GB5009.84-2016食品安全国家标准食品中维生素B1的测定.pdf 10页

'中华人民共和国国家标准GB5009.84—2016食品安全国家标准食品中维生素B1的测定2016-08-31发布2016-09-20实施中华人民共和国发布国家卫生和计划生育委员会 GB5009.84—2016前言本标准代替GB/T5009.84—2003《食品中硫胺素(维生素B1)的测定》、GB5413.11—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定》、GB/T7628—2008《谷物中维生素B1的测定》、GB/T9695.27—2008《肉与肉制品维生素B1含量测定》。本标准与GB/T5009.84—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素B1的测定”;———增加了高效液相色谱法,作为第一法,将荧光光度法作为第二法;———修改了检出限的表达,增加了方法的定量限;———增加了人造沸石预处理中氯离子的定性鉴别方法;———增加了溴甲酚绿为指示剂时,溶液颜色的变化特征;———删去了图1(反应瓶)和图2(盐基交换管)结构图;———增加了人造沸石以湿重表示时的称取量。Ⅰ GB5009.84—2016食品安全国家标准食品中维生素B1的测定1范围本标准规定了高效液相色谱法、荧光光度法测定食品中维生素B1的方法。本标准适用于食品中维生素B1含量的测定。第一法高效液相色谱法2原理样品在稀盐酸介质中恒温水解、中和,再酶解,水解液用碱性铁氰化钾溶液衍生,正丁醇萃取后,经C18反相色谱柱分离,用高效液相色谱-荧光检测器检测,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1正丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。3.1.2铁氰化钾[K3Fe(CN)6]。3.1.3氢氧化钠(NaOH)。3.1.4盐酸(HCl)。3.1.5乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。3.1.6冰乙酸(CH3COOH)。3.1.7甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.8五氧化二磷(P2O5)或者氯化钙(CaCl2)。3.1.9木瓜蛋白酶:应不含维生素B1,酶活力≥800U(活力单位)/mg。3.1.10淀粉酶:应不含维生素B1,酶活力≥3700U/g。3.2试剂配制3.2.1铁氰化钾溶液(20g/L):称取2g铁氰化钾,用水溶解并定容至100mL,摇匀。临用前配制。3.2.2氢氧化钠溶液(100g/L):称取25g氢氧化钠,用水溶解并定容至250mL,摇匀。3.2.3碱性铁氰化钾溶液:将5mL铁氰化钾溶液与200mL氢氧化钠溶液混合,摇匀。临用前配制。3.2.4盐酸溶液(0.1mol/L):移取8.5mL盐酸,加水稀释至1000mL,摇匀。3.2.5盐酸溶液(0.01mol/L):量取0.1mol/L盐酸溶液50mL,用水稀释并定容至500mL,摇匀。3.2.6乙酸钠溶液(0.05mol/L):称取6.80g乙酸钠,加900mL水溶解,用冰乙酸调pH为4.0~5.0之间,加水定容至1000mL。经0.45μm微孔滤膜过滤后使用。1 GB5009.84—20163.2.7乙酸钠溶液(2.0mol/L):称取27.2g乙酸钠,用水溶解并定容至100mL,摇匀。3.2.8混合酶溶液:称取1.76g木瓜蛋白酶、1.27g淀粉酶,加水定容至50mL,涡旋,使呈混悬状液体,冷藏保存。临用前再次摇匀后使用。3.3标准品维生素B1标准品:盐酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl)),CAS:67-03-8,纯度≥99.0%。3.4标准溶液配制3.4.1维生素B1标准储备液(500μg/mL):准确称取经五氧化二磷或者氯化钙干燥24h的盐酸硫胺素标准品56.1mg(精确至0.1mg),相当于50mg硫胺素、用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至100mL,摇匀。置于0℃~4℃冰箱中,保存期为3个月。3.4.2维生素B1标准中间液(10.0μg/mL):准确移取2.00mL标准储备液,用水稀释并定容至100mL,摇匀。临用前配制。3.4.3维生素B1标准系列工作液:吸取维生素B1标准中间液0μL、50.0μL、100μL、200μL、400μL,800μL,1000μL,用水定容至10mL,标准系列工作液中维生素B1的浓度分别为0μg/mL,0.0500μg/mL,0.100μg/mL,0.200μg/mL,0.400μg/mL,0.800μg/mL,1.00μg/mL。