DBS22027-2014食品安全地方标准食品中肠球菌的定性定量检验.pdf 14页

'DBS22吉林省地方标准DBS22/027—2014食品安全地方标准食品中肠球菌的定性定量检验2014-07-30发布2014-08-30实施吉林省卫生和计划生育委员会发布 DBS22/027—2014吉林省食品安全地方标准食品中肠球菌的定性定量检验1范围本标准规定了食品中肠球菌（Enterococcus）的检验方法。本标准适用于食品中肠球菌的定性定量检验。2术语和定义肠球菌（Enterococcus）一类革兰氏阳性球菌，兼性厌氧，无芽胞和荚膜，可分解胆汁七叶苷。是评估食品、水、食品加工设备、食品生产环境等卫生状况的指标菌之一。3设备与材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：3.1冰箱：0℃～4℃。3.2恒温培养箱：36℃±2℃、45℃±2℃。3.3显微镜：10×～100×。3.4全自动细菌生化鉴定系统。3.5均质器。3.6过滤装置：抽滤瓶、真空泵和耐高温处理的过滤器。3.7天平：感量0.1g。3.8酒精灯和接种环。3.9无菌剪刀、勺子、镊子。3.10无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。3.11滤膜：直径47mm,微孔径0.45mm±0.02mm。3.12无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm及相应的试管架。3.13无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL具0.1mL刻度）。3.14无菌锥形瓶:容量500mL。3.15无菌培养皿：直径90mm。4培养基和试剂4.1叠氮化钠葡萄糖肉汤:按附录中A.1。4.2肠球菌肉汤:按附录中A.2。4.3KF链球菌琼脂:按附录中A.3。4.4肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）:按附录中A.4。4.5胆汁七叶苷琼脂（BEA琼脂）:按附录中A.5。4.6脑心浸液肉汤(BHIB):按附录中A.6。1 DBS22/027—20144.7含6.5%氯化钠脑心浸液肉汤:按附录中A.7。4.7.1脑心浸液琼脂(BHIA):按附录中A.8。4.7.2过氧化氢酶试验：按附录中A.9。4.7.3革兰氏染色液按附录中A.10。4.7.4VitekGNI＋全自动微生物生化鉴定系统测试卡或API20strep试剂条。（由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标本的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。）第一法平板计数法5平板计数法实验原理应用倾注法，根据样液在选择性肠球菌琼脂（36℃±2℃培养18h～24h）或KF琼脂（36℃±2℃培养24h～48h）上生长的典型菌落数，经确证实验证实为肠球菌的菌落数可换算为每克或每毫升样本中肠球菌数。此方法适用与未经加工处理的生鲜食品或污染情况可能较重的水和食品。6平板计数法检验程序平板计数法检验程序如图1：检样25g(mL)样品＋225mL生理盐水，均质10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度，各取1mL分别加入肠球菌琼脂或KF琼脂36℃±2℃24h～48h确证实验菌落观察染色镜检生化实验或Vitek或API计数并报告结果图1肠球菌平板计数法检验程序7平板计数法操作步骤2 DBS22/027—20147.1样品保存采样后应尽快进行检验，若不能及时检验，应放于﹣18℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应冷藏保存的待检样品在运送实验室后应1℃～4℃冰箱保存。样品采集后8h内要完成检验。7.2样品处理7.2.1固态样品：以无菌操作称取25g检样，放入含有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋或灭菌乳钵中，使用旋转刀片式均质器均质(800～1000r/min)2min或拍击式均质器均质2min或充分研磨做成1:10稀释液。7.2.2液态样品：以无菌操作量取25mL检样，放入含有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋中，振荡混匀。7.2.3样品稀释：取1:10稀释液1mL加到含有9mL无菌生理盐水的稀释瓶中,充分混匀制成1:100的稀释液。根据对样品的污染状况的估计,依次制成十倍递增稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。7.3定量检测7.3.1接种和培养根据样品的污染程度估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度的稀释液各1mL加入无菌培养皿内,每个稀释度做2个平皿。把融化45℃±1℃的肠球菌琼脂或KF琼脂12mL～15mL倾入培养皿内，转动平板充分混合，水平放置，使琼脂凝固。