GB5009.82-2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定.pdf 24页

'中华人民共和国国家标准GB5009.82—2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布国家食品药品监督管理总局 GB5009.82—2016前言本标准代替GB/T5009.82—2003《食品中维生素A和维生素E的测定》、GB5413.9—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》、GB/T9695.26—2008《肉与肉制品维生素A含量测定》、GB/T9695.30—2008《肉与肉制品维生素E含量测定》、NY/T1598—2008《食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》。本标准与GB/T5009.82—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定”;———增加了“食品中维生素E的测定正相高效液相色谱法”;———增加了“食品中维生素D的测定液相色谱-串联质谱法”;———增加了“食品中维生素D的测定高效液相色谱法”;———修改了“食品中维生素A和维生素E的测定反相高效液相色谱法”;———修改了维生素E异构体的反相色谱分离条件,可同时分离测定4种生育酚异构体;———删除了苯并芘内标定量法,改用外标法定量;———删除了“比色法”测定维生素A。Ⅰ GB5009.82—2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定1范围本标准规定了食品中维生素A、维生素E和维生素D的测定方法。本标准第一法适用于食品中维生素A和维生素E的测定。本标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。本标准第三法适用于食品中维生素D2和维生素D3的测定。本标准第四法适用于配方食品中维生素D2或维生素D3的测定。第一法食品中维生素A和维生素E的测定反相高效液相色谱法2原理试样中的维生素A及维生素E经皂化(含淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,C30或PFP反相液相色谱柱分离,紫外检测器或荧光检测器检测,外标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1无水乙醇(C2H5OH):经检查不含醛类物质,检查方法参见A.1。3.1.2抗坏血酸(C6H8O6)。3.1.3氢氧化钾(KOH)。3.1.4乙醚[(CH3CH2)2O]:经检查不含过氧化物,检查方法参见A.2。3.1.5石油醚(C5H12O2):沸程为30℃~60℃。3.1.6无水硫酸钠(Na2SO4)。3.1.7pH试纸(pH范围1~14)。3.1.8甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.9淀粉酶:活力单位≥100U/mg。3.1.102,6-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT。3.2试剂配制3.2.1氢氧化钾溶液(50g/100g):称取50g氢氧化钾,加入50mL水溶解,冷却后,储存于聚乙烯瓶中。3.2.2石油醚-乙醚溶液(1+1):量取200mL石油醚,加入200mL乙醚,混匀。1 GB5009.82—20163.2.3有机系过滤头(孔径为0.22μm)。3.3标准品3.3.1维生素A标准品视黄醇(C20H30O,CAS号:68-26-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2维生素E标准品3.3.2.1α-生育酚(C29H50O2,CAS号:10191-41-0):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2.2β-生育酚(C28H48O2,CAS号:148-03-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2.3γ-生育酚(C28H48O2,CAS号:54-28-4):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2.4δ-生育酚(C27H46O2,CAS号:119-13-1):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4标准溶液配制3.4.1维生素A标准储备溶液(0.500mg/mL):准确称取25.0mg维生素A标准品,用无水乙醇溶解后,转移入50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度约为0.500mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在-20℃下避光保存,有效期1个月。临用前将溶液回温至20℃,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。3.4.2维生素E标准储备溶液(1.00mg/mL):分别准确称取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚各50.0mg,用无水乙醇溶解后,转移入50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在-20℃下避光保存,有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。3.4.3维生素A和维生素E混合标准溶液中间液:准确吸取维生素A标准储备溶液1.00mL和维生素E标准储备溶液各5.00mL于同一50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,此溶液中维生素A浓度为10.0μg/mL,维生素E各生育酚浓度为100μg/mL。在-20℃下避光保存,有效期半个月。