千斤拔对离体坐骨神经腓肠肌收缩特性的影响制药工程生物制药方向 毕业论文.doc 22页

'玉林师范学院本科生毕业论文千斤拔对离体坐骨神经腓肠肌收缩特性的影响FlemingiaPhilippinensisMerr.etRolfeImpactonVitroSciaticGastrocnemiusShrinkageCharacteristics院系生命科学与技术学院专业制药工程（生物制药方向）学生班级2011级姓名魏蓁琳学号201110403146指导教师单位生命科学与技术学院指导教师姓名王晓平指导教师职称教授千斤拔对离体坐骨神经腓肠肌收缩特性的影响 制药工程2011级制药11班×××指导老师×××摘要目的：探讨千斤拔水提液(FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfeDecoction)对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩特性的影响。方法：将解剖剥制的坐骨神经腓肠肌标本分别用浓度为0.7%的生理盐水、0.125g/mL、0.25g/mL、0.5g/mL的千斤拔水提液浸润，用RM6240生物信号采集仪测定每一浓度浸润前、浸润5分钟、浸润10分钟、浸润15分钟各时间点的腓肠肌收缩的阈强度（每一时间点分别测定5次）和完整单收缩曲线(每一时间点测定25次）的收缩速率、舒张速率、收缩幅度以及潜伏期等指标。结果：在浸润处理短时间下，腓肠肌收缩阈强度随着千斤拔水提液浓度的增加而升高，但小于用药前水平（P<0.01，P<0.05），如果超过一定浓度和时间，阈强度大于用药前水平，并逐渐升高（P<0.05）；而在同一时间内，收缩幅度、收缩速率、舒张速率均随千斤拔水提液浓度的增加先升高后降低，并低于用药前水平（P<0.01，P<0.05）；青蛙坐骨神经腓肠肌的潜伏期受浸润溶液中千斤拔浓度的影响，它随着千斤拔浓度的增加先降低后升高，但整体呈现一个降低的趋势。结论：骨骼肌的收缩特性受到千斤拔的成分影响。低浓度千斤拔水提液在短时间内能提高骨骼肌的收缩能力，处理的时间过长或者生药浓度过高都会使骨骼肌的收缩能力减弱，甚至会抑制骨骼肌的收缩能力，并影响神经肌肉兴奋信号的传递。关键词：千斤拔，离体坐骨神经腓肠肌，收缩特性 FlemingiaPhilippinensisMerr.etRolfeImpactonVitroSciaticGastrocnemiusShrinkageCharacteristicsPharmaceuticalEngineering2011ZhenlinWeiSupervisorXiaopingWangAbstractGold:toinvestigateonethousandjinspullwaterextract(FlemingiaphilippinensisMerr.EtRolfeDecoction)onfroginvitrosciaticnerveshrinkagecharacteristicsofthegastrocnemiusmuscle.Methods:theanatomyofthestripofsciaticnervegastrocnemiusspecimenswithconcentrationof0.7%salinerespectively,0.125g/mL,0.25g/mL,0.5g/mLonethousandcattiesofwaterextractionliquidinfiltration,eachconcentrationwasdeterminedbyRM6240biologicalsignalacquisitioninstrumentinfiltration,infiltration,infiltrationfor10minutes,5minutesbeforetheinvasionof15minuteseachtimepointofthegastrocnemiusmusclecontractionthresholdintensityofeverypoint,respectively(5)andacompletesinglecontractioncurve(25perpointdetermination)contractionrate,diastolicvelocity,amplitudeandtheincubationperiodofindicators.Results:undertheinfiltratingshortprocessingtime,gastrocnemiusmusclecontractionthresholdintensitywiththeincreaseofonethousandcattiespullwaterextractionliquidconcentration,Butatthesametime,theshrinkagerate,shrinkagerate,relaxationratewithonethousandcattiesofwaterextractionliquidconcentrationincreasereducedafterrisingfirst,andbelowthelevelbeforemedication(P<0.01,P<0.05);Incubationperiodoffrogsciaticnervegastrocnemiusaffectedbyinfiltratingonethousandcattiesofconcentrationinthesolution,itincreasedwiththeincreaseofonethousandcattiespullconcentrationincreasedafterlowerfirst,buttheoverallshowsthetendencyofalower.Conclusion:theskeletalmusclecontractioncharacteristicsaffectedbyonethousandcattiesofcomposition.Lowconcentrationonethousandjinspullwaterextractionliquidinashortperiodoftimecanimprovetheabilityofskeletalmusclecontraction,theprocessingtimeistoolongorcrudedrugconcentrationistoohighwillweakenoreveninhibitskeletalmusclecontractionability,anddoesaffecttheneuromuscularexcitementsignaltransfer.keywords:FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfe，Vitrosciaticgastrocnemius，Shrinkagecharacteristics 目录1.前言11.1千斤拔的基本特征11.2千斤拔的化学成分21.3千斤拔的药理作用21.4千斤拔的应用前景31.5实验原理42.试验材料和试剂42.1实验对象及材料42.2主要仪器42.3主要药品53.实验内容与方法53.1制备离体坐骨神经腓肠肌实验53.1.1常用试剂配制53.1.2坐骨神经腓肠肌的预制备53.2骨骼肌收缩信号采集实验63.2.1仪器连接63.2.2基本参数63.2.3分组及处理63.2.5数据记录以及统计学分析74.实验结果74.1骨骼肌收缩信号采集实验74.1.1千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌阈强度的影响7据记录以及统计学分析84.1.2千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩幅度的影响84.1.3千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩速率的影响94.1.4千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌舒张速率的影响104.1.5千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌潜伏期的影响115.讨论125.1千斤拔水提液活性物质对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩特性的影响125.2千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩能力的影响135.3千斤拔药理作用的研究展望14致谢15参考文献16 1.前言1.1千斤拔的基本特征千斤拔（学名：FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfe），别称：蔓性千斤拔，吊马桩，吊马墩，一条根，老鼠尾，钻地风（四川）等[1]。蔡毅，梁雁，李小云等[2]对广西产的三种千斤拔进行了生药学鉴别。实验结果为：半灌木千斤拔的根为长圆柱形，略弯曲，上粗下渐细，偶有分枝，长20～70cm，直径1.0～1.5cm。表面灰棕色棕褐色至黑褐色，有稍突起的横长皮孔及细皱纹质坚韧，不易折断，断面略平坦；皮部棕褐色，木部宽广，类白色或淡黄棕色，有明显的放射状纹理气微，味微苦甘。木栓层2～4列细胞，排列紧密，细胞壁特厚，可见孔沟，皮层较薄，细胞中充满红棕色物质；可见分泌腔，内含黄褐色分泌物，韧皮部狭窄，分泌细胞单个散在，直径18～30μm，或数个相连形成大型的分泌腔，直径木质部宽广，占切面的5/6;大型导管1～2个聚生，直径25～86，周围聚生众多木纤维；木射线明显，多由1列扁平的木薄壁细胞组成，内含淀粉粒。蔓性千斤拔的根为长圆柱形，上粗下渐细，极少分枝，长30～70cm，直径1.0～1.5cm，表面棕黄色灰黄色至棕褐色，有稍突起的横长皮孔及细皱纹质坚韧，不易折断，断面皮部深棕褐色，显纤维性；木部宽广，淡黄白色，有细微的放射状纹理，微具豆腥气，味微甘涩。木栓层为10余列细胞，其外侧常含深棕色物，皮层较窄，有的细胞内含棕色物，韧皮部中可见分泌细胞单个散在，直径18~40μm，或数个相连；纤维散在或成束；草酸钙方晶散在，直径8～21μm，木质部宽广，占切面的2/3，大型导管1～2个聚生，直径25～110μm，周围聚生木纤维；木射线明显，由1～8列扁平的木薄壁细胞组成，内含草酸钙方晶淀粉粒或淡红棕色物质大叶千斤拔的根呈圆柱状，较粗壮，多有分枝，长30～90，直径可达6cm根头部略呈结节状膨大，残留的茎基较粗；表面红棕色，有细小的纵纹并且横向皮孔质坚硬，不易折断，断面的皮部与木部常分离"皮部颜色呈深红棕色，显纤维性，能够看见褐色的胶状物；木部颜色呈浅棕红色或棕黄色，有细微的放射状纹理，气微，味微甘辛。