁迫培养，重复3次试验。铜胁迫梯度设置：0、10、20、50、100、150（mg/L）。2.2.4指标测定2.2.4.1外部形态指标的测定各外部形态指标（茎围，株高，叶片长×宽）在进行铜胁迫培养的60天内，每隔20天对麻疯树幼苗进行外部形态指标（茎围、株高、叶片长×宽）的测量。茎围的测量部位为土壤以上2厘米处，株高的测量部位为土壤以上部分到顶芽的高度，叶片则测量各植株的同侧上部叶。2.2.4.2生理生化指标的测定各生理生化指标测定分为春、秋两季两次采样，秋季采样：分组胁迫的60天之后；春季采样：停止胁迫120天再次胁迫30天后。丙二醛的测定分别称取各个胁迫组的麻疯树13 红河学院本科毕业论文(设计)叶片1g，加入少许石英砂和2mL10%TCA（10%三氯乙酸），研磨成匀浆再加3mL10%三氯乙酸进一步研磨，匀浆在4000r离心10min，上清液为MDA提取液，采用硫代巴比妥酸法进行显色反应，之后进行分光光度测定在532nm和450nm下的OD值，重复三次测定。并根据公式计算幼苗植株中MDA含量[9]。叶绿素的测定采用浸提法，分别随机取各个胁迫组的麻疯树叶片洗净晾干之后称取0.2克，剪碎放到25ml的容量瓶中，加入丙酮-乙醇混合液（体积比1:1）定容，之后放入恒温箱中在40℃下浸提24小时，之后取出进行分光光度测定在645nm和663nm下的OD值，重复三次测定。并根据公式计算出幼苗叶片中的叶绿素的含量[10]。可溶性糖含量测定取各胁迫组的麻疯树叶片，洗净晾干，之后在110℃烘箱烘15min，然后调至70℃过夜。干叶片磨碎后称取50mg样品倒入10ml刻度离心管内，加入4ml80%酒精，置于80℃水浴中不断搅拌40min，离心，收集上清液，其残渣加2ml80%酒精重复提取2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80℃脱色30min，定容至10ml，过滤后，取提取液1ml，加入5ml蒽酮试剂混合，沸水浴煮10min，取出冷却。在625nm处测其OD，重复三次测定。从标准曲线上得到提取液中糖的含量[9]。13 红河学院本科毕业论文(设计)3.结果与分析3.1铜离子胁迫对麻疯树幼苗外部形态的影响3.1.1铜离子胁迫对麻疯树幼苗茎围生长的影响从表1中可看出，在铜胁迫麻疯树幼苗后的0天到20天、40天到60天，处理组的茎围变化量均低于对照组，而对照组在40天到60天增长0.202cm，大于20天到40天增长的0.151cm。在20天到40天左右处理组增长又高于对照组。总体上是随着铜离子含量的增加茎围生长变慢。而在同一胁迫浓度下，增长逐渐缓慢，胁迫组较之对照组增长趋势变慢更明显。说明，经铜离子胁迫培养后，对麻疯树幼苗的茎围生长有抑制，时间越长，影响越明显，随着铜离子浓度的增加，麻疯树幼苗茎围生长趋势相对变慢。表1铜离子对麻疯树幼苗茎围的影响Cu2+浓度（mg/L）每20天茎围的生长变化情况（cm）0—20天20—40天40—60天00.3360.1510.202100.3200.1630.096200.3290.1990.139500.3180.1730.0621000.2720.1480.0571500.2450.1340.0573.1.2铜离子胁迫对麻疯树幼苗株高生长的影响由表2可以看出，经铜离子胁迫培养后的麻疯树幼苗，在5种不同铜浓度处理下，处理组与对照相比都受到了明显的抑制，株高都有不同程度的下降，且随着胁迫时间的增加，麻疯树幼苗的株高处理组较之对照组增长逐渐变慢。而随着铜离子浓度的增加，株高的生长变化没有明显变化规律。表2Cu2+胁迫对麻疯树幼苗株高的影响Cu2+浓度（mg/L）每20天株高的生长变化情况（cm）0—20天20—40天40—60天02.8131.1570.610101.4570.9600.313201.0470.5230.453501.4570.8200.2531001.9270.8030.2101502.2200.9730.2373.1.3铜离子胁迫对麻疯树幼苗叶片的生长影响从表3中可看出，从中可以看出，经铜离子胁迫后的麻疯树幼苗，在前4013 红河学院本科毕业论文(设计)天内，各处理组与对照组间麻疯树幼苗叶面积没有明显差异，但40天到60天之中，变化情况比较明显，处理组的叶片增加量较低，而对照组叶片增加量依旧较大。