化工学院学士学位毕业论文.doc 25页

'化工学院学士学位论文第一部分绪论目录一绪论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０１１.１荧光原理及衍生．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０１１.１１荧光原理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０１１.１２衍生化技术．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０２１.１３流动相溶剂的选择．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０４１.１４药物样品的前处理方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０５１.２羧酸衍生技术的简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０６１.２.１脂肪酸的衍生化（荧光检测技术）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０６１.３高校液相色谱的原理及简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０７２..３.１高校液相色谱及特点．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０７１.３.２色谱的原理及高校液相色谱仪简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．０７１.４胆汁酸及分析方法简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０１.４.１什么是胆汁酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０１.４.２胆汁酸的分析方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１１二实验．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１３２.１试剂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１３２.２仪器设备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１４２.３样品的预处理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１４２.４衍生化方法和条件．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１４２.５色谱的分析条件．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１５-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论三结果与讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１６３.１ＢＣＥＳ的稳定性和胆汁酸的衍生物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１６３.２时间的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１６３.３温度的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１７３.４冠醚的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１７３.５胆汁酸衍生物的分离色谱图．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１８３.６应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１８四结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０致谢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２１内容摘要高效液相色谱（HPLC）是分析化学中发展最快、应用最广泛的领域之一，其分离特性使之成为临床化学、环境化学、生物学、毒物学等诸多领域中被广泛采用的有效分离和质量监控手段。