木栓层为6～8列细胞，切向延长，排列整齐，有时外被落皮层"皮层较窄，含棕色物的细胞更多"韧皮部狭窄，可见分泌细胞散在，直径20～32cm，纤维散在或成束；草酸钙方晶散在木质部宽广， 占切面的7/8,大型导管1～2个聚生，直径25～80μm，周围聚生木纤维；木射线宽广，由3～10余列细胞构成，易见草酸钙方晶，直径10～2μm和淀粉粒，直径5～20μm。1.2千斤拔的化学成分千斤拔属植物中含有黄酮、酚类、鞣质、糖类、甾醇、生物碱和氨基酸类等成分,其中以酮类成分含量较高[3-4]。陈敏等[5]从蔓性千斤拔根的乙醇提取物中分离并鉴定了六个化合物和一个烷酸的混合物,其中两种为首次分离的黄酮类化合物,分别命名为蔓性千斤拔素C(Ñ)和蔓性千斤拔素D(Ò),其余为已知物,分别鉴定为5,7,3c,4c-四羟基-6,8-双异戊烯基异黄酮(Ó)、flemichinD(Ô)、nC22-C30烷酸(Õ)、B-谷甾醇(Ö)和羽扇豆醇（X）。化合物Ó和Ô对P388白血病细胞上具有显著的抑制作用。刘建华等[6]利用水蒸气蒸馏法从蔓性千斤拔根茎中提取了挥发油,并用气相色谱-质谱-计算机联用系统对挥发油化学组成进行了定性定量研究,分析鉴定了39个化学成分,其中含量最高的是Italicene301136%,其次为含雪松烯类物质,分别为A-雪松烯51348%,B-雪松烯51186%,C-雪松烯51011%等[7],进一步对千斤拔的植物成分进行研究。1.3千斤拔的药理作用目前,千斤拔被广泛应用于妇科、风湿痹痛等类型的中成药生产之中,比如妇科千金片、金鸡冲剂、金鸡胶囊、补血调经片、壮腰健肾丸、活络止痛丸、复方海蛇酊、复方挫伤灵和脑萎缩丸等。千斤拔性平味甘，具有补气血，助阳道的作用，临床上主要用于治疗手足痹痛，腰部风湿作痛，理跌打伤等症，《广西中药志》介绍：“舒筋活血，祛风湿，强筋骨，四肢酸软，跌打扭伤，阳黄疸[8]，又治腰肌劳损，腹胀，食欲不振，月经不调”[9]。《中国壮药志》记载千斤拔有祛风湿邪毒、舒筋、通龙路、补虚壮骨的作用,主治风湿骨痛、腰肌劳损、偏瘫痿痹、肾虚阳痿、气虚脚肿、劳伤咳嗽[10]。近些年的研究表明，千斤拔用于治疗由肝肾阴亏，气血两虚所引起的腰膝酸软、肢体麻木、疲倦无力和月经不调诸症，都能够起到良好的治疗效果。17 周卫华[11]等通过实验研究千斤拔对小鼠进行负重游泳游泳实验以及对实验小鼠的血BUN、LDH、SOD、MDA、GPX和肝HG进行测定。结果发现千斤拔低、中、高浓度三组的小鼠负重游泳的时间显著高于正常对照组。千斤拔醇提物中、高浓度两组小鼠的血清LDH明显低于正常对照组小鼠(P<0.05)，千斤拔醇提物低、中、高浓度两组小鼠的血清BUN低于正常对照组小鼠(P<0.01)，千斤拔醇提物低、中、高浓度三组小鼠的肝糖原HG显著高于正常对照组小鼠(P<0.05或P<0.01)。千斤拔醇提物中、高浓度两组小鼠的血清SOD活性明显高于正常对照组小鼠(P<0.05或P<0.01)，千斤拔醇提物高浓度组小鼠的血清MDA含量低于正常对照组小鼠(P<0.01)，千斤拔醇提物高浓度组小鼠的血清GPX显著高于正常对照组小鼠(P<0.05)。这些研究表明千斤拔具有抗炎镇痛、抗血栓、抗氧化和对神经系统损伤的保护作用；在临床上，治疗肝肾阴亏，气血两虚引起的腰膝酸软，疲倦无力等症状具有很好的效果。曾春兰[12]等通过采用小鼠耳廓肿胀法，0.6%醋酸所致扭体法，CCl4所致急性肝损伤法，毛细玻璃管凝血时间法，小鼠负重游泳实验和急性毒性试验，来观察千斤拔抗炎镇痛*抗肝损伤、抗凝血、抗疲劳作用及其毒性情况。结果发现千斤拔能减轻小鼠耳廓肿胀，减少小鼠扭体次数；降低肝损伤小鼠转氨酶活性，延长凝血时间和小鼠游泳时间。急性毒性试验表明，千斤拔的小鼠最大给药量为160.1g生药/kg。从而可以得出千斤拔具有一定的抗炎、镇痛、降转氨酶抗凝和抗疲劳作用，且药物毒性很小的结论。1.4千斤拔的应用前景千斤拔性平味甘，且具有补气血，助阳道的功用，临床证明其对风湿骨痛、腰肌劳损、偏瘫痿痹、肾虚阳痿、气虚脚肿、劳伤咳嗽有很好疗效[13]。近年来，对千斤拔的研究已经取得了初步的进展，涉及化学成分、药理作用、提取工艺等多个方面，研究水平也日趋深入，研究领域不断扩大。所以探讨千斤拔影响骨骼肌收缩性能对现实生活具有很大的意义。为了进一步明确千斤拔的药用价值，本研究采用对青蛙离体坐骨神经腓肠肌进行骨骼肌收缩性能的测验，探讨千斤拔对骨骼肌收缩特性的影响，为阐明其药理和药效提供更多的科学依据。17 1.5实验原理千斤拔含有的活性成分主要是黄酮类，除此之外还含有香豆素类、萜类、挥发油类、脂肪酸类等[13]!毛俐等[14]用ICP-AES法测定了中药千斤拔微量元素的含量,发现其Ca、Mg、Fe、Zn等元素的含量均比较丰富。Ca2+[15]与生物碱，对于骨骼肌以及神经都具有明显的药理学意义。千斤拔水提取物可使细胞能cAMP增多，收缩时释放钙离子增加的机制，支气管平滑肌有松弛作用，对诱发的哮喘有保护作用,能对抗组胺、乙酰胆碱等过敏介质引起的气管、支气管收缩,明显延长哮喘潜伏期[16]。本实验取样于骨骼肌展开研究。腓肠肌由许多肌纤维组成，电刺激腓肠肌时，不同的刺激强度会引起肌肉不同程度的收缩反应。当刺激强度很小时，不足以引起肌肉发生收缩反应，此时的刺激为阈下刺激；一般将引起组织发生收缩反应的最小刺激强度定义为阈强度或强度阈值。当全部肌纤维同时收缩时，则出现最大的收缩反应。