而在各铜离子胁迫组季节性落叶比对照组的提前了15天左右。Cu2+150mg/L胁迫培养的麻疯树幼苗落叶最多，变化最为明显。表3铜离子胁迫对麻疯树幼苗叶面积的影响Cu2+浓度（mg/L）叶片（长×宽）的生长变化情况（cm2）0—20天20—40天40—60天00.33×0.120.12×0.180.75×0.44100.44×1.350.33×1.260.01×0.32200.49×1.480.04×1.370.20×0.39500.34×1.020.02×1.180.12×0.191000.18×1.210.35×0.990.04×0.191500.14×0.610.39×0.960.25×0.353.2铜离子胁迫对麻疯树幼苗生理生化的影响3.2.1铜离子胁迫对麻疯树幼苗中丙二醛（MDA）含量的影响从图1中可看出，胁迫组叶片中丙二醛含量随着铜离子浓度增加，在秋季呈现递增的趋势，而春季除在铜离子20mg/L胁迫组之外，也呈现递增趋势。且均比对照组的高，说明随着铜离子浓度的增加，铜离子对麻疯树幼苗的细胞伤害越来越大。而春、秋两季比较，春季各组分丙二醛含量比较低，但在铜离子10mg/L时春季大于秋季。；丙二醛在铜离子浓度150mg/L时，是整个组的最高值，春季丙二醛含量最高值是对照组的1.7倍，秋季最高值是对照组的1.8倍。图1铜离子对春、秋两季麻疯树幼苗丙二醛含量的影响3.2.2铜离子胁迫对麻疯树幼苗中叶绿素a、b、总叶绿素含量的影响从Cu处理后叶片的叶绿素含量动态变化中可以看出,不论是春季还是秋季，胁迫组叶绿素a、b、叶绿素总量全部低于对照组，这一结果说明铜离子会抑制13 红河学院本科毕业论文(设计)麻疯树幼苗中叶绿素的合成，从而降低光合作用，限制麻疯树幼苗的生长。且随着铜离子浓度的增加，胁迫增强，叶绿素a、b、叶绿素总量大体上呈下降趋势。再从春、秋两季的对比中可以看出，春季中叶片的叶绿素含量明显大于秋季，春季麻疯树幼苗生长较旺盛，铜离子在春季的影响较之秋季差别较大。在春季在受胁迫组的叶绿素含量最低值有对照组的69.9%；而秋季只有对照组的40.3%。春季光合作用强度较大（图2）。图2铜离子对春、秋两季麻疯树幼苗叶绿素a、b叶绿素总含量的影响3.2.3铜离子对麻疯树幼苗中可溶性糖的影响从图3中可看出，经铜离子胁迫培养后的麻疯树幼苗，叶片中可溶性糖含量均比对照组的低。就春、秋两季叶片中的可溶性糖相比较，大体上春季中明显多于秋季。这说明铜离子影响了叶片中可溶性糖的合成，而春季中植株生命相对旺盛，铜离子胁迫相对较弱。图3铜离子对春、秋两季麻疯树幼苗可溶性糖含量的影响13 红河学院本科毕业论文(设计)4.讨论麻疯树的茎围、株高、叶面积是外部形态的重要观测指标，直观的反映了植株的长势情况。试验中，各处理组茎围总体上是随着铜离子含量的增加生长变慢。在同一胁迫浓度下，随着胁迫时间延长，生长逐渐缓慢。说明经铜离子胁迫培养后，麻疯树幼苗的茎围生长受到抑制，时间越长，影响越明显，随着铜离子浓度的增加，麻疯树幼苗茎围生长趋势变慢。在5种不同铜浓度处理下，株高都有不同程度的下降，且随着胁迫时间的增加，麻疯树幼苗的株高较之对照组增长逐渐变慢。说明铜胁迫对麻疯树幼苗的株高生长有抑制作用。这与周宏利[11]等所做铜胁迫对蔬菜幼苗株高的影响结果相似。经铜离子胁迫处理后，麻疯树幼苗叶片的生长与对照组相比均无明显差异，而在150mg/L的铜离子胁迫培养下对麻疯树幼苗叶片的生长影响较大。处理组与对照组相比，叶片的落叶期明显提前15天左右，而长出新叶的时间晚了20天左右。这可能是铜胁迫造成植株生长不良，养分输送受阻；也可能是铜离子使植株抗逆性减弱，而植株根据自己的需要提高自身抗性的行为。丙二醛(MDA)的积累来自不饱和脂肪酸的降解,它的生成是植物体内自由基引发而产生的,MDA的积累能够反映植物体内自由基的活动状态。因此,在植物逆境生理研究中,MDA被普遍地作为一种表示伤害的指标[12]。试验结果表明：胁迫组叶片中丙二醛含量随着铜离子浓度增加，在秋季呈现递增的趋势，而春季除铜离子20mg/L胁迫组之外，也呈现递增趋势，且均比对照组的高；春、秋两季所得数据比较，同一浓度下，春季麻疯树幼苗的叶片中丙二醛含量较低。