3.4.4维生素A和维生素E标准系列工作溶液:分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,该标准系列中维生素A浓度为0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL,维生素E浓度为2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL。临用前配制。4仪器和设备4.1分析天平:感量为0.01mg。4.2恒温水浴振荡器。4.3旋转蒸发仪。4.4氮吹仪。4.5紫外分光光度计。4.6分液漏斗萃取净化振荡器。2 GB5009.82—20164.7高效液相色谱仪:带紫外检测器或二极管阵列检测器或荧光检测器。5分析步骤5.1试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。5.2试样处理警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作;提取过程应在通风柜中操作。5.2.1皂化5.2.1.1不含淀粉样品称取2g~5g(精确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体试样于150mL平底烧瓶中,固体试样需加入约20mL温水,混匀,再加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,加入10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴震荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。注:皂化时间一般为30min,如皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾溶液,并适当延长皂化时间。5.2.1.2含淀粉样品称取2g~5g(精确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体样品于150mL平底烧瓶中,固体试样需用约20mL温水混匀,加入0.5g~1g淀粉酶,放入60℃水浴避光恒温振荡30min后,取出,向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。5.2.2提取将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚-乙醚混合液,振荡萃取5min,将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的混合醚液再次萃取,合并醚层。注:如只测维生素A与α-生育酚,可用石油醚作提取剂。5.2.3洗涤用约100mL水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用pH试纸检测下层溶液pH值),去除下层水相。5.2.4浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中,用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚液剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。3 GB5009.82—20165.3色谱参考条件色谱参考条件列出如下:a)色谱柱:C30柱(柱长250mm,内径4.6mm,粒径3μm),或相当者;b)柱温:20℃;c)流动相:A:水;B:甲醇,洗脱梯度见表1;d)流速:0.8mL/min;e)紫外检测波长:维生素A为325nm;维生素E为294nm;f)进样量:10μL;g)标准色谱图和样品色谱图见C.1。注1:如难以将柱温控制在20℃±2℃,可改用PFP柱分离异构体,流动相为水和甲醇梯度洗脱。注2:如样品中只含α-生育酚,不需分离β-生育酚和γ-生育酚,可选用C18柱,流动相为甲醇。注3:如有荧光检测器,可选用荧光检测器检测,对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性,可按以下检测波长检测:维生素A激发波长328nm,发射波长440nm;维生素E激发波长294nm,发射波长328nm。表1C30色谱柱-反相高效液相色谱法洗脱梯度参考条件时间流动相A流动相B流速min%%mL/min0.04960.813.04960.820.001000.824.001000.824.54960.830.04960.85.4标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以峰面积为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。5.5样品测定试样液经高效液相色谱仪分析,测得峰面积,采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中,建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。6分析结果的表述试样中维生素A或维生素E的含量按式(1)计算:X=ρ×V×f×100……………………(1)m式中:X———试样中维生素A或维生素E的含量,维生素A单位为微克每百克(μg/100g),维生素E单位为毫克每百克(mg/100g);ρ———根据标准曲线计算得到的试样中维生素A或维生素E的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);4 GB5009.82—2016V———定容体积,单位为毫升(mL);f———换算因子(维生素A:f=1;维生素E:f=0.001);100———试样中量以每100克计算的换算系数;m———试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。注:如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量(α-TE)表示,可按下式计算:维生素E(mgα-TE/100g)=α-生育酚(mg/100g)+β-生育酚(mg/100g)×0.5+γ-生育酚(mg/100g)×0.1+δ-生育酚(mg/100g)×0.01。