可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层肠球菌琼脂或KF琼脂（约4mL），凝固后翻转平板。肠球菌琼脂置于36℃±2℃培养18h～24h；KF平板置于36℃±2℃培养24h～48h。同时分别取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。7.3.2典型菌落观察在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐，用无菌接种针从每个肠球菌琼脂平板或KF平板挑取5个典型菌落，进一步做确证实验。7.3.3革兰氏染色镜检在肠球菌琼脂平板或KF平板上挑取典型菌落作革兰氏染色镜检，鉴定为革兰氏阳性球菌。7.3.4确证实验7.3.4.1纯培养将肠球菌琼脂平板或KF平板上的革兰氏阳性球菌的典型菌落分别接种到脑心浸液肉汤（BHIB）和葡萄糖琼脂斜面或脑心浸液琼脂（BHIA）斜面。BHIB肉汤置于36℃±2℃培养24h,葡萄糖琼脂斜面和BHIA斜面置于36℃±2℃培养24h～48h。7.3.4.2生化实验将培养后的BHIB肉汤或斜面分别接种到胆汁七叶苷琼脂（BEA）平板和含6.5%氯化钠的BHIB肉汤，置于36℃±2℃培养24h～48h，观察细菌生长情况。如果BEA平板上生长并水解七叶苷（形成黑色或棕色沉淀），6.5%氯化钠的BHIB肉汤中36℃±2℃培养24h～48h生长良好，则可确证为肠球菌。也可以采用API试剂条或Vitek鉴定试卡进行生化鉴定。8平板计数法结果计算3 DBS22/027—2014选择有典型肠球菌菌落的平板，且同一稀释度2个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU之间，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度的平板菌落数在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b)所有稀释度的平板菌落数均小于20CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c)某一稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d)若所有稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e)若所有稀释度的平板菌落数均不在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU时，应计数最接近20CFU或200CFU的稀释度平板上的典型菌落。以上情况按公式（1）计算。AB公式（1）：T=……………………………………………………………（1）Cd式中：T——样品中肠球菌菌落数；A——某一稀释度肠球菌典型菌落的总数；B——鉴定结果为肠球菌的菌落数；C——用于肠球菌鉴定的菌落数；d——稀释因子。f）若2个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU～200CFU之间，按公式（2）计算ABAB1122公式（2）：…………………………………………（2）CC12T1.1d式中：T——样品中肠球菌的菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）肠球菌典型菌落的总数；A2——第二稀释度（高稀释倍数）肠球菌典型菌落的总数；B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为肠球菌的菌落数；B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为肠球菌的菌落数；C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于肠球菌鉴定的菌落数；C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于肠球菌鉴定的菌落数；1.1——计算系数（如果第二稀释度肠球菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；d——稀释因子（第一稀释度）。9平板计数法结果报告根据样品的取样量和稀释度，按7中公式计算，报告样品中肠球菌的菌落数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第二法肠球菌的MPN计数法10MPN计数法实验原理4 DBS22/027—2014应用MPN9管法，选择三个适宜的连续稀释度的样液接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤和肠球菌肉汤，进行选择性增菌，经确证实验证明含有肠球菌的对应管计为阳性管，查MPN表，计数并报告每克或每毫升样品中肠球菌的MPN值。此方法适用于污染程度较低的样品。