说明随着铜离子浓度的增加，铜离子对麻疯树幼苗的细胞伤害越来越大。而春、秋两季比较，春季各组分丙二醛含量对较低，但铜离子在10mg/L时麻疯树幼苗的丙二醛含量春季大于秋季。丙二醛含量在铜离子浓度150mg/L时，是整个组的最高值，春季丙二醛含量最高值是对照组的1.7倍，秋季最高值是对照组的1.8倍。李淑艳[13]等在重金属铜、锌胁迫对黄瓜种子萌发及幼苗生长的影响一文中的重金属铜、锌胁迫对黄瓜幼苗丙二醛（MDA）含量的影响也得到类似结论。叶绿素含量是测定植物光合作用的重要指标之一。本次试验，不论是春季还是秋季，胁迫组叶绿素a、b、叶绿素总量全部较对照组低，且随着铜离子浓度的增加，胁迫增强，叶绿素a、b、叶绿素总量大体上呈下降趋势。这与刁丰秋[14]13 红河学院本科毕业论文(设计)等得出的结果相似。王广林[15]等研究的铜、铅胁迫丁香蓼中的胁迫组叶绿素含量也全部低于对照组。原因可能在于吸收的铜离子作用于叶绿素生物合成途径的几种酶的肽链结构,从而抑制酶的活性,阻碍叶绿素的合成。再从春、秋两季的对比中可以看出，春季中叶片的叶绿素含量明显大于秋季，春季麻疯树幼苗生长较旺盛，铜离子在春季的影响较之秋季差别较大。在春季在处理组的叶绿素含量最低值为对照组的69.9%；而秋季只有对照组的40.3%。说明春季植株光合作用相对较强。结果证明：铜离子会抑制麻疯树幼苗中叶绿素的合成，降低光合作用，限制麻疯树幼苗的正常生长。铜离子胁迫后的麻疯树幼苗体内的可溶性糖与对照组相比，含量均低于对照组。春、两季比较，同一浓度下，春季植株叶片中可溶性糖含量普遍大于秋季植株叶片内的内可溶性糖含量。可能由于受到春、秋两季气候影响了植株的正常生长。所以说，铜离子影响了麻疯树幼苗叶片中可溶性糖的产生，影响了植株的正常生长代谢。王卫红[3]等在赤红壤施用CuZn对菜心生长和吸收CuZn的影响中也得到相似的结果。结果证明：铜离子胁迫后的麻疯树幼苗体内的可溶性糖的合成均受到了不同程度的抑制。13 红河学院本科毕业论文(设计)5.结论本次试验表明，铜胁迫对麻疯树幼苗的生长株高、茎围、均产生了不同程度的抑制，长时间的铜胁迫培养下，叶片增长缓慢，植株的生长发育有所影响。铜胁迫影响了麻疯树幼苗的叶绿素、可溶性糖合成，使之含量降低；且随着铜离子浓度的增加，丙二醛的含量也随之增大，使麻疯树幼苗的抗逆性变弱。在生长旺盛季节，铜离子对麻疯树幼苗的毒害相对较弱。通过试验记录所知，受胁迫的植株相对正常植株落叶较早（15天左右），而长新叶又相对较迟（20天左右）。综上所述，预测在铜污染土壤上种植麻疯树，可望实现麻疯树在铜污染地区的大面积栽培利用，以及对铜污染土壤的吸取修复。减少矿区的重金属含量，改善矿区的环境，增加矿区经济价值。13 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红河学院本科毕业论文(设计)致　谢在本次毕业论文实践过程中，首先感谢我的导师，李河老师。李老师在试验之前，认真的讲解毕业论文相关的知识、要点。使我对于毕业论文有了深刻并详细的认识。在实验方案的确立时，给予指导和建议、意见。实验过程中，李老师亲自指导种子的选育、基质的选择等方面。在实验药品的制备，仪器的使用也进行和指导和帮助。并时常督促和监督，严格按着实验室的操作制度，积极地纠正我们的错误，使我们的实验越来越完善、顺畅。在每次遇到问题时老师不辞辛苦的讲解才使得我的论文设计顺利的进行。论文实践过程中花费了李老师和其他老师很多的宝贵时间和精力，在此向老师们表示衷心地感谢！李老师一丝不苟的工作作风、诲人不倦的师者风范和敏锐的科学洞察力给我留下了极为深刻的印象，深深地感染着我，并始终影响和激励着本人开展论文实践工作。李老师严谨的治学态度，开拓进取的精神和高度的责任心都将使学生受益终生！还要感谢和我同一设计小组的几位同学，是你们在我平时设计中和我一起探讨问题，并指出我操作上的失误，使我能及时的发现问题把设计顺利的进行下去。在实验室的这段日子，又结识了很多的可敬可爱的师长，他们都给我留下了很深的印象。最后，感谢所有关心、支持和帮助过我的师长、朋友们！2011年6月13'