这时，即使再增大刺激强度，肌肉收缩的力量也不能再随之加大。可以引起肌肉发生最大收缩反应的最小刺激强度为最适刺激强度，此时的完整单收缩包括潜伏期、收缩过程、舒张过程这三个阶段。在最大收缩反应的单收缩曲线中，可以利用RM6240多道生理信号采集仪测出收缩幅度、收缩时间、舒张时间、潜伏期这一系列指标，并可利用公式计算：收缩速率=收缩幅度/收缩时间，舒张速率=收缩幅度/舒张时间。2.试验材料和试剂2.1实验对象及材料健康且弹跳力正常的黑斑蛙，50±5g，雌雄兼用，购于广西玉林洞口市场，经王晓平教授鉴定为正品。生药千斤拔块根，购于广西玉林市中药材市场，经王晓平教授鉴定为正品。2.2主要仪器RM6240多道生理信号采集仪（成都仪器厂）、精密电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、张力换能器、冰箱、手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、毁髓针、蛙板、固定针、玻璃分针、神经屏蔽盒、滴管、培养皿、玻璃分针、锌铜弓、污物缸、棉线、量筒、烧杯、铁架台等。17 2.3主要药品氯化钠（分析纯）GB/T1266-2006购于广东西陇化工股份有限公司，生产批号为：1004151。西洋参胶囊6g（0.5g*12粒/盒）Q/FSTL0048B购于福建斯特龙生物药业有限公司，生产批号：20140401。3.实验内容与方法3.1制备离体坐骨神经腓肠肌实验3.1.1常用试剂配制(1)千斤拔水提液的制备：将购回的生药千斤拔用万能粉碎机粉碎1次，得到千斤拔粗粉。采用水煎的方式，用10倍体积的去离子水浸泡1h，加热煮沸1h，趁热滤取药液；再加8倍量水，煮沸30min，合并两次滤液，浓缩至1g/ml备用（用时加去离子水稀释至所需浓度）[17]。(2)0.7%蛙类生理盐水：0.7g氯化钠溶解于100mL去离子水即得。(3)0.7%西洋参胶囊溶液：3.5g（即5粒）西洋参胶囊溶解于500mL去离子水即得。3.1.2坐骨神经腓肠肌的预制备按常规方法制备青蛙坐骨神经排肠肌标本[15]，破坏脑和脊髓：取青蛙一只，用纱布包裹青蛙的四肢和躯干，露出头部，用自来水冲洗干净。用左手握住青蛙，用食指压住头部前端使头前俯，拇指按压背部；右手持刺蛙针从枕骨大孔向前刺入颅腔，左右搅动捣毁脑组织，然后将刺蛙针退到枕骨大孔，不拔出而是将其尖转向后平行插入脊柱管中捣毁脊髓，插入椎管时，青蛙后肢立即失去紧张性，多数情况出现尿失禁。若脑脊髓破坏完全，可见青蛙四肢松弛，呼吸消失。剥皮：自青蛙的两侧腋部以下完全剥离皮肤（注意:可事先剪去尾椎末端及泄殖腔附近皮肤，使剥离更容易）。而后倒提青蛙腿，使其头部向下，用手术剪横向剪开腹部肌肉，看清脊神经后，用粗剪刀剪断脊柱。右手捏住断端边缘皮肤，向下剥去全部后肢皮肤，将标本置于盛有生理盐水的培养皿中。将手和用过的器械洗净后再进行以下步骤（a）分离两腿：用粗剪刀纵向剪开脊柱（尾扛骨留在一侧)和与后两肢相连的肌肉，再用粗剪刀剪开趾骨联合。将已分离的标本浸入盛有生理盐水的培养皿中。（b）剪断股骨17 ：取一条腿，先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹腔部，然后用固定针将标本背部认清坐骨固定于干净的蛙板上。用玻璃分针循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟，纵向分离暴露坐骨神经的大腿部分，直至分离至腘窝神经分叉处。然后剪断二头肌、半膜肌和半膜肌肌腱，并绕至前方剪断股四头肌腱[18]。（c）游离腓肠肌：用玻璃分针或镊子分离腓肠肌与跟腱，并穿线结扎。在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，用手术剪剪去其周围组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系。完成腓肠肌标本：用粗剪刀自膝关节周围向上剪除并刮净所有大腿肌肉，巨膝关节约1cm处剪断股骨。弃去上段股骨，保留部分即为腓肠肌标本。将标本放入盛有生理盐水的培养皿中待用。检验标本用手术镊轻提标本的脊椎片再用经0.7%蛙类生理盐水蘸湿的锌铜弓接触坐骨神经，如腓肠肌发生收缩，则表示标本机能正常。轻提腓肠肌上的结扎线，将标本放入各实验组0.7%蛙类生理盐水中浸泡稳定15-20分钟后进行实验。3.2骨骼肌收缩信号采集实验3.2.1仪器连接将标本的股骨头固定在肌槽的骨头固定孔内，神经搭在肌槽电极上，腓肠肌肌腱上的扎线与张力换能器接头相连，换能器输出端与计算机1通道，刺激电极与坐骨神经相连，电极接头与计算机程控刺激器输出端相连。调节好扎线的张力，不可过松或过紧，以使肌肉自然拉平为宜（保证肌肉一旦收缩，即可牵动张力传感器的应变梁）[19]。另外腓肠肌在双层玻璃槽中设有流加浸润装置，以防止测定过程中标本的挪动以及干燥，使得测定出现人为误差。3.2.2基本参数单收缩曲线的测定：单刺激；延时：20ms；强度：0.8v；波宽：1.0ms；放大倍数：20倍；DC：30Hz；扫描速度：62.5ms/div阈强度的测定：起始刺激：0.3v；增量：0.5v；刺激时间间隔：30ms；刺激次数：25；延时：50ms；波宽：1.0ms3.2.3分组及处理将3.1.2中稳定好的标本分三组进行实验，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别浸润5min、10min、15min三个时间段，每组依次用0.7%蛙类生理盐水（作为阴性对照组）、低浓度（0.25g/ml）、17 中浓度（0.5g/ml）、高浓度（1g/ml）的千斤拔水提液浸润、0.7%西洋参胶囊溶液（作为阳性对照组）。