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他当取样量为5g,定容10mL时,维生素A的紫外检出限为10μg/100g,定量限为30μg/100g;生育酚的紫外检出限为40μg/100g,定量限为120μg/100g。第二法食品中维生素E的测定正相高效液相色谱法9原理试样中的维生素E经有机溶剂提取、浓缩后,用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离,经荧光检测器检测,外标法定量。10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂10.1.1无水乙醇(C2H5OH):色谱纯,经检验不含醛类物质,检查方法参见A.1。10.1.2乙醚[(CH3CH2)2O]:分析纯,经检验不含氧化物,检查方法参见A.2。10.1.3石油醚(C5H12O2):沸程为30℃~60℃。10.1.4无水硫酸钠(Na2SO4)。10.1.5正己烷(n-C6H14):色谱纯。10.1.6异丙醇[(CH3)2CHOH]:色谱纯。10.1.7叔丁基甲基醚[CH3OC(CH3)3]:色谱纯。10.1.8甲醇(CH3OH):色谱纯。10.1.9四氢呋喃(C4H8O):色谱纯。10.1.101,4-二氧六环(C4H8O2):色谱纯。10.1.112,6-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT。10.1.12有机系过滤头(孔径为0.22μm)。5 GB5009.82—201610.2试剂配制10.2.1石油醚-乙醚溶液(1+1):量取200mL石油醚,加入200mL乙醚,混匀,临用前配制。10.2.2流动相:正己烷+[叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液(20+1+0.1)]=90+10,临用前配制。10.3标准品10.3.1α-生育酚(C29H50O2,CAS号:10191-41-0):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;10.3.2β-生育酚(C28H4802,CAS号:148-03-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;10.3.3γ-生育酚(C28H4802,CAS号:54-28-4):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;10.3.4δ-生育酚(C27H4602,CAS号:119-13-1):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。10.4标准溶液配制10.4.1维生素E标准储备溶液(1.00mg/mL):分别称取4种生育酚异构体标准品各50.0mg(准确至0.1mg),用无水乙醇溶解于50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,密封后,在-20℃下避光保存,有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃,并进行浓度校正(校正方法参见附录B)。10.4.2维生素E标准溶液中间液:准确吸取维生素E标准储备溶液各1.00mL于同一100mL容量瓶中,用氮气吹除乙醇后,用流动相定容至刻度,此溶液中维生素E各生育酚浓度为10.00μg/mL。密封后,在-20℃下避光保存,有效期半个月。10.4.3维生素E标准系列工作溶液:分别准确吸取维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中,用流动相定容至刻度,该标准系列中4种生育酚浓度分别为0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL。11仪器和设备11.1分析天平:感量为0.1mg。11.2恒温水浴振荡器。11.3旋转蒸发仪。11.4氮吹仪。11.5紫外分光光度计。11.6索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。11.7高效液相色谱仪,带荧光检测器或紫外检测器。12分析步骤12.1试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。6 GB5009.82—201612.2试样处理警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。12.2.1植物油脂称取0.5g~2g油样(准确至0.01g)于25mL的棕色容量瓶中,加入0.1gBHT,加入10mL流动相超声或涡旋振荡溶解后,用流动相定容至刻度,摇匀。过孔径为0.22μm有机系滤头于棕色进样瓶中,待进样。12.2.2奶油、黄油称取2g~5g样品(准确至0.01g)于50mL的离心管中,加入0.1gBHT,45℃水浴融化,加入5g无水硫酸钠,涡旋1min,混匀,加入25mL流动相超声或涡旋振荡提取,离心,将上清液转移至浓缩瓶中,再用20mL流动相重复提取1次,合并上清液至浓缩瓶,在旋转蒸发器或气体浓缩仪上,于45℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹干。用流动相将浓缩瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。12.2.3坚果、豆类、辣椒粉等干基植物样品称取2g~5g样品(准确至0.01g),用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂,将含油脂的提取溶剂转移至250mL蒸发瓶内,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干,取下蒸发瓶,用10mL流动相将油脂转移至25mL容量瓶中,加入0.1gBHT,超声或涡旋振荡溶解后,用流动相定容至刻度,摇匀。过孔径为0.22μm有机系滤头于棕色进样瓶中,待进样。