由于化合物本身性质和检测手段的限制，并非所有物质都能够直接用于色谱分析，为此开发新型高灵敏衍生试剂，利用化学衍生化反应达到改变目标化合物的物理化学性质后，使之能够灵敏、快速和自动化测定是本文的研究目的。本文系统综述了液相色谱中所用的荧光检测器的荧光原理，介绍了近年发展的荧光试剂及它们的使用方法。我们合成了一种易于化合物羧基反应的新型荧光衍生试剂(1,2-苯并-3,4-二氢-9-乙基-对甲苯磺酸酯)并将其应用于胆汁酸的HPLC（高效液相色谱）分析中。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论本文采用一种新型柱前荧光衍生试剂1,2-苯并-3,4-二氢-9-乙基-对甲苯磺酸酯(BCES)，对10种胆汁酸进行柱前衍生，并通过荧光检测的方法进行高效液相色谱(HPLC)分析。采用6种胆汁酸作为测试化合物对衍生化反应条件（温度、时间和催化剂）进行了优化，衍生试剂过量10倍条件下，衍生化反应在相转移催化剂18-冠醚-6及碱性催化剂K2CO3的存在下于80℃经过70min进行完全。在HypersilBDSC18柱上，采用梯度洗脱，10种胆汁酸衍生物获得了基线分离，衍生物的激发和发射波长为lex/lem=326/386nm。衍生产物稳定性好，检测灵敏度高，按信噪比S/N=3:1，检出限范围18.3~471.9fmol。此外，还将该种荧光试剂应用于实际样品牛黄喉症胶囊中胆汁酸的分离。实践证明，与现存的一些荧光试剂相比，该新型的高灵敏荧光衍生试剂与胆汁酸的衍生化反应条件温和，简单易操作，衍生反应产率高，衍生产物的性质稳定，易于分离，反应副产物不影响被分析物的分离测定，具有很好应用价值。关键词：高校液相；1,2-苯并-3,4-二氢-9-乙基-对甲苯磺酸脂；18-冠醚-6-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论第一部分绪论1.1荧光原理及衍生1.1.1荧光原理荧光现象的发展已有四百多年的历史，自MONARDES于1575年从被称为“LignumNephriticum”的切片水溶液发现荧光现象以来，荧光现象的解释一直无多大进展，直至1852年STOKES在考察喹宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光波长比入射光的波长稍微长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光从而引入荧光是光发射的概念。[1]自1864年STOKES提出应用荧光作为分析手段，1928年JETTE和WEST推出第一台光电荧光计之后，经过100多年的发展，特别是现代激光，微处理机和电子学等一些新兴科学技术的引入，大大的推动了荧光法在理论方面的进展，促进了诸如同步荧光测定的、倒数荧光测定，时间分辨荧光测定，荧光免疫测定，低温荧光测定和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面一些新方法，新技术的发展并相应加速了各种新型荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效，痕量，微观和自动化的方向发展。方法的灵敏度，准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及与工业，农业，医药卫生，环境保护和科学研究的各个领域中，使荧光检测在高效液相色谱分离中成为一种重要且有效的痕量组分分析的重要方法。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论那么荧光具体是怎么产生的呢?下面我们一起来具体看一看。每种物质分子中都具有一系列紧密相隔的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的震动能级和转动能级。物质受光照射后部分或全部的吸收入射光的能量。物质吸收入射光的过程中，光子的能量便传递给物质分子，于是便发生电子从较低能级到较高能级的跃迁。所吸收的光子能量等于跃迁所涉及的两个能级间的能量差。当物质吸收紫外光或可见光时，足以引起物质分子中电子发生能级间的跃迁，处于这种激发状态的分子称为电子激发态分子。