临用时配制。4仪器和设备4.1高效液相色谱仪,配置荧光检测器。4.2分析天平:感量为0.01g和0.1mg。4.3离心机:转速≥4000r/min。4.4pH计:精度0.01。4.5组织捣碎机(最大转速不低于10000r/min)。4.6电热恒温干燥箱或高压灭菌锅。5分析步骤5.1试样的制备5.1.1液体或固体粉末样品:将样品混合均匀后,立即测定或于冰箱中冷藏。5.1.2新鲜水果、蔬菜和肉类:取500g左右样品(肉类取250g),用匀浆机或者粉碎机将样品均质后,制得均匀性一致的匀浆,立即测定或者于冰箱中冷冻保存。5.1.3其他含水量较低的固体样品:如含水量在15%左右的谷物,取100g左右样品,用粉碎机将样品粉碎后,制得均匀性一致的粉末,立即测定或者于冰箱中冷藏保存。5.2试样溶液的制备5.2.1试液提取称取3g~5g(精确至0.01g)固体试样或者10g~20g液体试样于100mL锥形瓶中(带有软质塞子),加60mL0.1mol/L盐酸溶液,充分摇匀,塞上软质塞子,高压灭菌锅中121℃保持30min。水解结束待冷却至40℃以下取出,轻摇数次;用pH计指示,用2.0mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.0左右,加入2.0mL(可根据酶活力不同适当调整用量)混合酶溶液,摇匀后,置于培养箱中37℃过夜(约16h);将酶解液全部转移至100mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,离心或者过滤,取上清液备用。2 GB5009.84—20165.2.2试液衍生化准确移取上述上清液或者滤液2.0mL于10mL试管中,加入1.0mL碱性铁氰化钾溶液,涡旋混匀后,准确加入2.0mL正丁醇,再次涡旋混匀1.5min后静置约10min或者离心,待充分分层后,吸取正丁醇相(上层)经0.45μm有机微孔滤膜过滤,取滤液于2mL棕色进样瓶中,供分析用。若试液中维生素B1浓度超出线性范围的最高浓度值,应取上清液稀释适宜倍数后,重新衍生后进样。另取2.0mL标准系列工作液,与试液同步进行衍生化。注1:室温条件下衍生产物在4h内稳定。注2:5.2.1和5.2.2操作过程应在避免强光照射的环境下进行。注3:辣椒干等样品,提取液直接衍生后测定时,维生素B1的回收率偏低。提取液经人造沸石净化后,再衍生时维生素B1的回收率满足要求。故对于个别特殊样品,当回收率偏低时,样品提取液应净化后再衍生,具体操作步骤见第二法12.1.3部分。5.3仪器参考条件5.3.1色谱柱:C18反相色谱柱(粒径5μm,250mm×4.6mm)或相当者。5.3.2流动相:0.05mol/L乙酸钠溶液-甲醇(65+35)。5.3.3流速:0.8mL/min。5.3.4检测波长:激发波长375nm,发射波长435nm。5.3.5进样量:20μL。5.4标准曲线的制作将标准系列工作液衍生物注入高效液相色谱仪中,测定相应的维生素B1峰面积,以标准工作液的浓度(μg/mL)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。5.5试样溶液的测定按照5.3的色谱条件,将试样衍生物溶液注入高效液相色谱仪中,得到维生素B1的峰面积,根据标准曲线计算得到待测液中维生素B1的浓度。6分析结果的表述试样中维生素B1(以硫胺素计)含量按式(1)计算:c×V×fX=×100…………………………(1)m×1000式中:X———试样中维生素B1(以硫胺素计)的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);c———由标准曲线计算得到的试液(提取液)中维生素B1的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———试液(提取液)的定容体积,单位为毫升(mL);f———试液(上清液)衍生前的稀释倍数;m———试样的质量,单位为克(g)。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。注:试样中测定的硫胺素含量乘以换算系数1.121,即得盐酸硫胺素的含量。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。3 GB5009.84—20168其他当称样量为10.0g时,按照本标准方法的定容体积,食品中维生素B1的检出限为0.03mg/100g,定量限为0.10mg/100g。