12.3色谱参考条件色谱参考条件列出如下:a)色谱柱:酰氨基柱(柱长150mm,内径3.0mm,粒径1.7μm)或相当者;b)柱温:30℃;c)流动相:正己烷+[叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液(20+1+0.1)]=90+10;d)流速:0.8mL/min;e)荧光检测波长:激发波长294nm,发射波长328nm;f)进样量:10μL。注:可用Si60硅胶柱(柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm)分离4种生育酚异构体,推荐流动相为正己烷与1,4-二氧六环按(95+5)的比例混合。12.4标准曲线的制作本法采用外标法定量。将维生素E标准系列工作溶液从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。12.5样品测定试样液经高效液相色谱仪分析,测得峰面积,采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过程中,建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。7 GB5009.82—201613分析结果的表述试样中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚的含量按式(2)计算:X=ρ×V×f×100……………………(2)m式中:X———试样中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);ρ———根据标准曲线计算得到的试样中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———定容体积,单位为毫升(mL);f———换算因子(f=0.001);100———试样中量以每百克计算的换算系数;m———试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。注:如维生素E的测定结果要用α-生育酚当量(α-TE)表示,可按下式计算:维生素E(mgα-TE/100g)=α-生育酚(mg/100g)+β-生育酚(mg/100g)×0.5+γ-生育酚(mg/100g)×0.1+δ-生育酚(mg/100g)×0.01。14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他当取样量为2g,定容25mL时,各生育酚的检出限为50μg/100g,定量限为150μg/100g。第三法食品中维生素D的测定液相色谱-串联质谱法16原理试样中加入维生素D2和维生素D3的同位素内标后,经氢氧化钾乙醇溶液皂化(含淀粉试样先用淀粉酶酶解)、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后,反相高效液相色谱C18柱分离,串联质谱法检测,内标法定量。17试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂17.1.1无水乙醇(C2H5OH):色谱纯,经检验不含醛类物质,检查方法参见A.1。17.1.2抗坏血酸(C6H8O6)。17.1.32,6-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT。8 GB5009.82—201617.1.4淀粉酶:活力单位≥100U/mg。17.1.5氢氧化钾(KOH)。17.1.6乙酸乙酯(C4H8O2):色谱纯。17.1.7正己烷(n-C6H14):色谱纯。17.1.8无水硫酸钠(Na2SO4)。17.1.9pH试纸(pH范围1~14)。17.1.10固相萃取柱(硅胶):6mL,500mg。17.1.11甲醇(CH3OH):色谱纯。17.1.12甲酸(HCOOH):色谱纯。17.1.13甲酸铵(HCOONH4):色谱纯。17.2试剂配制17.2.1氢氧化钾溶液(50g/100g):50g氢氧化钾,加入50mL水溶解,冷却后储存于聚乙烯瓶中。17.2.2乙酸乙酯-正己烷溶液(5+95):量取5mL乙酸乙酯加入到95mL正己烷中,混匀。17.2.3乙酸乙酯-正己烷溶液(15+85):量取15mL乙酸乙酯加入到85mL正己烷中,混匀。17.2.40.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵溶液:称取0.315g甲酸铵,加入0.5mL甲酸、1000mL水溶解,超声混匀。17.2.50.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵甲醇溶液:称取0.315g甲酸铵,加入0.5mL甲酸、1000mL甲醇溶解,超声混匀。17.3标准品17.3.1维生素D2标准品:钙化醇(C28H44O,CAS号:50-14-6),纯度>98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。17.3.2维生素D3标准品:胆钙化醇(C27H44O,CAS号:511-28-4),纯度>98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。17.3.3维生素D2-d3内标溶液(C28H44O-d3):100μg/mL。17.3.4维生素D3-d3内标溶液(C27H44O-d3):100μg/mL。17.4标准溶液配制17.4.1维生素D2标准储备溶液:准确称取维生素D2标准品10.0mg,用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100mL,使其浓度约为100μg/mL,转移至棕色试剂瓶中,于-20℃冰箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法见附录B)。17.4.2维生素D3标准储备溶液:准确称取维生素D2标准品10.0mg,用色谱纯无水乙醇溶解并定容至10mL,使其浓度约为100μg/mL,转移至100mL的棕色试剂瓶中,于-20℃冰箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法见附录B)。