3.2.4腓肠肌收缩特性的鉴定将仪器连接完毕以后，进行骨骼肌单收缩分析，单击菜单“实验项目”在肌肉神经实验中选定“刺激强度与反应的关系”项单击，出现对话框后选择单收缩实验并设定3.2.2基本参数后便进入实验的刺激以及监视。启动刺激开关后，当肌肉出现收缩时，记录阈强度每一组测3次；当显示通道出现最大收缩反应的完整单收缩曲线（共记录25个曲线）时，测量单收缩的四个时期：潜伏期、收缩幅度、收缩期与舒张期。3.2.5数据记录以及统计学分析从25个单收缩曲线中随机抽取5个，测量每个已抽取的单收缩曲线的潜伏期（ms），收缩幅度（g），收缩时间（ms）舒张时间（ms），并利用公式计算：收缩速率=收缩幅度/收缩时间，舒张速率=收缩幅度/舒张时间[20]；分别取3次阈强度（v）测定值的平均值。采用origin7.5统计软件对实验数据进行t检测，分别检测千斤拔水提液剂量组各收缩指标与空白组之间的差异显著性，各数据均采用表示。4.实验结果4.1骨骼肌收缩信号采集实验4.1.1千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌阈强度的影响如表1所示，阴性对照组中各腓肠肌的阈强度无明显变化，且西洋参对照组与阴性对照组的域强度变化基本一致。与阴性对照组相比，Ⅰ组浸润腓肠肌低、中、高浓度的阈强度均降低，差异有极显著统计学意义(P<0.01，P<0.05)；Ⅱ组浸润溶液为低浓度、中浓度和高浓度时阈强度随药液浓度增加先降低后升高，差异有统计学意(P<0.05)；Ⅲ组千斤拔水提液低、中、高浓度时，阈强度先降低后升高,差异有极显著统计学意义(P<0.01)。与西洋参对照组相比，Ⅰ组浸润腓肠肌低、中、高浓度的阈强度均降低，低、中浓度时差异有极显著统计学意义(P<0.01)，高浓度时差异有显著统计学意义(P<0.05)；Ⅱ组浸润溶液为低浓度、中浓度时域强度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；17 高浓度时阈强度升高，差异有极显著统计学意义(P<0.01)；Ⅲ组浸润溶液为低、中、高浓度时域强度先降低后升高，差异有极显著统计学意义(P<0.01，P<0.05)；西洋参对照组与阴性对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组腓肠肌的腓肠肌的阈强度均降低，但降低幅度并不明显，Ⅰ组差异有极显著统计学意义(P<0.01)，Ⅱ组差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ组差异无统计学意义(P>0.05)。表明当千斤拔水提液浓度较低且处理时间较短时,坐骨神经腓肠肌的阈强度降低(P<0.01),即兴奋性升高；随着千斤拔水提液浓度的升高，处理时间的延长阈强度升高(P<0.05，P>0.05),即兴奋性降低,甚至低于用药前水平。据记录以及统计学分析表1千斤拔对青蛙坐骨神经腓肠肌阈强度（/v）的影响（）Table1FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfeimpactonfrogsciaticgastrocnemiusthresholdintensity(/v)（）分组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组阴性对照组（0.7%g/ml）0.358±0.0140.388±0.1110.321±0.009低浓度（0.25g/ml）0.298±0.012**▲▲0.363±0.144*▲0.290±0.020**▲▲中浓度（0.5g/ml）0.306±0.037**▲▲0.375±0.026*▲0.361±0.010**▲▲高浓度（1g/ml）0.318±0.093**▲0.408±0.032*▲▲0.377±0.012**▲▲西洋参对照组（0.7%g/ml）0.320±0.025**0.349±0.009*0.299±0.006与阴性对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.014.1.2千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩幅度的影响结果见表2。腓肠肌随着药液浸润时间的增加，阴性对照组腓肠肌的收缩幅度无明显变化。与阴性对照组相比，Ⅰ组收缩幅度随药液浓度的增加先升高后降低，低浓度收缩幅度升高不明显，差异有统计学意义（P<0.05）；中浓度时腓肠肌的收缩幅度升高明显，差异有极显著的意义（P<0.01）；高浓度时腓肠肌的收缩幅度极显著低于用药前水平(P<0.01)。Ⅱ17 组收缩幅度随药液浓度的增加先升高后降低，差异均有极显著意义(P<0.01)。Ⅲ组收缩幅度随药液浓度的增加先升高后降低，低浓度收缩幅度升高不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；中、高浓度时腓肠肌的收缩幅度下降显著，差异有极显著意义(P<0.01)。