电子激发态的多重态用2S+1表示，S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，及自旋配对。假如分子中的全部轨道中的电子都是自旋配对的，及S=0，该分子体系便处于单重态，用符号S表示。大多数有机分子的基态是处于单重态的，倘若分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子便处于激发的单重态;如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子，及S=1，分子处于激发的三重态用符号T表示。符号S0，S1和S2分别表示分子的基态，第一和第三电子激发的单重态，T1和T2，则分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等分子内的去活化程丧失多余的能量而返回基态。又第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象成为荧光。图1.1分子内的光物理过程Al，A2光吸收过程；F荧光；P磷光；ic内转化；isc体系间窜跃；VR振动松驰1.1.2衍生化技术近十年来，化学衍生法在高效液相色谱法中的应用受到重视，发展较快。从是否与HPLC系统联机的角度，化学衍生化分为在线(online)与离线(offline)两种，从衍生化的场合，分为柱前衍生化(Pre-columnderivatization)和柱后衍生化(Post-columnderivatization)两种。目前在HPLC中，以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多。[2]-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论由于荧光检测灵敏度高、荧光衍生物的分离选择性好，过量试剂和副产物往往不产生干扰，衍生不必纯化等原因，使荧光衍生化试剂的开发和应用成为最为活跃的研究领域。从化学结构看，荧光衍生化试剂可分为二类，一类本身具有荧光基团及反应性基团，通过后者与分析对象反应，得到相应的荧光衍生物：另一类本身并不具备发荧光基团，只有通过衍生反应后才得到荧光衍生物。柱前衍生柱前衍生化是应用最为广泛的一种衍生化技术：在色谱分离前，样品组分经过特定的化学反应，使之转变为荧光衍生物进而进行色谱分离测定，该方法的优点表现在以下几方面：(1)通常不考虑衍生化反应的动力学，直到衍生反应完全(2)为了使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可以任意选定衍生化条件(3)柱前衍生化的溶剂不必与分离时的流动相配伍(4)衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰其主要缺点表现在：(1)柱前衍生化反应生成的副产物可能对色谱分离造成较大难度，有时严重影响衍生化反应的重复性。(2)衍生物的降解，反应溶剂的杂质组分造成大量干扰峰在进行柱前衍生化反应时，样品量的控制试剂的纯度及衍生物的储存条件应引起足够的重视。一个理想的衍生化反应所形成的衍生物在经过预处理时不能产生任何化学性质上的变化，色谱分离时化学性质稳定。如果满足上述条件的同时，衍生物可以直接水样注射最为理想。对大多数衍生反应来说，色谱分离前通常需要进行必要的前处理：包括除去过量的试剂或溶剂，溶剂的移取一般在室温或加热条件下经干燥的氮气流来实现。过量试剂或溶剂的挥发同样如此，样品的前处理除上述描述方法外也可经液-液萃取或其他分离步骤，此外过量衍生试剂有时采用加入另一种化合物使之反应而消除，但所加化合物产生的衍生物不能对其他组分分离带来干扰。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论柱后衍生在线的柱后衍生是将样品组分先经过色谱柱分离而后进行衍生化处理并检测的过程。柱后衍生技术与柱前衍生技术相比有以下优点：(1)反应的重现性好(2)未被衍生的化合物若有吸收时，同时也可进行分离和检测柱后衍生化的缺点(1)衍生化条件的自由度有所限制(2)由于衍生反应在特定反应器中进行，常造成峰扩展，使之分离度降低(3)过量试剂或试剂的降解产物可能造成干扰(4)通常需要特定的设备元件柱后反应器的结构通常包括多个结构单元，这要由衍生反应的条件来决定，但总体而言低压蠕动泵，小体积混合三通阀是必须的。不同类型的柱后反应器，包括管试反应器，毛细管式等。