17.4.3维生素D2标准中间使用液:准确吸取维生素D2标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL,浓度约为10.0μg/mL,有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。17.4.4维生素D3标准中间使用液:准确吸取维生素D3标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL棕色容量瓶中,浓度约为10.0μg/mL,有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。17.4.5维生素D2和维生素D3混合标准使用液:准确吸取维生素D2和维生素D3标准中间使用液各10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL,浓度为1.00μg/mL。有效期1个月。17.4.6维生素D2-d3和维生素D3-d3内标混合溶液:分别量取100μL浓度为100μg/mL的维生素D2-d3和维生素D3-d3标准储备液加入10mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成1μg/mL混合内标。有效9 GB5009.82—2016期1个月。17.5标准系列溶液的配制分别准确吸取维生素D2和D3混合标准使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL棕色容量瓶中,各加入维生素D2-d3和维生素D3-d3内标混合溶液1.00mL,用甲醇定容至刻度,混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L。18仪器和设备注:使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。18.1分析天平:感量为0.1mg。18.2磁力搅拌器或恒温振荡水浴:带加热和控温功能。18.3旋转蒸发仪。18.4氮吹仪。18.5紫外分光光度计。18.6萃取净化振荡器。18.7多功能涡旋振荡器。18.8高速冷冻离心机:转速≥6000r/min。18.9高效液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源。19分析步骤19.1试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。19.2试样处理注:处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。19.2.1皂化19.2.1.1不含淀粉样品称取2g(准确至0.01g)经均质处理的试样于50mL具塞离心管中,加入100μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标溶液和0.4g抗坏血酸,加入6mL约40℃温水,涡旋1min,加入12mL乙醇,涡旋30s,再加入6mL氢氧化钾溶液,涡旋30s后放入恒温振荡器中,80℃避光恒温水浴振荡30min(如样品组织较为紧密,可每隔5min~10min取出涡旋0.5min),取出放入冷水浴降温。注:一般皂化时间为30min,如皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾溶液,并适当延长皂化时间。19.2.1.2含淀粉样品称取2g(准确至0.01g)经均质处理的试样于50mL具塞离心管中,加入100μL维生素D2-d3和维生素D3-d3混合内标溶液和0.4g淀粉酶,加入10mL约40℃温水,放入恒温振荡器中,60℃避光恒温振荡30min后,取出放入冷水浴降温,向冷却后的酶解液中加入0.4g抗坏血酸、12mL乙醇,涡旋30s,再加入6mL氢氧化钾溶液,涡旋30s后放入恒温振荡器中,同19.2.1.1皂化30min。10 GB5009.82—201619.2.2提取向冷却后的皂化液中加入20mL正己烷,涡旋提取3min,6000r/min条件下离心3min。转移上层清液到50mL离心管,加入25mL水,轻微晃动30次,在6000r/min条件下离心3min,取上层有机相备用。19.2.3净化将硅胶固相萃取柱依次用8mL乙酸乙酯活化,8mL正己烷平衡,取备用液全部过柱,再用6mL乙酸乙酯-正己烷溶液(5+95)淋洗,用6mL乙酸乙酯-正己烷溶液(15+85)洗脱。洗脱液在40℃下氮气吹干,加入1.00mL甲醇,涡旋30s,过0.22μm有机系滤膜供仪器测定。19.3仪器测定条件19.3.1色谱参考条件色谱参考条件列出如下:a)C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm,填料粒径1.8μm),或相当者;b)柱温:40℃;c)流动相A:0.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵溶液;流动相B:0.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵甲醇溶液;流动相洗脱梯度见表2;d)流速:0.4mL/min;e)进样量:10μL。表2流动相洗脱梯度时间流动相A流动相B流速min%%(mL/min)0.012880.41.012880.44.010900.45.07930.45.16940.45.86940.46.001000.417.001000.417.512880.420.012880.419.3.2质谱参考条件质谱参考条件列出如下:+;a)电离方式:ESIb)鞘气温度:375℃;c)鞘气流速:12L/min;11 GB5009.82—2016d)喷嘴电压:500V;e)雾化器压力:172kPa;f)毛细管电压:4500V;g)干燥气温度:325℃;h)干燥气流速:10L/min;i)多反应监测(MRM)模式。锥孔电压和碰撞能量见表3,质谱图见C.5。