与西洋参对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组收缩幅度均随药液浓度的增加先升高后降低，腓肠肌的收缩幅度变化显著，差异均有极显著意义(P<0.01)。西洋参对照组与阴性对照组相比，Ⅰ组收缩幅度略有降低，差异有统计学意义（P<0.05）；Ⅱ、Ⅲ组收缩幅度降低明显，差异有极显著统计学意义(P<0.01)。由表2可知，在低浓度时，腓肠肌的收缩幅度得到了提高(P<0.01，P<0.05)；中浓度时，收缩幅度随着浸润时间变长而减小(P<0.01)；高浓度时，收缩幅度相对用药前水平降低非常明显且随时间变长而降低(P<0.01)。表2千斤拔对青蛙坐骨神经腓肠肌收缩幅度（/g）的影响（）Table2FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfeimpactonfrogsciaticgastrocnemiusContractionamplitude(/g)（）分组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组阴性对照组（0.7%g/ml）9.118±0.1208.192±0.1809.856±0.174低浓度（0.25g/ml）9.444±0.976*▲▲9.776±0.356**▲▲9.992±0.341▲▲中浓度（0.5g/ml）10.378±0.273**▲▲8.328±0.161**▲▲6.318±0.0258**▲▲高浓度（1g/ml）2.554±0.201**▲▲1.958±0.227**▲▲1.880±0.217**▲▲西洋参对照组（0.7%g/ml）8.355±0.015*7.255±0.015**7.386±0.096**与阴性对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.014.1.3千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩速率的影响腓肠肌随着药液浸润时间的增加，用药前腓肠肌的收缩速率无明显变化。见表3。与阴性对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组收缩速率均随着药液浓度的增加先升高后降低，差异都有极显著意义(P<0.01)。与西洋参对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ17 三组收缩速率均随药液浓度的增加先升高后降低，差异均有极显著意义(P<0.01)。西洋参对照组与阴性对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组腓肠肌的收缩速率均有所升高，差异有极显著统计学意义(P<0.01)。表明腓肠肌在千斤拔水提液的处理下，低浓度时收缩速率升高(P<0.01，P<0.05)，中浓度随着浸润时间变长而收缩速率减小(P<0.01，P<0.05)，高浓度时收缩速率相对用药前水平降低非常明显且随时间变长亦降低(P<0.01)。表3千斤拔对青蛙坐骨神经腓肠肌收缩速率（g/ms）的影响（）Table3FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfeimpactonfrogsciaticgastrocnemiuscontractionraterelaxationrate(g/ms)（）分组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组阴性对照组（0.7%g/ml）0.390±0.0260.368±0.0200.367±0.013低浓度（0.25%g/ml）0.528±0.090**▲▲0.531±0.068**▲▲0.550±0.082**▲▲中浓度（0.5%g/ml）0.291±0.038**▲▲0.284±0.034**▲▲0.290±0.003**▲▲高浓度（1%g/ml）0.264±0.040**▲▲0.263±0.033**▲▲0.236±0.036**▲▲西洋参对照组（0.7%g/ml）0.459±0.031**0.465±0.029**0.459±0.031**与阴性对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.014.1.4千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌舒张速率的影响腓肠肌随着药液浸润时间的增加，用药前腓肠肌的舒张速率无明显变化。见表4。与阴性对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组在低、中、高浓度时，舒张速率均随浓度的增加先升高后降低，Ⅱ组在低浓度时，舒张速率大幅度升高，差异有显著的统计学意义(P<0.05)；其余各组各浓度，差异有极显著意义统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与西洋参对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组舒张速率均随药液浓度的增加先升高后降低，但舒张速率升高并不十分明显，Ⅱ组在低浓度时，差异有显著的统计学意义(P<0.05)；其余各组各浓度，差异有极显著意义统计学意义(P<0.01，P<0.05)。