对衍生化反应的操作条件我们就不讨论了。1.1.3流动相溶剂的选择1.粘度小一般适合于做液相色谱流动相的溶剂粘度应小于2mPa.s.粘度大了,一方面液相传质慢,柱效低;另一方面柱压降增加.流动相粘度增加一倍,柱压降也相应增加一倍.过高的柱压降给设备和操作都带来麻烦2沸点低,固体残留量少这个要求对制备液相色谱是非常重要地.久而久之,固体残留物有可能堵塞溶剂输运系统的过滤器和泵体及阀件.3.与检测器相适应-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论紫外吸收和紫外分光光度计是高效液相色谱中使用最广泛的一类检测器,因此,流动相应当在所使用波长下没有吸收或吸收很小4.与色谱系统的适应性色谱中吸附剂往往不是酸性的就是碱性的,应当注意所选用的流动相和固定相之间应没有不可逆的化学吸附;例如在氨基健合相柱上就应避免使用含羰基(如丙酮)的流动相,否则分子间较强的作用会使固定相变质,甚至失效.仪器的输液部分大多是不锈钢材质,最好使用不含氯离子的流动相5.溶剂的纯度不能认为液相色谱流动相就应该使用十分纯的溶剂,关键是要满足检测器的要求.这是样品重线性的保证.目前国内专门供液相色谱使用的流动相溶剂规格不多,使用一般溶剂作流动相时,至少应当选择分析纯的试剂.1.1.4药物样品的前处理方法由于我们在实验的最后进行实际样品分析时,选取了牛黄消炎丸.所以在这里简单介绍一些比较普遍的前处理方法.1片剂,糖衣药或胶囊采用热溶剂提取法,如索氏提取法,选用合适溶剂提取药效组分,残渣留在滤筒内.2油膏状药物制剂必需先除去药物中含有的大量脂肪,常用的方法有:(1)将油膏先溶于亲油性的溶剂中,然后用甲醇提取其中的药效组分.(2)用硅胶薄层板,先用乙醚展开,使油脂与有效组分分离开.3.植物类药品由于天然药物的组分是很复杂的,在用高效液相色谱法测定其中少量的药效成分时,必须排除主要的基质成分或色素等干扰.因此,将植物提取液最大限度的净化,富集其中的有效组分就成了色谱工作前必须重视的工作.再者,在药物分析上需要解决的问题中,80%是可以靠反向色谱方法解决的,所用的流动相主要是已睛加水,或甲醇加水,有些流动相中还含有缓冲液,离子对试剂.最常用的检测器是紫外检测器.-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论1.2羧酸衍生技术简介1.2.1脂肪酸的衍生化（荧光检测技术）羧酸广泛的分布与自然界中，是生物体重要的营养物质和代谢产物。生物体内存在多种痕量羧酸在调节生物体各项生理和生物功能时起着十分重要的生理作用，因此，对这些化合物的分离和定量具有十分重要的意义。由于这类化合物在紫外可见光谱区的吸收较弱，因此用吸光光度法检测痕量的此类物质相对较难。HPLC荧光检测法对此类化合物的痕量检测具有较高的灵敏度，因此被广泛的用来测定这些组分。常用于这类化合物的荧光标记试剂主要有香豆素类化合物，然而对潮气及水不稳定，且衍生反应需要碱性催化剂和相转移催化剂，操作烦琐有时甚至不成功。重氮甲烷类试剂，如9-蒽重氮甲烷芘基重氮甲烷也是重要的羧酸衍生化试剂，然而这类试剂在反应的溶剂中不稳定且不易储存。还有人开发了喹喔酮类试剂用于羧酸类荧光化合物的标记，但由于该类试剂反应条件比较苛刻，不适用于热不稳定的羧酸类化合物。另一类用于标记羧酸的荧光试剂为磺酸酐类化合物，这类试剂通常需要冠醚和氢氧化钾的存在，并要使用有毒的苯和甲苯作溶剂，且色谱分离前需要对衍生化试剂进行处理，既费时又费力。还有一种用于标记荧光类化合物的荧光试剂是苯并酰肼类，该类试剂无需任何催化剂即可在常温条件下与羧酸类化合物进行反应。然而，该类试剂用于C1—C20脂肪酸的衍生化并同时分离分析较困难。所以并不能说一种衍生试剂可以适用于任何一种反应。接着让我们来看一看羧酸的衍生化实质过程。下面羧酸的荧光衍生剂在研究羧酸的荧光衍生试剂时，当羧酸的羰基是衍生反应基团时，(H2N—NH-)可与羰基缩合，。还有一些衍生试剂的反应基团是于羰基的—OH基团反应，这些反应基团有：溴甲基(--CH2Br)，重碳甲烷基(--CHN2)碳二酰二胺(--N-C-N--)，氨基（--NH2）等。给这些反应基团接上荧光团，就构成了羧酸的各种荧光试剂，它们与羧酸的反应过程见下图。[5]-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论图2.1荧光试剂与羧酸的反应示意图1.3高效液相色谱原理及简介1.3.1高效液相色谱及特点高效液相色谱法(HPLC)自20世纪60年代崛起，经过数十年的发展在理论和实践方面都日趋完善，并逐渐成为一门新生代，高技术含量的学科，应用范围已经涉及医药，环保，生命科学，石油化工等几乎所有基础及应用研究领域。