表3维生素D2和维生素D3质谱参考条件保留时间母离子定性子离子碰撞电压定量子离子碰撞电压维生素min(m/z)(m/z)eV(m/z)eV3795维生素D26.0439710729147253824维生素D2-d36.034001102227163677维生素D36.333851072525983703维生素D3-d36.3338810719259619.4标准曲线的制作分别将维生素D2和维生素D3标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样,以维生素D2、维生素D3与相应同位素内标的峰面积比值为纵坐标,以维生素D2、维生素D3标准系列工作液浓度为横坐标分别绘制维生素D2、维生素D3标准曲线。19.5样品测定将待测样液依次进样,得到待测物与内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到测定液中维生素D2、维生素D3的浓度。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应减少取样量重新按19.2进行处理后再进样分析。20分析结果的表述试样中维生素D2、维生素D3的含量按式(3)计算:X=ρ×V×f×100……………………(3)m式中:X———试样中维生素D2(或维生素D3)的含量,单位为微克每百克(μg/100g);———根据标准曲线计算得到的试样中维生素D(或维生素D)的浓度,单位为微克每毫升ρ23(μg/mL);V———定容体积,单位为毫升(mL);f———稀释倍数;100———试样中量以每100克计算的换算系数;12 GB5009.82—2016m———试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。注:如试样中同时含有维生素D2和维生素D3,维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3含量之和计算。21精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。22其他当取样量为2g时,维生素D2的检出限为1μg/100g,定量限为3μg/100g;维生素D3的检出限为0.2μg/100g;定量限为0.6μg/100g。第四法食品中维生素D的测定高效液相色谱法23原理试样中的维生素D2或维生素D3经氢氧化钾乙醇溶液皂化(含淀粉试样先用淀粉酶酶解)、提取、净化、浓缩后,用正相高效液相色谱半制备,反相高效液相色谱C18柱色谱分离,经紫外或二极管阵列检测器检测,内标法(或外标法)定量。如测定维生素D2,可用维生素D3作内标;如测定维生素D3,可用维生素D2作内标。24试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。24.1试剂24.1.1无水乙醇(C2H5OH):色谱纯,经检验不含醛类物质,检查方法见A.1。24.1.2抗坏血酸(C6H8O6)。24.1.32,6-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT。24.1.4氢氧化钾(KOH)。24.1.5正己烷(C4H10O)。24.1.6石油醚(C5H12O2):沸程为30℃~60℃。24.1.7无水硫酸钠(Na2SO4)。24.1.8pH试纸(pH范围1~14)。24.1.9甲醇:色谱纯。24.1.10淀粉酶:活力单位≥100U/mg。24.2试剂配制24.2.1氢氧化钾溶液:50g氢氧化钾,加入50mL水溶解,冷却后储存于聚乙烯瓶中,临用前配制。24.2.2正己烷-环己烷溶液(1+1):量取8mL异丙醇加入到992mL正己烷中,混匀,超声脱气,备用。24.2.3甲醇-水溶液(95+1):量取50mL水加入到950mL甲醇中,混匀,超声脱气,备用。13 GB5009.82—201624.3标准品24.3.1维生素D2标准品:钙化醇(C28H44O,CAS号:50-14-6),纯度>98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。24.3.2维生素D3标准品:胆钙化醇(C27H44O,CAS号:511-28-4),纯度>98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。24.4标准溶液配制24.4.1维生素D2标准储备溶液:准确称取维生素D2标准品10.0mg,用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100mL,使其浓度约为100μg/mL,转移至棕色试剂瓶中,于-20℃冰箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法参见附录B)。24.4.2维生素D3标准储备溶液:准确称取维生素D3标准品10.0mg,用色谱纯无水乙醇溶解并定容至100mL,使其浓度约为100μg/mL,转移至100mL的棕色试剂瓶中,于-20℃冰箱中密封保存,有效期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法参见附录B)。24.4.3维生素D2标准中间使用液:准确吸取维生素D2标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL,浓度约为10.0μg/mL,有效期1个月,准确浓度按校正后的浓度折算。24.4.4维生素D3标准中间使用液:准确吸取维生素D3标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL的棕色容量瓶中,浓度约为10.0μg/mL,有效期3个月,准确浓度按校正后的浓度折算。24.4.5维生素D2标准使用液:准确吸取维生素D2标准中间使用液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL的棕色容量瓶中,浓度约为1.00μg/mL,准确浓度按校正后的浓度折算。24.4.6维生素D3标准使用液:准确吸取维生素D3标准中间使用液10.00mL,用流动相稀释并定容至100mL的棕色容量瓶中,浓度约为1.00μg/mL,准确浓度按校正后的浓度折算。