GB5009.240-2016食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定.pdf 21页

'中华人民共和国国家标准GB5009.240—2016食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定2016-08-31发布2016-09-20实施中华人民共和国发布国家卫生和计划生育委员会 GB5009.240—2016前言本标准代替GB/T25228—2010《粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法》、SN/T1958—2007《进出口食品中伏马毒素B1残留量检测方法酶联免疫吸附法》、SN/T1572—2005《进出口粮谷中伏马毒素检验方法高效液相色谱法》。本标准将以上标准进行了整合,主要修订如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定”;———伏马毒素种类增加为伏马毒素B1、B2、B3三种;———增加了免疫亲和柱净化-柱后衍生液相色谱法作为第一法;———增加了液相色谱-串联质谱法作为第二法;———取消荧光光度法;———改变了样品提取溶液;———改变了免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法流动相的组成。Ⅰ GB5009.240—2016食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定1范围本标准规定了玉米及其制品中伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3(以下简写为FB1、FB2、FB3)的测定方法。本标准第一法为柱后衍生液相色谱法,第二法为液相色谱-串联质谱联用法,第三法为柱前衍生液相色谱法,适用于玉米及其制品中伏马毒素的测定。第一法免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法2原理样品用乙腈-水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱净化,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。经高效液相色谱分离后柱后邻苯二甲醛衍生,荧光检测,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.3乙酸(CH3COOH)。3.1.4氢氧化钠(NaOH)。3.1.5氯化钠(NaCl)。3.1.6磷酸氢二钠(Na2HPO4)。3.1.7磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.8氯化钾(KCl)。3.1.9硼砂(Na2B4O7·10H2O)。3.1.102-巯基乙醇(C2H6OS)。3.1.11邻苯二甲醛(OPA,C8H6O2)。3.1.12吐温-20(C58H114O26)。3.2溶液配制3.2.1甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,加入到999mL水中,混合均匀。3.2.2乙腈-水溶液(50+50):分别量取500mL乙腈和500mL水,混合均匀。3.2.3乙腈-水溶液(20+80):分别量取200mL乙腈和800mL水,混合均匀。1 GB5009.240—20163.2.4甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均匀。3.2.5氢氧化钠溶液(1mol/L):准确称取氢氧化钠4.0g,溶于100mL水,混合均匀。3.2.6磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用980mL水溶解,用盐酸调整pH至7.4,用水稀释至1000mL,混合均匀。3.2.7吐温-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐温-20,加入磷酸盐缓冲液(3.2.6)并稀释至1000mL,混合均匀。3.2.8硼砂溶液(0.05mol/L,pH10.5):称取硼砂19.1g,溶于980mL水中,用氢氧化钠溶液调pH至10.5,用水稀释至1000mL,混合均匀。3.2.9衍生溶液:称取2.0g邻苯二甲醛,溶于20mL甲醇中,用硼砂溶液(0.05mol/L,pH10.5)(3.2.8)稀释至500mL,加入2-巯基乙醇500μL,混匀,装入棕色瓶中,现用现配。3.3标准品3.3.1伏马毒素B1(FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。3.3.2伏马毒素B2(FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。3.3.3伏马毒素B3(FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3各0.01g(精确至0.0001g)至小烧杯中,用乙腈-水溶液(3.2.2)溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保存。有效期6个月。3.4.2混合标准溶液:准确吸取FB1标准储备液1mL、FB2和FB3标准储备液0.5mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(3.2.2)稀释至刻度,得到FB1浓度为10μg/mL、FB2和FB3浓度为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1浓度为1μg/mL、FB2和FB3浓度为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6个月。3.4.3混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(3.2.3)稀释,配制成FB1浓度依次为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB2和FB3浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液。4仪器和设备4.1高效液相色谱仪,带荧光检测器。