11MPN计数法的检验程序MPN计数法的检验程序见图2检样25g(mL)样品＋225mL生理盐水，均质10倍系列稀释选择3个连续的适宜稀释度，每个稀释度各取1mL分别接种于3管叠氮化钠葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤，共9管36℃±2℃或45℃±2℃24h～48h变黑或混浊不变黑或无混浊确证实验肠球菌阴性菌落观察染色镜检生化实验或Vitek或API查MPN表报告结果图2肠球菌MPN计数法的检验程序12MPN计数法操作步骤12.1样品保存与处理同6.1和6.2。12.2样品接种与培养根据样品污染情况的估计，选择适宜的3个连续稀释度，每一稀释度分别接种3管叠氮化钠葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤，每管接种1ml样液(如接种样液量超过1ml．则应接种于双料叠氮化钠葡萄糖肉汤活或双料SF肉汤管中)，混匀，共9管。叠氮化钠葡萄糖肉汤置于36℃±1℃培养18h～24h，检查各试管混5 DBS22/027—2014浊情况；肠球菌肉汤置于36℃±1℃培养24h～48h；肉眼观察颜色变为黑色或混浊的试管，表明有肠球菌生长。12.3接种选择性平板对所有呈现混浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤或颜色变为黑色的肠球菌肉汤进行确证试验。用接种环将各管的培养物划线接种于肠球菌琼脂平板或KF琼脂平板。肠球菌琼脂平板置于36℃±1℃培养18h～24h；KF琼脂平板置于36℃±1℃培养24h～48h。12.4典型菌落观察与确证实验肠球菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐。用无菌接种针从每个肠球菌琼脂平板或KF平板至少挑取5个典型菌落。按6.3.3和6.3.4所述做进一步的确证实验。可以采用API试剂条或Vitek试卡进行生化鉴定。13MPN计数法结果计算如一管培养物中所挑取的典型菌落中，有一个确认为肠球菌，则该管应视为阳性。根据样品接种量、稀释倍数以及确证阳性的反应管数，查MPN值表（参见附录B），得出样品中肠球菌最近似值。14MPN计数法结果报告报告样品中肠球菌的MPN值，以MPN/g(mL)表示。第三法肠球菌的滤膜检测法15滤膜检测法实验原理将滤膜置于选择性培养基上增养时，肠球菌菌落呈现特异的颜色。经过肠球菌确证实验之后，计数并计算滤膜上确证肠球菌菌落的数量，即可计算出样品中肠球菌的数量。本方法适用于水和液体样品中肠球菌的检验。16滤膜检测法操作程序滤膜检测法的操作程序见图36 DBS22/027—2014检样25mL样品＋225mL生理盐水10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度，取适量样液用灭菌滤膜过滤紧贴在肠球菌琼脂或KF琼脂表面36℃±2℃48h确证实验菌落观察染色镜检生化实验或Vitek或API计数并报告结果图3肠球菌的滤膜检测法操作程序17滤膜检测法操作步骤17.1样品保存同6.1。17.2样品处理17.2.1污染程度低的水或其他液体样品可直接进行检验。17.2.2污染程度较高的水或其他液体样品可吸取25mL放入含有225mL灭菌生理盐水中，制成1:10稀释液。取1:10稀释液25mL加到含有225mL无菌生理盐水的稀释瓶中,充分混匀制成1:100的稀释液。根据对样品的污染状况的估计,依次制成十倍递增稀释样品匀液。根据样品的污染程度，取不同稀释度的样液的量为100mL。17.3样液过滤、接种与培养每个样品至少选择三个连续的适宜稀释度的样液进行过滤（接种样液量应在这交代吧？）。将灭菌后的过滤器与抽滤瓶进行连接，用无菌镊子夹取无菌滤膜，将滤膜放在滤器底部。无菌吸取待过滤样液加入过滤器，打开真空泵进行抽滤。当全部样液通过滤膜后，用20mL灭菌生理盐水轻洗过滤器边缘至少两次。关闭真空泵，打开滤器，用无菌镊子移取滤膜，将滤膜紧贴在肠球菌琼脂或KF琼脂培养基表面上，避免出现气泡。倒置平板置于36℃±2℃培养24h～48h。17.4典型菌落观察和确证实验7 DBS22/027—2014肠球菌在肠球菌琼脂平板滤膜上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板滤膜上形成暗红色至粉红色菌落。用无菌接种针从滤膜上至少挑取10个典型菌落进行确证实验。按6.3.3和6.3.4所述进行进一步的确证实验。18滤膜检测法结果计算对确证生长肠球菌菌落的滤膜进行菌落计数，选择生长有20个～100个肠球菌的滤膜，计数滤膜上的菌落数。具体公式如下：以上按公式（1）计算。AB公式（1）：T=………………………………………（1）Cd式中：T——样品中肠球菌菌落数；A——某一稀释度的滤膜上生长的肠球菌典型菌落的总数；B——鉴定结果为肠球菌的菌落数；C——用于肠球菌鉴定的菌落数；d——稀释因子。19滤膜检测法结果报告根据样品稀释情况，计算出样品中的肠球菌菌数，以CFU/100mL表示。8 DBS22/027—2014AA附录A（资料性附录）培养基配制与生化试验A.1叠氮化钠葡萄糖肉汤培养基A.1.1成分牛肉浸膏4.5g胰蛋白胨15.0g葡萄糖7.5g叠氮化钠0.2g蒸馏水1000mLA.1.2制法将上述各成分混匀,不断搅拌加热溶解。每管分装10mL，121℃高压灭菌15min调整pH7.2±0.2。若制备双料浓度的叠氮化钠葡萄糖肉汤，可将上述配方蒸馏水改为500mL。