24.4.7标准系列溶液的配制:24.4.7.1当用维生素D2作内标测定维生素D3时,分别准确吸取维生素D3标准中间使用液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、10.00mL于100mL棕色容量瓶中,各加入维生素D2内标溶液5.00mL,用甲醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL。24.4.7.2当用维生素D3作内标测定维生素D2时,分别准确吸取维生素D2标准中间使用液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、10.00mL于100mL棕色容量瓶中,各加入维生素D3内标溶液5.00mL,用甲醇定容至刻度,混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL。25仪器和设备注:使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。25.1分析天平:感量为0.1mg。25.2磁力搅拌器:带加热、控温功能。25.3旋转蒸发仪。25.4氮吹仪。25.5紫外分光光度计。25.6萃取净化振荡器。25.7半制备正相高效液相色谱仪:带紫外或二极管阵列检测器,进样器配500μL定量环。25.8反相高效液相色谱分析仪:带紫外或二极管阵列检测器,进样器配100μL定量环。14 GB5009.82—201626分析步骤26.1试样制备将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。26.2试样处理处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。如样品中只含有维生素D3,可用维生素D2做内标;如只含有维生素D2,可用维生素D3做内标;否则,用外标法定量,但需要验证回收率能满足检测要求。26.2.1不含淀粉样品称取5g~10g(准确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(准确至0.01g)液体样品于150mL平底烧瓶中,固体试样需加入20mL~30mL温水,加入1.00mL内标使用溶液(如测定维生素D2,用维生素D3作内标;如测定维生素D3,用维生素D2作内标。),再加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀。加入30mL无水乙醇,加入10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于恒温磁力搅拌器上80℃回流皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。注:一般皂化时间为30min,如皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾乙醇溶液,并适当延长皂化时间。26.2.2含淀粉样品称取5g~10g(准确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体样品于150mL平底烧瓶中,固体试样需加入约20mL温水,加入1.00mL内标使用溶液(如测定维生素D2,用维生素D3作内标;如测定维生素D3,用维生素D2作内标)和1g淀粉酶,放入60℃恒温水浴振荡30min,向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀。加入30mL无水乙醇,10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于恒温磁力搅拌器上80℃回流皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。26.2.3提取将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚,振荡萃取5min,将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的石油醚再次萃取,合并醚层。26.2.4洗涤用约150mL水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用pH试纸检测下层溶液pH值),去除下层水相。26.2.5浓缩将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中,用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发器或气体浓缩仪上,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚剩下约2mL时,取下蒸发瓶,氮吹至干,用正己烷定容至2mL,0.22μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备,净化待测液。15 GB5009.82—201626.3测定条件26.3.1维生素D待测液的净化26.3.1.1半制备正相高效液相色谱参考条件半制备正相高效液相色谱参考条件列出如下:a)色谱柱:硅胶柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或具同等性能的色谱柱;b)流动相:环己烷+正己烷(1+1),并按体积分数0.8%加入异丙醇;c)流速:1mL/min;d)波长:264nm;e)柱温:35℃±1℃;f)进样体积:500μL。26.3.1.2半制备正相高效液相色谱系统适用性试验取约1.00mL维生素D2和D3标准中间使用液于10mL具塞试管中,在40℃±2℃的氮吹仪上吹干。残渣用10mL正己烷振荡溶解。取该溶液100μL注入液相色谱仪中测定,确定维生素D保留时间。然后将500μL待测液注入液相色谱仪中,根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试管中。将试管置于40℃水浴氮气吹干,取出准确加入1.0mL甲醇,残渣振荡溶解,即为维生素D测定液。26.3.2反相液相色谱参考条件反相液相色谱参考条件列出如下:a)色谱柱:C18柱,柱长250mm,柱内径4.6mm,粒径5μm,或具同等性能的色谱柱;b)流动相:甲醇+水=95+5;c)流速:1mL/min;d)检测波长:264nm;e)柱温:35℃±1℃;f)进样量:100μL。