4.2柱后衍生系统。4.3天平:感量0.01g和0.0001g。4.4均质器。4.5振荡器。4.6氮吹仪。4.7离心机:转速≥4000r/min。4.8免疫亲和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)(柱容量及柱回收率验证方法参见附录B)。注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。4.9微孔滤膜:0.45μm,有机型。5分析步骤5.1样品制备将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm,混匀分成2份作2 GB5009.240—2016为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。玉米油样品直接取2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。在制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。5.2试样提取准确称取固体样品5g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中,加入20mL乙腈-水溶液(3.2.2),涡旋或振荡提取20min,取出后,在4000r/min下离心5min,将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品,提取液在下层。5.3试样净化取2.0mL提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液(3.2.7),混合均匀后过免疫亲和柱,流速控制在1mL/min~3mL/min,用10mLPBS缓冲液淋洗免疫亲和柱,分别用1mL甲醇-乙酸溶液(3.2.4)洗脱免疫亲和柱三次,收集洗脱液,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(3.2.3)溶解残渣。涡旋30s,过0.45μm微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。注:由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同,实际操作时,请参照厂商提供的操作说明和程序使用。5.4仪器参考条件色谱柱:C18色谱柱:250mm×4.6mm,5μm,或相当者。检测波长:激发波长335nm;发射波长440nm。流动相:A:甲酸水溶液(3.2.1);B:甲醇。梯度洗脱,洗脱程序见表1。流动相流速:0.8mL/min。衍生液流速:0.4mL/min。柱温:40℃。反应器温度:40℃。进样量:50μL。表1流动相洗脱程序时间流动相A流动相Bmin%%0.0045.055.02.0045.055.09.0030.070.014.0010.090.014.5010.090.015.0045.055.022.0045.055.05.5试样溶液的测定在5.4项色谱条件下,将50.0μL系列伏马毒素混合标准工作溶液(3.4.3)按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪;待仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x轴),目标物质的峰面积为纵坐标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(1)计算:3 GB5009.240—2016y=ax+b………………………………(1)式中:y———目标物质的峰面积比;a———回归曲线的斜率;x———目标物质的浓度;b———回归曲线的截距。标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果样品含量超过标准曲线范围,需稀释后再测定。5.6空白试验不称取试样,按5.2和5.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6分析结果的表述待测样品中FB1、FB2、FB3的含量按式(2)计算:ci×V×fX=…………………………(2)m式中:X———待测样品中FB1、FB2、FB3的含量,单位为微克每千克(μg/kg);ci———待测物进样液中FB1、FB2、FB3的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);V———定容体积,单位为毫升(mL);f———试液稀释倍数;m———样品的称样量,单位为克(g)。注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留两位有效数字。7精密度样品中伏马毒素含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8其他当称样量为5g时,FB1、FB2、FB3的检出限分别为17μg/kg、8μg/kg、8μg/kg;定量限分别为50μg/kg、25μg/kg、25μg/kg。第二法液相色谱-串联质谱法9原理样品加入同位素内标,乙腈-水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱或强阴离子交换固相萃取柱净化,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的伏马毒素经过高效液相色谱分离,串联质谱检测,同位素内标法定量。4 GB5009.240—201610试剂和材料除非另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂10.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。10.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。10.1.3乙酸(CH3COOH)。10.1.4氯化钠(NaCl)。10.1.5磷酸氢二钠(Na2HPO4)。10.1.6磷酸二氢钾(KH2PO4)。10.1.7氯化钾(KCl)。10.1.8吐温-20(C58H114O26)。10.2溶液配制10.2.1甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,溶于1L水,混合均匀。