［31］1.3.2色谱的原理及高效液相色谱仪简介色谱是这样一个过程，即某一混合物中各组分在被称之为固定相和流动相、的两相之间因具有不同的分配系数而进行的分离，所以当此混合物在从固定床层的一端加入，并随流动相向前流动的过程中，各组分在两相间经过反复多次的分配，结果导致在固定相上有不同的保留而被分离，分配系数大的，保留时间长，分配系数小的，保留时间短。[31]高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)除了叫高压或高速色谱外，又称为高分离度液相色谱或近代柱液相色谱，但一般人们都用第一个术语，即高效液相色谱。它同其他经典液相色谱和气相色谱相比较，可以看出高效液相色谱具有分离效能高，分析速度快，检测灵敏度高和应用范围广泛的特点，特别适合高沸点，大分子，强极性和热稳定性差的化合物的分离和分析。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论单元部件1.输液泵泵是一项高效液相设备中最重要的单元部件，是驱动溶剂和样品通过色谱柱和检测系统的高压源，其性能好坏直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。用于分析目的的泵应当流量稳定，耐高压，能耐各种流动相，如有机溶剂，水和缓冲液。目前，商品高效液相色谱仪普遍采用体积小，方便多用的往复泵和隔膜泵。以往复泵为例，又有单，双和三泵头结构之分。显然，在单泵头的情况下，如果没有必要的补偿机构，脉动较大，若改为双泵头时、或三泵头，交替动作的柱塞分别以1800和1200的相位差排液和吸液，则输出流向的脉动大为改善。因而后两种往复泵更受欢迎。对于分析极性范围宽或分子体积相差较大的复杂混合物，为了能在较短的时间内对所有各组分均实现满意的分离，常采用梯度淋洗操作。这时需要使用两台泵，按一定的程序逐步增加混合溶剂中的极性成分，以提高单位时间内的峰容量。用于钢性微粒柱装柱的高压泵多是气动泵和往复泵，主要恒量指标是能产生高压的和较大排液量的。这是自行装柱的实验室所必需的设备。2.色谱柱人们长说色谱柱是色谱仪的心脏，因为色谱的核心问题---分离，是在这里进行的。在色谱发展史上，色谱柱填料与柱技术的发展一直是色谱工作者共同关心的问题，可以说，液相色谱的每一个重大发展都和色谱柱的每一次突破密切相关。为适应不同的分离分析要求。可有不同的柱型，内装不同性质的填料。最长使用的色谱柱是10~30CM长，2~5MM内径的内壁抛光的不锈钢管柱，内装5~10um高效微粒固定相，采用高压均浆装柱技术填充。相同柱长的效率远远高于气相色谱，以2MM内径柱为例，250CM长的5微米YWG硅胶柱柱效可达20000理论塔板，而5微米YQG-GH反相键合相柱可达14000理论塔板。高效柱的填充需要特殊的设备和技术。国际上各色谱仪的色谱产品厂家均提供预装柱。3.进样器-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论待分析样品从柱头进样器引入的方式可分为注射器进样，停流进样，阀进样和自动进样器进样四种，其中注射器和阀进样为最长用。在10MPA以下的进口压力可用1~10ul的微量注射器进样，在这种情况下一般可以获得最高的柱效率，但进样重复性不佳，特别是在较高压力下阀进样是比较理想的，进样体积可变，也可以固定，但一般来说，柱效受些影响。自动进样器适合与多样品重复操作，便于用微处理机控制，实现自动化。4检测器被分析组分在柱流出液中浓度的变化可以通过检测器转化为光学的或电学的信号被检出，是色谱仪的“眼睛”。检测器性能的好坏直接关系到定性定量分析结果的可靠性。在高效液相色谱中最常用的检测器是光学检测器，例如视差折光，紫外吸收或分光光度检测器。前者是通用型的检测器，但灵敏度较低，适合于常量分析；后者中，紫外吸收有比较高的灵敏度，但只能检处在仪器特定波长下有吸收的化合物。紫外-可见分光光度检测器可适用较宽的范围可以弥补单波长吸收检测器选择性太强的缺陷，因而是一种应用面较广的高效液相色谱检测器。近年来发展的二极管阵列检测器允许对柱流出物进行不停留的瞬间波长快速扫描，通过微处理机控制获得光吸收，波长和时间的三维色谱/光谱图，从而取得更多的定性色谱峰纯度鉴定的信息，是一种比较理想的检测器。荧光检测器有较高的灵敏度，一般说来可比紫外吸收高10~1000倍，但也有更专一的选择性。