A.2肠球菌肉汤培养基A.2.1成分胰蛋白胨17.0g牛肉浸膏3.0g酵母浸膏5.0g牛胆粉10.0g氯化钠5.0g柠檬酸钠1.0g七叶苷1.0g柠檬酸铁铵0.5g叠氮化钠0.25g蒸馏水1000mLA.2.2制法将上述各成分加热煮沸溶解冷却后，调节pH7.2±0.2，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A.3KF链球菌琼脂培养基A.3.1成分蛋白胨10.0g叠氮钠0.4g酵母浸膏10.0g溴甲酚紫(也可不加)0.015g9 DBS22/027—2014氯化钠5.0g琼脂20.0g甘油磷酸钠10.0g蒸馏水1000mL麦芽糖20.0g1％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)水溶液10.0mL乳糖1.0gA.3.2制法1)将上述各成分(TTC水溶液除外)加热溶解于蒸馏水中，煮沸5min,121℃高压灭菌15min；2)冷却至50℃～60℃时，加入已灭菌的1%TTC水溶液，每100ml加lml，混匀，调整pH7.2±0.2；⑶倾注无菌平皿中、冷却待用。A.4肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）培养基A.4.1成分胰蛋白胨17.0g牛肉浸膏3.0g酵母浸膏5.0g牛胆粉10.0g氯化钠5.0g柠檬酸钠1.0g七叶苷1.0g柠檬酸铁铵0.5g叠氮化钠0.25g琼脂13.5g蒸馏水1000mLA.4.2制法将上述各成分加热煮沸溶解冷却后，121℃高压灭菌15min，调节pH7.2±0.2，分装，于45℃～50℃倾注平板备用。A.5胆汁七叶苷琼脂培养基A.5.1成分蛋白胨8.0g胆盐20.0g柠檬酸铁0.5g七叶苷1.0g琼脂15g蒸馏水l000mLA.5.2制法将上述各成分加入蒸馏水中，缓慢加热使溶解，分装试管，每管5mI，高压灭菌121℃l5min，做成斜面．在冰箱中(4℃～8℃)保存。10 DBS22/027—2014A.6脑心浸液肉汤(BHIB)培养基A.6.1成分牛脑浸出粉10.0g牛心浸出粉9.0g胰蛋白胨10.0g葡萄糖2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠2.5g蒸馏水l000mLA.6.2制法将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调整pH7.2±0.2，分装，高压灭菌121℃l5min。A.7含6.5%氯化钠脑心肉汤培养基A.7.1成分牛脑浸出粉10.0g牛心浸出粉9.0g胰蛋白胨10.0g葡萄糖2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠2.5g氯化钠65.0g蒸馏水l000mLA.7.2制法将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调整pH7.2±0.2，分装，高压灭菌121℃l5min。A.8脑心浸液琼脂（BHIA）培养基A.8.1成分牛脑浸出粉10.0g牛心浸出粉9.0g胰蛋白胨10.0g葡萄糖2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠2.5g琼脂15.0g蒸馏水l000mLA.8.2制法将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调整pH7.2±0.2，高压灭菌121℃l5min。11 DBS22/027—2014A.9革兰氏染色液A.9.1结晶紫染色液A.9.1.1成分结晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸铵水溶液80.0mLA.9.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.9.2革兰氏碘液A.9.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300mLA.9.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.9.3沙黄复染液A.9.3.1成分沙黄0.25g95％乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.9.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.9.4革兰染色法a)将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。b)滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。c)滴加95％乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d)滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检。12 DBS22/027—2014BB附录B（资料性附录）肠球菌最大可能数（MPN）表表B.1每1g(mL)检样中肠球菌的最大可能数（MPN）值_________________________________13'