10.2.2乙腈-甲醇溶液(50+50):分别量取500mL甲醇和500mL乙腈,混合均匀。10.2.3乙腈-水溶液(50+50):分别量取500mL乙腈和500mL水,混合均匀。10.2.4乙腈-水溶液(20+80):分别量取200mL乙腈和800mL水,混合均匀。10.2.5甲醇-水溶液(60+20):分别量取600mL甲醇和200mL水,混合均匀。10.2.6甲醇-乙酸溶液(99+1):吸取1mL乙酸,加入到99mL甲醇中,混合均匀。10.2.7甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均匀。10.2.8磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用980mL水溶解,用盐酸调整pH至7.4,用水稀释至1000mL,混合均匀。10.2.9吐温-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐温-20,加入磷酸盐缓冲液(10.2.8)并稀释至1000mL,混合均匀。10.3标准品10.3.1FB1、FB2、FB3标准品伏马毒素B1(FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。伏马毒素B2(FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。伏马毒素B3(FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。1310.3.2C34-伏马毒素B1、B2、B3同位素内标1313C34-伏马毒素B1(C34-FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。1313C34-伏马毒素B2(C34-FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。1313C34-伏马毒素B3(C34-FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。注:在检测中可以只使用1313C34-FB1一种同位素内标,但需要对被测定试样基质进行加标实验,评估和确定C34-FB1与其他被测伏马毒素的基质效应。或使用基质匹配校正曲线。10.4标准溶液配制10.4.1标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3各0.01g(精确至0.0001g)至小烧5 GB5009.240—2016杯中,用乙腈-水溶液(10.2.3)溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保存。有效期6个月。10.4.2混合标准溶液:准确吸取FB1标准储备液1mL、FB2和FB3标准储备液0.5mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(10.2.3)稀释至刻度,得到FB1浓度为10μg/mL、FB2和FB3浓度分别为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1浓度为1μg/mL、FB2和FB3浓度分别为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存。有效期6个月。13131310.4.3混合同位素标准溶液:准确吸取C34-FB1(25μg/mL)、C34-FB2(10μg/mL)、C34-FB3(10/mL)各1mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(10.2.3)稀释至刻度,得到含13μgC34-FB11313132.5μg/mL、C34-FB2和C34-FB31μg/mL的混合同位素标准溶液。再稀释10倍,得到含C34-FB11313250ng/mL、C34-FB2和C34-FB3100ng/mL的混合同位素标准工作溶液。有效期6个月。10.4.4混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(10.2.4)稀释,加入混合同位素标准工作溶液(10.4.3),配制成FB1浓度依次为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB2和FB3浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液,每个标准工作溶液中含有131313C34-FB125ng/mL、C34-FB2和C34-FB310ng/mL。11仪器和设备11.1高效液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源。11.2天平:感量0.01g和0.0001g。11.3均质器。11.4振荡器。11.5氮吹仪。11.6离心机:转速≥4000r/min。11.7强阴离子交换固相萃取柱(硅胶基,6mL,500mg)。11.8免疫亲和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)。(柱容量及柱回收率验证方法参见附录B)注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。11.9微孔滤膜:0.22μm,有机型。12分析步骤12.1样品制备将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm,混匀分成2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。玉米油样品直接取2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。在制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。12.2试样提取准确称取固体样品5g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中,加入混合同位素标准工作溶液(10.4.3)400μL,加入20mL乙腈-水溶液(10.2.3),涡旋或振荡提取20min,取出后,在4000r/min下离心5min,将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品,提取液在下层。