第二法荧光分光光度法9原理硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素,在紫外线照射下,噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下,以及没有其他荧光物质干扰时,此荧光之强度与噻嘧色素量成正比,即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多,应经过离子交换剂处理,使硫胺素与杂质分离,然后以所得溶液用于测定。10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水。10.1试剂10.1.1正丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。10.1.2无水硫酸钠(Na2SO4):560℃烘烤6h后使用。10.1.3铁氰化钾[K3Fe(CN)6]。10.1.4氢氧化钠(NaOH)。10.1.5盐酸(HCl)。10.1.6乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。10.1.7冰乙酸(CH3COOH)。10.1.8人造沸石。10.1.9硝酸银(AgNO3)。10.1.10溴甲酚绿(C21H14Br4O5S)。10.1.11五氧化二磷(P2O5)或者氯化钙(CaCl2)。10.1.12氯化钾(KCl)。10.1.13淀粉酶:不含维生素B1,酶活力≥3700U/g。10.1.14木瓜蛋白酶:不含维生素B1,酶活力≥800U(活力单位)/mg。10.2试剂配制10.2.10.1mol/L盐酸溶液:移取8.5mL盐酸,用水稀释并定容至1000mL,摇匀。10.2.20.01mol/L盐酸溶液:量取0.1mol/L盐酸溶液50mL,用水稀释并定容至500mL,摇匀。10.2.32mol/L乙酸钠溶液:称取272g乙酸钠,用水溶解并定容至1000mL,摇匀。10.2.4混合酶液:配制同3.2.8。10.2.5氯化钾溶液(250g/L):称取250g氯化钾,用水溶解并定容至1000mL,摇匀。10.2.6酸性氯化钾(250g/L):移取8.5mL盐酸,用250g/L氯化钾溶液稀释并定容至1000mL,摇匀。4 GB5009.84—201610.2.7氢氧化钠溶液(150g/L):称取150g氢氧化钠,用水溶解并定容至1000mL,摇匀。10.2.8铁氰化钾溶液(10g/L):称取1g铁氰化钾,用水溶解并定容至100mL,摇匀,于棕色瓶内保存。10.2.9碱性铁氰化钾溶液:移取4mL10g/L铁氰化钾溶液(10.2.8),用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL,摇匀。用时现配,避光使用。10.2.10乙酸溶液:量取30mL冰乙酸,用水稀释并定容至1000mL,摇匀。10.2.110.01mol/L硝酸银溶液:称取0.17g硝酸银,用100mL水溶解后,于棕色瓶中保存。10.2.120.1mol/L氢氧化钠溶液:称取0.4g氢氧化钠,用水溶解并定容至100mL,摇匀。10.2.13溴甲酚绿溶液(0.4g/L):称取0.1g溴甲酚绿,置于小研钵中,加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨片刻,再加入少许水继续研磨至完全溶解,用水稀释至250mL。10.2.14活性人造沸石:称取200g0.25mm(40目)~0.42mm(60目)的人造沸石于2000mL试剂瓶中,加入10倍于其体积的接近沸腾的热乙酸溶液,振荡10min,静置后,弃去上清液,再加入热乙酸溶液,重复一次;再加入5倍于其体积的接近沸腾的热250g/L氯化钾溶液,振荡15min,倒出上清液;再加入乙酸溶液,振荡10min,倒出上清液;反复洗涤,最后用水洗直至不含氯离子。氯离子的定性鉴别方法:取1mL上述上清液(洗涤液)于5mL试管中,加入几滴0.01mol/L硝酸银溶液,振荡,观察是否有浑浊产生,如果有浑浊说明还含有氯离子,继续用水洗涤,直至不含氯离子为止。将此活性人造沸石于水中冷藏保存备用。使用时,倒入适量于铺有滤纸的漏斗中,沥干水后称取约8.0g倒入充满水的层析柱中。10.3标准品盐酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl),CAS:67-03-8,纯度≥99.0%。10.4标准溶液配制10.4.1维生素B1标准储备液(100μg/mL):准确称取经氯化钙或者五氧化二磷干燥24h的盐酸硫胺素112.1mg(精确至0.1mg),相当于硫胺素为100mg,用0.01mol/L盐酸溶液溶解,并稀释至1000mL,摇匀。于0℃~4℃冰箱避光保存,保存期为3个月。10.4.2维生素B1标准中间液(10.0μg/mL):将标准储备液用0.01mol/L盐酸溶液稀释10倍,摇匀,在冰箱中避光保存。10.4.3维生素B1标准使用液(0.100μg/mL):准确移取维生素B1标准中间液1.00mL,用水稀释、定容至100mL,摇匀。