DBS22020-2013食品安全地方标准动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法.pdf 7页

'DBS22吉林省地方标准DBS22/020—2013食品安全地方标准动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法2013-12-31发布2013-12-31实施吉林省卫生和计划生育委员会发布 DBS22/020—2013前言本标准的附录A是资料性附录。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准起草人：邵洪泽、王楠、苏双、石春军、刘芳、邢国明、李文东、程荣华、蒋云岩、白翠、许尧、李佳桐。I DBS22/020—2013吉林省食品安全地方标准动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法1警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围本标准适用于肉、蛋、奶等动物源性食品中沙门菌的筛选检测。3规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测4技术概要根据沙门菌属特有的靶序列肠毒素基因序列，设计2对特殊的内、外引物（内引物FIP与BIP，外引物F3与B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，为增加反应速度，还设计1对环引物（LF与LB）。利用Bst酶启动循环链置换反应，在肠毒素基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形2+成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。5引物与试剂5.1特异性引物根据沙门菌的肠毒素基因，设计LAMP检测引物，序列见表1。1 DBS22/020—2013表1特异性引物浓度及序列引物种类引物名称核苷酸序列F35"-CCTTTCCCGCTATCGGTAAC-3"外引物B35"-GGATGCCCAAAGCAGAGAG-3"FIP5"-GGCCGCCAGGGAACGATTAG-TGATGATAACGCGGTCGGT-3"内引物BIP5"-TTCAACAGCACCTGAGTCAGCC-TTCACGGCGAATGAGACG-3"LF5"-CGTAGAGGCAAAAGAAAGTGGG-3"环引物LB5"-TGTCCGGGTCAGCCTGA-3"5.2试剂5.2.1增菌液——缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液，见GB4789.4—2010中A.1。——四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，见GB4789.4—2010中A.2。——亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液，见GB4789.4—2010中A.3。5.2.2LAMP试剂——10×BstDNA聚合酶缓冲液（200mmol/LTris-HCl，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1%Triton-100，pH8.8，25℃）；——25mmol/LMgCl2；——10mmol/LdNTP混合物；——8U/μLBstDNA聚合酶；——5mol/LBetaine；——灭菌双蒸水。5.2.3其他试剂——SYBRGreenI染料，1000×。6仪器6.1生物安全柜；6.2高速离心机：5000r/min-16000r/min；6.3水浴锅：65±1℃，100℃±1℃；6.4微量加样器：量程1µL-20µL；量程200µL-1000µL；6.5细菌培养用仪器：见GB4789.4—2010。7操作程序7.1样品前处理按GB4789.4—2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验中5.1操作。2 DBS22/020—20137.2增菌培养按GB4789.4—2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验中5.2操作。7.3DNA模板的制备取1mL增菌液放入1.5毫升EP管中，10000r/min离心2min，去上清；加入灭菌生理盐水1mL混匀，10000r/min离心2min，去上清；然后加灭菌双蒸水1mL混匀，置100℃煮沸5min，10000r/min离心2min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。7.4阴性及阳性对照7.4.1阴性对照灭菌双蒸水代替模板，作阴性对照。7.4.2阳性对照沙门菌标准菌株的DNA或含目的片段的DNA，作阳性对照。7.5LAMP检测方法7.5.1反应体系——10×BstDNA聚合酶缓冲液2.5µL——引物1.0µL——25mmol/LMgCl26.0µL——10mmol/LdNTP混合物3.5µL——8U/μLBstDNA聚合酶1.0μL——5mol/LBetaine4.0μL——模板1.0µL——灭菌双蒸水6.0µL，总体积为25µL。引物终浓度FIP和BIP为0.8μmol/L，F3和B3为0.1μmol/L，LF和LB为0.4μmol/L。7.5.2反应程序将反应管混匀，置65℃扩增40min。8结果观察8.1眼观沉淀将反应管12000r/min，离心1min，观察管底白色沉淀。有沉淀者为阳性，无沉淀者为阴性。8.2眼观颜色如上述沉淀现象不明显，无法作出判断时，可在反应管加入1000×SYBRGreenI染料lμL，轻轻混匀，观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。也可在反应管中加入染料直接观察。9结果判定3 DBS22/020—2013在阴性对照、阳性对照符合时，判定样品检测结果。根据8.1和8.2结果，判定样品中沙门菌初筛检测结果。实验结果图示见附录A。10防止污染的措施10.1检测过程中严格分区操作，需符合GB/T27403-2008的要求，以防止核酸的交叉污染。10.2检测废弃物需符合GB19489的要求，经高压灭菌等无害化处理。10.3实验前后，实验室用紫外线消毒。4 DBS22/020—2013附录A（资料性附录）LAMP结果示图A.1LAMP检测结果示图图A.1LAMP检测方法白色沉淀图1．阴性对照（-）；2．阳性样品（+）；3．阳性对照（+）；图A.2LAMP检测方法染料染色图1．阴性对照（-）；2．阳性样品（+）；3．阳性对照（+）；BA_________________________________5'