6 GB5009.240—201612.3试样净化12.3.1免疫亲和柱净化取2.0mL提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液(10.2.9),混合均匀后过免疫亲和柱,流速控制在1mL/min~3mL/min,用10mLPBS缓冲液(10.2.8)淋洗免疫亲和柱,分别用1mL甲醇-乙酸溶液(10.2.7)洗脱免疫亲和柱三次,收集洗脱液,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(10.2.4)溶解残渣。涡旋30s,过0.22μm微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。注:由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同,实际操作时,请参照厂商提供的操作说明和程序使用。12.3.2强阴离子交换固相萃取柱净化取3mL提取液,加入8mL甲醇-水溶液(10.2.5),混合均匀后过强阴离子交换固相萃取柱(使用前按要求活化),分别用8mL甲醇-水溶液(10.2.5)和3mL甲醇淋洗,用10mL甲醇-乙酸溶液(10.2.6)洗脱,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(10.2.4)溶解残渣。涡旋30s,过0.22μm微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。12.4仪器参考条件12.4.1液相色谱条件色谱柱:C18柱,100mm×2.1mm,1.7μm,或相当者。流动相:A:甲酸水溶液(0.1%);B:乙腈-甲醇溶液(50+50)。梯度洗脱,梯度见表2。流速:0.35mL/min。柱温:30℃。进样量:10μL。表2流动相梯度洗脱程序时间流动相A流动相Bmin%%0.0070.030.02.3030.070.04.0030.070.04.2001004.8001005.0070.030.012.4.2质谱参数离子化模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+)。质谱扫描方式:多反应离子监测(MRM)。监测离子对信息见表3,其他仪器参考条件见附录C。7 GB5009.240—2016表3质谱参数定量碰撞能量定性碰撞能量毒素名称母离子子离子eV子离子eVFB17223522533435FB27063363535430FB3706336353543013C34-FB1756374353564013C34-FB2740358353763013C34-FB3740358353763012.5定性判定用液相色谱-串联质谱联用法对样品进行定性判定,在相同试验条件下,样品中应呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰,被测物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致;样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表4规定范围,则可以判断样品中存在对应的目标物质。表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度(k)k≥50%50%>k≥20%20%>k≥10%k≤10%允许的最大偏差±20%±25%±30%±50%12.6定量测定在5.4液相色谱-串联质谱联用分析条件下,将10.0μL系列伏马毒素混合标准溶液(10.4.4)按浓度从低到高依次注入液相色谱串联质谱联用仪;待仪器条件稳定后,以目标物质和内标的浓度比为横坐标(x轴),目标物质和内标的峰面积比为纵坐标(y轴),对各个数值点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(3)计算:y=ax+b………………………………(3)式中:y———目标物质/内标的峰面积比;a———回归曲线的斜率;x———目标物质/内标的浓度比;b———回归曲线的截距。标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果含量超过标准曲线范围,则重新取样,增加相应内标添加量,使内标浓度与待测液浓度相匹配,然后稀释到适当浓度后分析。12.7空白试验不称取试样,按12.2和12.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。8 GB5009.240—201613分析结果的表述本方法采用内标法定量。含量按式(4)计算:c×ci×A×Asi×VX=…………………………(4)csi×Ai×As×m式中:X———样品中待测组分的含量,单位为微克每千克(μg/kg);c———标准溶液中待测组分的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);ci———测定液中待测组分的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);A———测定液中待测组分的峰面积;Asi———标准溶液中内标物质的峰面积;V———定容体积,单位为毫升(mL);csi———标准溶液中内标物质的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);Ai———测定液中内标物质的峰面积;As———标准溶液中待测组分的峰面积;m———样品称样量,单位为克(g)。注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留两位有效数字。14精密度样品中伏马毒素含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。15其他当称样量为5g时,FB1、FB2、FB3的检出限分别为7μg/kg、3μg/kg、3μg/kg;定量限分别为20μg/kg、10μg/kg、10μg/kg。