26.4标准曲线的制作分别将维生素D2或维生素D3标准系列工作液注入反相液相色谱仪中,得到维生素D2和维生素D3峰面积。以两者峰面积比为纵坐标,以维生素D2或维生素D3标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素D2或维生素D3标准曲线。26.5样品测定吸取维生素D测定液100μL注入反相液相色谱仪中,得到待测物与内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到待测液中维生素D2(或维生素D3)的浓度。27分析结果的表述试样中维生素D2(或维生素D3)的含量按式(4)计算:X=ρ×V×f×100……………………(4)m16 GB5009.82—2016式中:X———试样中维生素D2(或维生素D3)的含量,单位为微克每百克(μg/100g);———根据标准曲线计算得到的试样中维生素D(或维生素D)的浓度,单位为微克每毫升ρ23(μg/mL);V———正己烷定容体积,单位为毫升(mL);f———待测液稀释过程的稀释倍数;100———试样中量以每100克计算的换算系数;m———试样的称样量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。28精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。29其他当取样量为10g时,维生素D2或维生素D3的检出限为0.7μg/100g,定量限为2μg/100g。17 GB5009.82—2016附录AA.1无水乙醇中醛类物质检查方法A.1.1试剂A.1.1.1硝酸银。A.1.1.2氢氧化钠。A.1.1.3氨水。A.1.2试剂配制A.1.2.15%硝酸银溶液:称取5.00g硝酸银,加入100mL水溶解,储存于棕色试剂瓶中。A.1.2.210%氢氧化钠溶液:称取10.00g氢氧化钠,加入100mL水溶解,储存于聚乙烯瓶中。A.1.2.3银氨溶液:加氨水至5%硝酸银中,直至生成的沉淀重新溶解,加入数滴10%氢氧化钠溶液,如发生沉淀,再加入氨水至沉淀溶解。A.1.3操作方法取2mL银氨溶液于试管中,加入少量乙醇,摇匀,再加入氢氧化钠溶液,加热,放置冷却后,若有银镜反应,则表示乙醇中有醛。A.1.4结果处理换用色谱纯的无水乙醇或对现有乙醇进行脱醛处理:取2g硝酸银溶于少量水中,取4g氢氧化钠溶于温乙醇中,将两者倾入1L乙醇中,振摇后,放置暗处2d,期间不时振摇,经过滤,置蒸馏瓶中蒸馏,弃去150mL初馏液。A.2乙醚中过氧化物检查方法A.2.1试剂A.2.1.1碘化钾。A.2.1.2淀粉。A.2.2试剂配制A.2.2.110%碘化钾溶液:称取10.00g碘化钾,加入100mL水溶解,储存于棕色试剂瓶中。A.2.2.20.5%淀粉溶液:称取0.50g可溶性淀粉,加入100mL水溶解,储存于试剂瓶中。A.2.3操作方法用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液,振摇1min,如水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉溶液,水层呈蓝色,表明含过氧化物。18 GB5009.82—2016A.2.4结果处理换用色谱纯的无水乙醚或对现有试剂进行重蒸,重蒸乙醚时需在蒸馏瓶中放入纯铁丝或纯铁粉,弃去10%初馏液和10%残留液。19 GB5009.82—2016附录B维生素A、D、E标准溶液浓度校正方法维生素A、维生素D、维生素E标准溶液配制后,在使用前需要对其浓度进行校正,具体操作如下:a)取视黄醇标准储备溶液50μL于10mL的棕色容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,混匀,用1cm石英比色杯,以无水乙醇为空白参比,按表B.1的测定波长测定其吸光度;b)分别取维生素D2、维生素D3标准储备溶液100μL于各10mL的棕色容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,混匀,分别用1cm石英比色杯,以无水乙醇为空白参比,按表B.1的测定波长测定其吸光度;c)分别取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚标准储备溶液500μL于各10mL棕色容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,混匀,分别用1cm石英比色杯,以无水乙醇为空白参比,按表B.1的测定波长测定其吸光度。试液中维生素A或维生素E或维生素D的浓度按式(B.1)计算:4A×10X=……………………(B.1)E式中:X———维生素标准稀释液浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);A———维生素稀释液的平均紫外吸光值;4———换算系数;10E———维生素1%比色光系数(各维生素相应的比色吸光系数见表B.1)。表B.1测定波长及百分吸光系数目标物波长/nmE(1%比色光系数)α-生育酚29276β-生育酚29689γ-生育酚29891δ-生育酚29887视黄醇3251835维生素D2264485维生素D326446220 GB5009.82—2016附录C色谱图C.1维生素E标准溶液C30柱反相色谱图见图C.1。图C.1维生素E标准溶液C30柱反相色谱图C.2维生素A标准溶液C30柱反相色谱图(2.5μg/mL)见图C.2。图C.2维生素A标准溶液C30柱反相色谱图(2.5μg/mL)C.3维生素E标准溶液酰氨基柱色谱图见图C.3。图C.3维生素E标准溶液酰氨基柱色谱图21 GB5009.82—2016C.4为维生素D和维生素D-d3混合标准溶液100μg/L的MRM质谱色谱图见图C.4。图C.4维生素D和维生素D-d3混合标准溶液100μg/L的MRM质谱色谱图C.5奶粉中添加维生素D和维生素D-d3混合标准溶液100μg/L的MRM质谱色谱图见图C.5。图C.5奶粉中添加维生素D和维生素D-d3混合标准溶液100μg/L的MRM质谱色谱图22'