临用前配制。11仪器和设备11.1荧光分光光度计。11.2离心机:转速≥4000r/min。11.3pH计:精度0.01。11.4电热恒温箱。11.5盐基交换管或层析柱(60mL,300mm×10mm内径)。11.6天平:感量为0.01g和0.01mg。5 GB5009.84—201612分析步骤12.1试样制备12.1.1试样预处理用匀浆机将样品均质成匀浆,于冰箱中冷冻保存,用时将其解冻混匀使用。干燥试样取不少于150g,将其全部充分粉碎后备用。12.1.2提取准确称取适量试样(估计其硫胺素含量约为10μg~30μg,一般称取2g~10g试样),置于100mL锥形瓶中,加入50mL0.1mol/L盐酸溶液,使得样品分散开,将样品放入恒温箱中于121℃水解30min,结束后,凉至室温后取出。用2mol/L乙酸钠溶液调pH为4.0~5.0或者用0.4g/L溴甲酚绿溶液为指示剂,滴定至溶液由黄色转变为蓝绿色。酶解:于水解液中加入2mL混合酶液,于45℃~50℃温箱中保温过夜(16h)。待溶液凉至室温后,转移至100mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀、过滤,即得提取液。12.1.3净化装柱:根据待测样品的数量,取适量处理好的活性人造沸石,经滤纸过滤后,放在烧杯中。用少许脱脂棉铺于盐基交换管柱(或层析柱)的底部,加水将棉纤维中的气泡排出,关闭柱塞,加入约20mL水,再加入约8.0g(以湿重计,相当于干重1.0g~1.2g)经预先处理的活性人造沸石,要求保持盐基交换管中液面始终高过活性人造沸石。活性人造沸石柱床的高度对维生素B1测定结果有影响,高度不低于45mm。样品提取液的净化:准确加入20mL上述提取液于上述盐基交换管柱(或层析柱)中,使通过活性人造沸石的硫胺素总量约为2μg~5μg,流速约为1滴/s。加入10mL近沸腾的热水冲洗盐基交换柱,流速约为1滴/s,弃去淋洗液,如此重复三次。于交换管下放置25mL刻度试管用于收集洗脱液,分两次加入20mL温度约为90℃的酸性氯化钾溶液,每次10mL,流速为1滴/s。待洗脱液凉至室温后,用250g/L酸性氯化钾定容,摇匀,即为试样净化液。标准溶液的处理:重复上述操作,取20mL维生素B1标准使用液(0.1μg/mL)代替试样提取液,同上用盐基交换管(或层析柱)净化,即得到标准净化液。12.1.4氧化将5mL试样净化液分别加入A、B两支已标记的50mL离心管中。在避光条件下将3mL150g/L氢氧化钠溶液加入离心管A,将3mL碱性铁氰化钾溶液(10.2.9)加入离心管B,涡旋15s;然后各加入10mL正丁醇,将A、B管同时涡旋90s。静置分层后吸取上层有机相于另一套离心管中,加入2g~3g无水硫酸钠,涡旋20s,使溶液充分脱水,待测定。用标准的净化液代替试样净化液重复12.1.4的操作。12.2测定12.2.1荧光测定条件激发波长:365nm;发射波长:435nm;狭缝宽度:5nm。6 GB5009.84—201612.2.2依次测定下列荧光强度a)试样空白荧光强度(试样反应管A);b)标准空白荧光强度(标准反应管A);c)试样荧光强度(试样反应管B);d)标准荧光强度(标准反应管B)。13分析结果的表述试样中维生素B1(以硫胺素计)的含量按式(2)计算:(U-Ub)×c×VV1×f100X=××…………………………(2)(S-Sb)V2×m1000式中:X———试样中维生素B1(以硫胺素计)的含量,单位为毫克每100克(mg/100g)。U———试样荧光强度;Ub———试样空白荧光强度;S———标准管荧光强度;Sb———标准管空白荧光强度;c———硫胺素标准使用液的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———用于净化的硫胺素标准使用液体积,单位为毫升(mL);V1———试样水解后定容得到的提取液之体积,单位为毫升(mL);V2———试样用于净化的提取液体积,单位为毫升(mL);f———试样提取液的稀释倍数;m———试样质量,单位为克(g)。注:试样中测定的硫胺素含量乘以换算系数1.121,即得盐酸硫胺素的含量。维生素B1标准在0.2μg~10μg之间呈线性关系,可以用单点法计算结果,否则用标准工作曲线法。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字。14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他检出限为0.04mg/100g,定量限为0.12mg/100g。7 GB5009.84—2016附录A维生素B1标准衍生物的高效液相色谱图维生素B1标准衍生物的HPLC谱图见图A.1。图A.1维生素B1标准衍生物的高效液相色谱图8'