第三法免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法16原理样品用乙腈-水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱净化,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的伏马毒素经过OPA衍生后进高效液相色谱分离,荧光检测,外标法定量。17试剂和材料除非另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂17.1.1甲醇(CH3OH):色谱纯。9 GB5009.240—201617.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。17.1.3乙酸(CH3COOH)。17.1.4氢氧化钠(NaOH)。17.1.5氯化钠(NaCl)。17.1.6磷酸氢二钠(Na2HPO4)。17.1.7磷酸二氢钾(KH2PO4)。17.1.8氯化钾(KCl)。17.1.9硼砂(Na2B4O7·10H2O)。17.1.102-巯基乙醇(C2H6OS)。17.1.11邻苯二甲醛(OPA,C8H6O2)。17.1.12吐温-20(C58H114O26)。17.2溶液配制17.2.1甲酸铵-甲酸水溶液(0.1mol/L,pH:3.3):称取6.3g甲酸铵,溶于980mL水中,用甲酸调pH至3.3,用水稀释至1000mL,混合均匀。17.2.2乙腈-水溶液(50+50):分别量取500mL乙腈和500mL水,混合均匀。17.2.3乙腈-水溶液(20+80):分别量取200mL乙腈和800mL水,混合均匀。17.2.4甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均匀。17.2.5氢氧化钠(1mol/L)溶液:准确称取氢氧化钠4.0g,溶于100mL水,混合均匀。17.2.6磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用980mL水溶解,然后用盐酸调整pH至7.4,最后用水稀释至1000mL,混合均匀。17.2.7吐温-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐温-20,加入磷酸盐缓冲液(17.2.6)并稀释至1000mL,混合均匀。17.2.8硼砂溶液(0.1mol/L):称取硼砂3.8g,用水溶解并稀释至100mL,混合均匀。17.2.9衍生溶液:准确称取40mg邻苯二甲醛,溶于1mL的甲醇中,用硼砂溶液(0.1mol/L)(17.2.8)5mL稀释,加入2-巯基乙醇50μL,混合均匀,装入棕色瓶中,现用现配。17.3标准品FB1、FB2、FB3标准品:伏马毒素B1(FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。伏马毒素B2(FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。伏马毒素B3(FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。17.4标准溶液配制17.4.1标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3各0.01g(精确至0.0001g)至小烧杯中,用乙腈-水溶液(17.2.2)溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保存。有效期6个月。17.4.2混合标准溶液:准确吸取FB1标准储备液1mL、FB2和FB3标准储备液各0.5mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(17.2.2)稀释至刻度,得到FB1浓度为10μg/mL、FB2和FB3浓度分别为5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1浓度为1μg/mL、FB2和FB3浓度为0.5μg/mL的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6个月。10 GB5009.240—201617.4.3混合标准工作液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(17.2.3)稀释,配制成FB1浓度依次为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB2和FB3浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液。18仪器和设备18.1高效液相色谱仪,带荧光检测器。18.2天平:感量0.01g和0.0001g。18.3均质器。18.4振荡器。18.5氮吹仪。18.6离心机:转速≥4000r/min。18.7免疫亲和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)(柱容量及柱回收率验证方法参见附录A.2)。注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。18.8微孔滤膜:0.45μm,有机型。18.9秒表。19分析步骤19.1样品制备将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm,混匀分成2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。玉米油样品直接取2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。在制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。19.2试样提取准确称取固体样品5g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中,加入20mL乙腈-水(17.2.2),涡旋或震荡提取20min,取出后,在4000r/min下离心5min,将上清液转移至另一离心管中。玉米油样品操作同固体样品,提取液在下层。19.3试样净化取2.0mL提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液(17.2.7),混合均匀后过免疫亲和柱,流速控制在1mL/min~3mL/min,用10mLPBS缓冲液淋洗免疫亲和柱,分别用1mL甲醇-乙酸溶液(17.2.4)洗脱免疫亲和柱三次,收集洗脱液,55℃下氮吹至干,加入500μL乙腈-水溶液(17.2.2)溶解残渣。