对于一般电活性物质（如无机物质，有机酸，碱和两性离子），电化学检测器的灵敏度可比紫外吸收高2~3个数量级。但总的来说，高效液相色谱的检测器目前尚不理想，灵敏度不及气相色谱。发展通用，灵敏和更专一的检测器是今后应探索的重要课题。5馏分收集器如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其它的色谱鉴定，或获取少量实验样品的小型制备，馏分收集是必要的。用小试管收集，手工操作只适合于少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。馏分收集器比较理想，因为便于用微处理机控制，按预先规定好的程序，或按时间，或按色谱峰的起落信号逐一收集和重复多次收集。6数据获取和处理系统-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论把检测器的信号显示出来的数据系统可以有多种形式。最简单的是电位差式长图记录器，记录信号随时间的变化，得到色谱流出曲线或色谱图。面对定性定量较有利的是采用积分仪，记录保留时间或峰号，以及峰面积。先进的高效液相色谱仪多用微处理机控制，这通常是一台专用的微机算机。其功能有二，一是作为数据处理机，例如输入定量校正因子，按预先选定的定量方法，将面积积分数换成实际的成分分析结果，或者给出某些色谱参数；二是作为控制机，控制整个仪器的运转，例如按预先编好的程序控制冲洗剂的选择，梯度淋洗，流速，柱温，检测波长，进样和数据处理。所有指令和数据通过键盘输入，结果在阴极射线管或绘图打印机上显示出来。更新一代的色谱仪应当具有某些人工智能的特点，即能根据以有的规律自动选择操作条件，根据规律和以知的数据，信息，进行判断，给出定性定量结果。[8]1.4胆汁酸及分析方法简介1.4.1什么是胆汁酸?胆汁酸由人体肝脏（实质）细胞中的胆固醇合成，储存在胆囊中，分泌到小肠，被回肠最接近的有效地再吸收，并经过门静脉返回肝脏。胆汁酸在排泄体内胆固醇及肠道中类脂类的增溶及吸收方面具有重要的生理作用。哺乳动物中最常见的胆汁酸是5β-胆烷-4酸。人体内存在的主要成分有胆酸（CA），鹅脱氧胆酸（CDCA），脱氧胆酸（DCA），石胆酸（LCA）及在C-24位置上主要表现为甘氨酸和牛磺酸的酰胺化合物的熊脱氧胆酸（UDCA）。除此之外，一大批次要成分包括C-1，C-4或C-6的羟基化衍生物和它们的别（异）胆汁酸（A/B环在反式结构中相连），C23和C27胆汁酸，不饱和组分，含氧胆汁酸和任意羟基基团与硫酸，葡糖筌酸，葡萄糖或N-乙酰葡糖胺的共轭物也已被识别。因为人体内主要胆汁酸浓度和相对比例的变化及其他次要成分的增加标志着肝胆管及肠功能紊乱，所以生物材料中这些成分的单独分离及准确定量是人类及其他哺乳动物（如牛，羊，马）肝脏及胃肠道疾病十分重要的预兆及诊断指标。除了这些生理作用，CDCA和UDCA被广泛用来处理胆固醇胆结石。最近，UDCA被用来治疗cholestatic肝病，因此为监控药物生产过程和评价含CDCA或UDCA药物的生物利用率在药物原材料及配料形式和人血清中测定这两种胆汁酸是非常重要的。[15]-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论1.4.2胆汁酸的分析方法：毛细管GC-MS是很成熟的方法，因为它具有高效，高灵敏度及专一性，并已被证实在识别不常见的胆汁酸时十分关键。但对于共轭型胆汁酸，它需要解共轭和衍生化，因此共轭的部分需要从最初的分离步骤中加以确认。HPLC对于不同形式的胆汁酸都可用，但它也存在分离能力不足的问题，这可以通过改善流动相的选择性加以提高。天然胆汁酸的复杂组成及单个分子结构间的微小差异对现有的分析技术提出了很高要求，并且由于胆汁酸缺少强的发色团，使常规的分光光度检测系统的灵敏度和专一性受限。生物和药物基体中胆汁酸分析的常见技术包括主要的色谱过程，但也有酶催，免疫及电化学方法。后者有明显的缺点：如设备较复杂，专一性及重现性较差。使用胆汁酸羟甾类脱氢酶的酶催法由于其快速，简单，对大规模的日常分析特别有效（如未经处理的生理液体的直接分析）。但由于它测定的是全部或几组特定的胆汁酸（如7-α或12-α羟基胆汁酸），单个组分间的差别及它们的共轭状态无法确认。此外，酶催法灵敏度很差，易受生物基体其他组分的干扰及酶污染物的影响。用放射性或酶免疫法测定可降低检测限及提高专一性，但与其他胆汁酸结构类似物的交叉反应作用仍是现有方法的一个缺点。