西洋参对照组与阴性对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ17 三组腓肠肌的舒张速率均有所升高，差异有极显著的意义(P<0.01)。表明腓肠肌在千斤拔水提液的处理下，低浓度时舒张速率升高(P<0.01，P<0.05)，中浓度时随着浸润时间变长而舒张速率减小(P<0.01)，高浓度时舒张速率相对用药前水平降低非常明显且随时间变长亦降低(P<0.01)。见表4。表4千斤拔对青蛙坐骨神经腓肠肌舒张速率（g/ms）的影响（）Table4FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfeimpactonfrogsciaticgastrocnemiusrelaxationrate(g/ms)（）分组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组阴性对照组（0.7%g/ml）0.390±0.0260.369±0.0190.386±0.002低浓度（0.25g/ml）0.528±0.090**▲▲0.531±0.068*▲0.520±0.008**▲▲中浓度（0.5g/ml）0.291±0.038**▲▲0.285±0.034**▲▲0.250±0.030**▲▲高浓度（1g/ml）0.264±0.039**▲▲0.264±0.033**▲▲0.263±0.030**▲▲西洋参对照组（0.7%g/ml）0.465±0.029**0.465±0.029**0.479±0.033**与阴性对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.014.1.5千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌潜伏期的影响结果见表5，随着药液浸润时间的增加,用药前坐骨神经徘肠肌的潜伏期无明显变化。与阴性对照组相比，Ⅰ组低、中、高浓度潜伏期均小于用药前水平，且潜伏期随着浓度升高而增大，差异均有极显著统计学意义（P<0.01）；Ⅱ组的各浓度数据潜伏期均小于用药前水平，且潜伏期随着浓度升高而增大，低、中浓度时差异有极显著统计学意义（P<0.01）,高浓度时差异无统计学意义（P>0.05）；Ⅲ组低、中浓度时潜伏期降低，差异有极显著统计学意义（P<0.01），高浓度时腓肠肌的潜伏期升高，大于用药前水平，差异有显著统计学意义（P<0.05）。与西洋参对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组腓肠肌的潜伏期随药液浓度的增加而降低，Ⅱ组高浓度时腓肠肌的潜伏期变化并不明显，差异无统计学意义（P>0.05）；其余各组各浓度腓肠肌潜伏期变化幅度较大，17 差异均有极显著统计学意义（P<0.01）。西洋参对照组和阴性对照组相比，Ⅰ组和Ⅱ组腓肠肌的潜伏期均有所降低，但变化并不明显，差异无统计学意义（P>0.05）；Ⅲ组腓肠肌的潜伏期降低幅度较大，差异有显著统计学意义（P<0.05）。通过对实验数据的对比分析，表明青蛙坐骨神经腓肠肌的潜伏期受浸润溶液中千斤拔浓度的影响。青蛙坐骨神经腓肠肌的潜伏期随着千斤拔浓度的增加先降低后升高，但整体呈现一个降低的趋势。表5千斤拔对青蛙坐骨神经腓肠肌潜伏期（/ms）的影响（）Table5FlemingiaphilippinensisMerr.etRolfeimpactonfrogsciaticgastrocnemiusincubation(/ms)（）分组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组阴性对照组（0.7%g/ml）12.150±0.85711.383±1.11612.473±1.582低浓度（0.25g/ml）8.813±0.216**▲▲9.185±0.254**▲▲11.00±0.300**▲▲中浓度（0.5g/ml）9.967±0.189**▲▲10.724±0.161*▲▲11.02±0.526**▲▲高浓度（1g/ml）11.46±0.361**▲▲11.315±0.10312.716±0.125*▲▲西洋参对照组（0.7%g/ml）12.116±1.51611.338±1.44611.733±0.517*与阴性对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组相比：▲P<0.05，▲▲P<0.015.讨论5.1千斤拔水提液活性物质对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩特性的影响近年来，对千斤拔的研究已经取得了初步的进展，涉及其化学成分、药理作用、提取工艺等多个方面，研究水平日趋深入，研究领域不断扩大。研究表明，千斤拔含多种黄酮类化合物，已确定结构有：蔓性千斤拔素（flemiphilippinin）C、D。此外还含5，7，3＇，4＇-四羟基-6，8-双异戊烯基异黄酮（5，7，3’，4＇-tetrahydroxy-6,8-diprenylisoflavone），千斤拔素（flemichin）D，羽扇豆醇（lupeol），β-谷甾醇（β-sitosterol）以及碳原子数为22-30的正烷酸。千斤拔具有补气血，助阳道等药理作用，但黄酮类是否为千斤拔药理作用的活性物质基础还有待进一步研究。