涡旋30s,过0.45μm微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。注:由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同,实际操作时,请参照厂商提供的操作说明和程序使用。19.4衍生取100μL标准溶液或样品溶液于进样瓶中,加入100μL衍生溶液(17.2.9),涡旋混合30s,在2min内进样分析。11 GB5009.240—201619.5仪器参考条件色谱柱:C18柱,150mm×4.6mm,5μm或相当者。检测波长:激发波长335nm;发射波长440nm。流动相:A:甲酸铵-甲酸水溶液(17.2.1);B:甲醇。梯度洗脱,洗脱程序见表5。流速:1.0mL/min。柱温:40℃。进样量:50μL。表5流动相洗脱程序时间流动相A流动相Bmin%%0.0030.070.05.0028.072.06.0025.075.011.0022.078.011.1030.070.016.0030.070.019.6试样溶液的测定在12.4色谱条件下,将50.0μL伏马毒素系列混合标准工作溶液(17.4.3)按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪;待仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x轴),目标物质的峰面积为纵坐标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线:y=ax+b………………………………(5)式中:y———目标物质的峰面积比;a———回归曲线的斜率;x———目标物质的浓度;b———回归曲线的截距。标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果样品含量超过标准曲线范围,需稀释后再测定。19.7空白试验不称取试样,按19.2和19.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。20分析结果的表述ci×V×fX=…………………………(6)m式中:X———待测样品中FB1、FB2、FB3的含量,单位为微克每千克(μg/kg);12 GB5009.240—2016ci———待测物进样液中FB1、FB2、FB3的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);V———定容体积,单位为毫升(mL);f———试液稀释倍数;m———样品的称样量,单位为克(g)。注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留两位有效数字。21精密度样品中伏马毒素含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。22其他当称样量为5g时,FB1、FB2、FB3的检出限分别为17μg/kg、8μg/kg、8μg/kg;定量限分别为50μg/kg、25μg/kg、25μg/kg。13 GB5009.240—2016附录A伏马毒素标准品信息伏马毒素标准品信息见表A.1。表A.1伏马毒素标准品信息中文名称英文名称CAS分子式相对分子质量伏马毒素B1FumonisinB1116355-83-0C34H59NO15721.83伏马毒素B2FumonisinB2116355-84-1C34H59NO14705.83伏马毒素B3FumonisinB3136379-59-4C34H59NO14705.8314 GB5009.240—2016附录B免疫亲和柱柱容量及柱回收率验证方法B.1柱容量验证方法在30mL的吐温-20/PBS溶液(0.1%)中加入15μgFB1标准储备溶液,充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱,每根柱的上样量为10mL(5μgFB1)。经上样、淋洗、洗脱,收集洗脱液,用氮气吹干至1mL,用乙腈-水溶液(20+80)定容至10mL,用液相色谱仪分离测定FB1的含量。结果判定:结果FB1≥4.5μg,为柱容量满意。B.2柱回收率验证方法取2.0mL空白样品提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液(0.1%),加入15μgFB1标准储备溶液,用吐温-20/PBS溶液(0.1%)定容至60mL,充分混匀。分别取同一批次3根免疫亲和柱,每根柱的上样量为10mL(2.5μgFB1)。经上样、淋洗、洗脱,收集洗脱液,用氮气吹干至1mL,用乙腈-水溶液(20+80)定容至10mL,用液相色谱仪分离测定FB1的含量。结果判定:结果FB1≥2.0μg,则回收率≥80%,为柱回收率满意。15 GB5009.240—2016附录C仪器参考条件串联质谱参考条件:a)毛细管电压:3.0kV;b)离子源温度:120℃;c)锥孔反吹气流量:50L/h;d)锥孔电压:45V;e)脱溶剂气温度:350℃;f)脱溶剂气流量:800L/h;-5g)碰撞池压力:3.0×10MPa。16 GB5009.240—2016附录D谱图D.1液相色谱-串联质谱联用法谱图液相色谱-串联质谱联用法谱图见图D.1。a)伏马毒素及其同位素内标的标准谱图b)伏马毒素及其同位素内标的玉米样品谱图图D.1液相色谱-串联质谱联用法谱图17 GB5009.240—2016D.2免疫亲和层析净化-柱后衍生高效液相色谱法谱图免疫亲和层析净化-柱后衍生高效液相色谱法谱图见图D.2。a)伏马毒素FB1、FB2、FB3的标准谱图b)伏马毒素FB1、FB2、FB3的玉米样品谱图图D.2免疫亲和层析净化-柱后衍生高效液相色谱法谱图18 GB5009.240—2016D.3免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法谱图免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法谱图见图D.3。a)伏马毒素FB1、FB2、FB3的标准谱图b)伏马毒素FB1、FB2、FB3的玉米样品谱图图D.3免疫亲和层析净化-柱前衍生高效液相色谱法谱图19'