而且用免疫学的方法只能准确测定一些常见胆汁酸（如CA及CDCA），游离形式通常难以测定或只能通过抗体对甘氨酸或牛磺酸共轭物的特异性加以测定。色谱法是生物材料中胆汁酸外形详细分析的选择方法，但还没有一种单独的色谱法及检测技术能提供复杂天然胆汁酸混合物的全分析，还需要彻底的样品预处理包括萃取，纯化及分离成不同的几组来提高分析的灵敏度及专一性。高效液相色谱法(HPLC)自20世纪60年代崛起，经过数十年的发展在理论和实践方面都日趋完善，并逐渐成为一门新生代，高技术含量的学科，应用范围已经涉及医药，环保，生命科学，石油化工等几乎所有基础及应用研究领域。[11]-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论下面我们可以用图片的方式更直观的告诉大家胆汁酸的分类：图1.4.1胆汁酸分类示意图fig1.4.1theclassificationofbileacids-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论第二部分实验1摘要采用一种新型荧光衍生试剂1,2-苯并-3,4-二氢-9-乙基-对甲苯磺酸酯(BCES)，在相转移催化剂18-冠醚-6及碱性催化剂K2CO3的存在下，对10种胆汁酸进行柱前衍生，并通过荧光检测的方法进行高效液相色谱(HPLC)分析。2.1实验部分2.1.1试剂胆酸(CA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)，购自Sigma(StLouis,MO,USA)。牛黄喉症胶囊(大连中药厂提供)，乙腈(色谱纯，山东禹王实业总公司化工厂)；无水乙腈(自制)；其它试剂均为分析纯。胆汁酸结构，化学式：-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论2.1.2仪器设备P200-II型高压恒流泵(大连依利特科学仪器有限公司)，Echrom98数据采集器(大连依利特科学仪器有限公司)，JascoFP-1520荧光检测器(日本)。7725六通进样阀(美国Rheodyne公司)JascoLG-1580-04自动梯度控制仪(日本)，色谱柱HypersilBDSC18250´4.6mm(i.d)(大连依利特科学仪器有限公司)。2.1.3样品的预处理胆汁酸样品预处理基本流程如下：取牛黄喉症胶囊900mg，加入10mL甲醇，超声60min，收集上清液1mL，离心10min(3000r/min)，收集上清液，用0.45mm滤膜过滤后待衍生分析。[9]2.1.4衍生化方法和条件衍生步骤：在1mL离心管加入10mgK2CO3，依次加入100ml胆汁酸溶液，100mLDMF溶液，100mL衍生试剂溶液，100mL18-冠醚-6溶液溶液混合，80℃水浴加热反应70min，取20mL，用乙腈稀释到200mL，取20mL进行色谱分析。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论衍生反应方程式：2.1.5色谱分析条件流动相组成：流动相A为乙腈-水(50:50,v/v)；流动相B为乙腈-水(100:0,v/v)。梯度条件：0min—100%A(开始淋洗)；56min—30%A；62min—0%A；90min—0%A(结束淋洗)。流速：1mL/min；柱温：室温；衍生物的荧光激发和发射波长为lex/lem=326/386nm。色谱柱HypersilBDSC18250´4.6mm(i.d)。2.2结果与讨论2.2.1BCES的稳定性和胆汁酸的衍生物固体的BCES可以在室温下，阴凉的干燥储存器中稳定保存至少6个月。如我们所想的一样对胆汁酸的衍生液进行在24小时内的多次稳定性的实验考察没有发现明显的杂质峰。这就说明这种衍生方法下的衍生液已经达到了高效液相分析所要求的稳定性。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论2.2.2时间的影响对衍生产物来说我们最终得出的优化时间是在80OC进行的，70分钟是最优化的衍生时间。如果再提高衍生时间，衍生产物会大量分解。因为衍生产物的稳定性将会降低，特别是UDCA，CDCA，和LCA。所以这种条件对10种胆汁酸而言是最恰当的。(见下图.2.1)图.2.1反应时间对衍生化的影响fig.2.1Reactiontimeeffect1.GCDCA2.GDCA3.UDCA4.GLCA5.CDCA6.LCA2.2.3温度的影响我们在40OC到90OC的范围内做了4次考察，我们发现在其它温度下(除80OC)，BCES的衍生反应不完全，这是因为形成了其他的衍生副产物的原因。