17 另外，毛俐等[14]也发现千斤拔所含微量元素中钙离子含量最多。在正常生理条件的基础之上,人为在神经肌肉接头处加入非毒剂量Ca2+之后,由于进入神经肌肉接头处的Ca2+增多,就会使更多的SNARE复合物与Syt蛋白在Ca2+介导下结合,形成更多融合孔使更多神经递质释放,从而使得腓肠肌收缩曲线振幅增大。证明Ca2+可以加强神经的兴奋性,即其可以促进神经递质的释放。神经肌肉接头处,相当于中枢的突触小体,二者的作用机制相同,故可以依此来代替中枢突触小体进行实验[21]。所以探讨千斤拔对骨骼肌收缩作用将会对研究中枢神经兴奋传递，神经肌肉兴奋机制具有相当重要的意义。本实验使用水煎法提取千斤拔的生药成分，选用骨骼肌收缩实验的研究，证明千斤拔水提液对骨骼肌收缩特性的影响效果，由千斤拔成分富含钙离子等神经兴奋成分为研究切入点，千斤拔水提液对神经肌肉的作用可能与钙离子的作用有类似，千斤拔水提液可以在适合浓度下促进神经递质的释放，但在千斤拔的高浓度和长时间浸润过程中也可能受到其他成分的合力影响，使得神经肌肉的兴奋同化更强或者异化抑制。5.2千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌收缩能力的影响骨骼肌收缩实验结果表明，千斤拔水提液对增强骨骼肌兴奋性、收缩幅度，收缩速率、舒张速率有明显作用，低生药浓度时，对骨骼肌各收缩指标有增强作用，但超过一定的浓度和时间，千斤拔对骨骼肌的收缩也起到了明显的抑制作用。然而千斤拔对骨骼肌潜伏期的影响并不明显，说明千斤拔并没有影响到终板处递质的释放以及兴奋向肌肉深处的传导这一过程，即未影响神经肌肉兴奋信号传递的速度，但该结果及其机制还需要进一步的验证。孙洪兆等[20]对钙离子研究显示，低钙溶液极显著性的增强了蟾蜍离体腓肠肌的收缩能力,而高钙溶液极显著性的抑制了蟾蜍离体腓肠肌的收缩。本实验宏观地研究了生药千斤拔水提液对神经肌肉的影响，说明千斤拔可能与钙离子一样，影响神经肌肉接头的细胞膜电位，影响神经传导以及影响钙离子通过离子通道在突触小体的传递释放机制。可见本实验方案通过测定坐骨神经腓肠肌标本的收缩情况,可以宏观地反映千斤拔水提液影响神经递质释放的机制。实验结果中，高浓度千斤拔溶液抑制了离体腓肠肌的收缩,其原因可能是千斤拔水提液使得细胞外液钙离子浓度的增加并通过某种途径导致肌细胞内肌质网钙离子释放的量减少从而导致肌肉收缩能力的下降。而17 低浓度的千斤拔溶液促进了离体腓肠肌的收缩；其原因可能是由于腓肠肌暂时缺失中枢对钙离子调节而导致千斤拔溶液中的钙离子进行了短暂受体竞争，所以也可用此解释实验结果中短时间内低浓度千斤拔溶液有兴奋作用的效果。综上所述，该研究显示，日常生活中利用千斤拔进行保健作用或者作为食用材料时，应避免千斤拔用量过大或者长时间煎熬，避免对健康造成影响。至于低浓度千斤拔对离体骨骼肌兴奋作用和高浓度千斤拔对离体骨骼肌抑制作用的微观分子机制,本研究尚未涉及,有待继续研究，做进一步的考证，千斤拔对腓肠肌产生作用的真正的具体的活性物质和机理还有待进一步的研究确定，并应对其进行质量标准控制，为对千斤拔生理研究提供更可靠的依据。5.3千斤拔药理作用的研究展望千斤拔成分复杂，目前，千斤拔药理作用的具体活性物质和机理尚不十分明确，还有待进一步研究确定，并对其进行质量标准控制。本次研究只是初步探讨了千斤拔水提液对青蛙离体坐骨神经腓肠肌的影响，影响效果明显，但是起影响作用的具体活性物质和分子机理有待进一步研究确定。千斤拔所含的异黄酮类、酚类、鞣质、糖类、甾醇、生物碱和氨基酸类等药理药效研究还很少，因此，值得对其开发利用并进行深入的研究。此外，以期找到其发挥作用的确切活性物质，这就要求我们对其要有更深入的了解，对它的研究方法，更深层次开发等都要求我们对其展开进一步的调查和研究。17 致谢光阴似箭，日月如梭，时间流逝得很快，转眼间，大学生活即将过去，本人从进入×××生命科学与技术学院制药工程专业（生物制药方向）学习以来，我要向所有给予我关怀、教诲、支持和帮助的人致以我最诚挚的感谢！在此首先要感谢我的导师王××教授。王老师不但学识渊博,而且工作严谨负责。王老师虽然平时工作繁多，但她还是经常抽空耐心指导我完成实验，并时常询问我的专业学习情况。在我做毕业论文设计的过程中，从查阅资料到开题报告草案的确定和修改，中期检查，后期试验阶段，毕业论文的起稿和修改等整个过程她都给予了我悉心的指导。其次要感谢在本次论文的实验与写作期间，帮助过我的黎老师、苏老师、梁老师等等，通过他们提供的设备、器材、实验药品等，我此次的论文实验才能顺利地完成。春风化雨，感谢师恩，愿和蔼可亲的老师们在研究的方向开拓更高更新的领域。再者，我还要感谢×××、×××、×××师兄师姐们，是他们一步步地带领着我，让我从一无所知到能熟练掌握实验操作。还有本实验室实验组的各位成员（王娟、、潘言、麦小杰、梁芳、杨明、陶娟同学）及制药12班的李楠、郑玲等帮助过我的同学，正是因为有了他们的相伴和帮助，繁重的实验任务才得以顺利完成，在此我深表感谢！最后感谢×××学院，给我提供这样一个良好而广阔的学习平台，引导我树立了积极向上、乐观的人生态度，培养我踏实严谨的做事风格，让我能够放飞理想。我会在以后的人生道路上，不断地完善自己，提高自己，努力实现个人的自身价值和社会价值，回报母校，回报社会。17 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