因此我们最终选择了80OC作为反应温度。(见下图.2.2)-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论图.2反应温度对衍生化的影响图2.2衍生反应温度的影响fig.2.2Reactiontemperatureeffect1.GCDCA2.GDCA3.UDCA4.GLCA5.CDCA6.LCA2.2.4冠醚的影响比较在衍生体系中加入或不加入冠醚考察对衍生反应的影响结果如图2.3，说明冠醚对衍生反应的产率有较大影响，可以显著提高衍生反应产率。图.2.3冠醚对衍生反应的产率的影响fig.2.3relativederivatizationyield(%)18-crown-6-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论2.2.5胆汁酸衍生物分离色谱图在上述色谱分离条件下梯度洗脱条件下，10种胆汁酸衍生物的色谱分离图（图2.4），可见10胆汁酸均获得了基线分离，平均检出限可达150fmol。图.2.4胆汁酸衍生物色谱图（荧光检测）fig.2.4bileacidsHPLCmapPeaks:1.GCA2.GUDCA3.GCDCA4.GDCA5.CA6.UDCA7.GLCA8.CDCA9.DCA10.LCA2.2.6应用按照上述样品处理方法，对牛黄喉症胶囊中胆汁酸进行提取，按照上述衍生方法进行衍生分离所得色谱图（图2.5），发现其中有三种胆汁酸（CA），鹅脱氧胆酸（CDCA），脱氧胆酸（DCA）。-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论图2.5牛黄喉症胶囊中胆汁酸衍生物色谱图fig2.53bileacidssketchmap5.CA8.CDCA9.DCA2.3结论：胆汁酸在18-冠醚-6与碳酸钾的作用下可与BCES发生衍生反应，衍生产物不仅稳定、检测灵敏度高，而且衍生操作非常简单方便。这就使胆汁酸的分离更加的容易，快速，准确。我们有理由相信在不久的将来，BECS这种衍生试剂会被广大色谱工作者所接受，并用于更加广泛的领域。第三部分致谢本文是在导师张丽华研究员，张琳老师，孙剑飞老师的悉心指导和亲切关怀下完成的。导师渊博的学识、严谨的治学精神，为人师表的作风，将使我终身受益。值此论文完成之际，谨向导师致以崇高的敬意和忠心的感谢！本实验室其他老师和研究生对实验的开展都给以了大量的支持，在此致谢！张玉奎院士领导的课题组资助了本实验的全部经费，深表感谢！最后，向所有给以我帮助的人，表示深深谢意！2004年6月3日-25- 化工学院学士学位论文第一部分绪论第四部分参考文献：[1]L.B.Agellon,andTorchia,E.C.Biochim.Biophys.Acta1486(2000)198.[2]D.W.Russell,andK.D.Setchell,Biochemistry31(1992)4737.[3]S.S.Rossi,J.LConverse,andA.F.Hofmann,J.LipidRes.28(1987)589.[4]K.D.R.Setchell,A.M.Lawson,N.Tanida,andJ.Sjovall,J.LipidRes.24(1983)1085.[5]S.Perwaiz,B.Tuchweber,D.Mignault,T.Gilat,andI.M.Yousef,J.LipidRes.42(2001)114.[6]A.Roda.C.Cerré,P.Simoni,C.Polimeni,C.VaccariandA.Pistillo,J.LipidRes.33(1992)1393[7]J.StreetandK.D.R.Setchell,Biomed.Chromatogr.2(1998)229[8]T.NambaraandJ.Goto,inK.K.R.Setchell,DKritchevskyandP.P.Nair(Editors),TheBileAcids,Vol.4,PlenumPress,NewYork,NY,1988,pp.43-64.[9]L.Zhang,J.M.You,G.C.Ping,L.H.Zhang,J.C.DuanW.B.Zhang,Z.LiangandY.K.Zhang,Anal.Chim.Acta494(2003)141.-25- 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