供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制研究 152页

'国内图书分类号：TU991.33学校代码：10213国际图书分类号：628.11.08密级：公开工学博士学位论文↑（宋体小2号字加粗）供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制研究博士研究生：祝泽兵导师：张杰教授副导师：袁一星教授申请学位：工学博士学科：市政工程所在单位：市政环境工程学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学 ClassifiedIndex:TU991.33U.D.C:628.11.08DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineering↑（Times）RESEARCHONCHLORINE-RESISTANTBACTERIALCOMMUNITYANDCHLORINERESISTANCEMECHANISMINDRINKINGWATERDISTRIBUTIONSYSTEM（）Candidate:ZhuZebingSupervisor:Prof.ZhangJieAssistantSupervisor:Prof.YuanYixingAcademicDegreeAppliedfor:DoctorofEngineeringSpeciality:MunicipalEngineeringAffiliation:SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineeringDateofDefence:June,2015Degree-Conferring-Institution:HarbinInstituteofTechnology 摘要摘要由于氯的消毒效率高、稳定性好、易于使用、成本低廉等优势，氯仍然是全世界使用最广泛的消毒剂。加氯消毒的过程本身就是对耐氯性细菌选择的过程。这些存在于供水管网中的耐氯菌会对饮用水的安全性造成巨大危害。为解决这一问题，本文对供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制进行研究，以期为供水管网中的饮用水的微生物安全的评估、预防和控制提供理论基础。对东北某市从水厂到供水管网末端不同采样点的主体水和生物膜进行了耐氯菌检测，并利用IlluminaMiSeq高通量测序技术对生物膜中耐氯菌的多样性进行了分析。结果表明，耐氯菌在该供水管网中普遍存在，生物膜中耐氯菌数目至少高于主体水中耐氯菌数目1个数量级。在水厂清水池池壁的生物膜细菌多样性较低，但在管网输送过程中多样性会逐渐增加，在树状管网末端细菌多样性也会显著增加。在供水管网的前中端，Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Sphingobium、Sphingomonas、Acidovorax和Rhodopseudomonas属的细菌占据优势地位且相对较为耐氯；在供水管网末端非耐氯性细菌占据优势地位，并存在一定比例的硝化细菌（Nitrosomonadaceae和Nitrospira）。针对供水管网中不同管材和流速等条件，运用异养菌计数法、流式细胞仪计数法、PCR-DGGE等分析技术，通过供水管网模拟系统和生物膜挂片旋转反应器，研究了大于0.97mg/L的余氯浓度条件下的管材和流速对主体水和生物膜中耐氯菌生长的影响。结果表明，管材对耐氯菌数量和种群结构影响均较大，而流速只对生物膜耐氯菌数量影响较大。生物膜基本成熟时，5种管材生物膜上的耐氯菌数量大小顺序为：铸铁>水泥砂浆>铜>PE>304不锈钢。γ变形菌纲中的Moraxella和α变形菌纲中的Sphingomonas在5种管材中均存在。除水泥砂浆管材外，厚壁菌门（Firmicutes）中的Bacillus在4种管材中均存在。其它耐氯菌则只存于1~3种管材中。值得注意的是，在已鉴定的17种耐氯菌中，有11种为条件致病菌。为了解供水管网中耐氯菌的种群多样性和种群间相互作用对生物膜形成和耐氯性的影响，利用96孔微量细胞培养板振荡培养法，对在供水管网模拟系统中分离的5种耐氯菌进行单一菌种及双菌、4种或5种多菌混合培养形成生物膜，对经72h培养的生物膜加入不同浓度的余氯，并测定了不同时期、不同处理的生物膜的生物量、活性和细菌总数。结果表明：经72h培养后，所有单一菌种、双菌和多菌均能形成生物膜。其中，单一菌种生物膜中Acinetobactersp.-I- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文表现为最强的生物膜形成能力，Acidovoraxdefluvii表现为最弱的生物膜形成能力。在双菌混合生物膜形成过程中，Acidovorax+Acinetobacter，Sphingomonas+Bacillus，Sphingomonas+Acidovorax和Acidovorax+Microbacterium表现为协作关系；Acinetobacter+Microbacterium，Sphingomonas+Microbacterium和Sphingomonas+Acinetobacter表现为竞争关系，Acidovorax+Bacillus，Bacillus+Acinetobacter和Bacillus+Microbacterium表现为中性关系。在整个培养期内，多菌混合均表现为强的生物膜形成能力，Microbacteriumlaevaniformans对5种菌混合生物膜具有弱的抑制作用；Acinetobactersp.，Acidovoraxdefluvii和Bacilluscereus对5种菌混合生物膜具有弱的促进作用；Sphingomonassp对5种菌混合生物膜先表现出弱的促进作用，后表现出为弱的抑制作用。五种耐氯菌的耐氯性由强至弱分别为：Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii>Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp.。Bacilluscereus耐氯性最强，是因为产生了芽孢，0.6mg/L和1mg/L的余氯是产生芽孢的最佳浓度。在双菌生物膜中，由于Microbacteriumlaevaniformans与其它4种耐氯菌多为竞争或中性关系，因此与Microbacteriumlaevaniformans混合的双菌生物膜细菌的耐氯性也会受到一定程度的抑制。与单一菌种、双菌生物膜相比，多菌生物膜显著提高了细菌的耐氯性，Bacilluscereus存在时，多菌生物膜细菌的耐氯性提高程度最大，而Microbacteriumlaevaniformans存在时则会抑制多菌生物膜细菌的耐氯性。在实际供水中可以通过控制这两种耐氯菌的生长来改变供水管网生物膜细菌的耐氯性。关键词：供水管网；耐氯菌；生物膜；种群多样性；种间关系-II- AbstractAbstractChlorineisthemostcommonlyuseddisinfectantduetoitseffectiveness,stability,easyofuse,andlowcost.Chlorinedisinfectionprocesswillbeaselectionprocessforchlorine-resistantbacteria.Indrinkingwaterdistributionsystems(DWDS),chlorine-resistantbacteriawouldendangerdrinkingwatermicrobialsafety.Tosolvethisproblem,thepopulationandchlorineresistancemechanismsofchlorine-resistantbacteriaintheDWDSwereinvestigated.Itiscriticaltounderstandthedistributionandresistancemechanismsofchlorine-resistantbacteriainDWDSfortheassessment,control,andpreventionofpublichealthrisksassociatedwithdrinkingwater.FromthedrinkingwatertreatmentplanttotheterminalofDWDSinNortheastChina,chlorine-resistantbacteriacountsofbulkwaterandbiofilmindifferentsamplingpointswereinvestigated,andthechlorine-resistantbacterialdiversityinbiofilmwasanalyzedbyIlluminaMiSeqhigh-throughputsequencingtechnology.Resultsshowedthatchlorine-resistantbacteriasurvivedpervasivelyinthestudiedDWDS.Andthechlorine-resistantbacteriacountsinthebiofilmwerehigherthaninthebulkwaterwithoneordersofmagnitudeatleast.Thebacterialdiversityintheclearwellwasverylow.ButintheDWDS,thebacterialdiversitypresentedgradualincreasewiththeextensionofthepipenetwork.Intheterminalofbranchpipenetwork,thebacterialdiversityalsosignificantlyincreased.Pseudomonas,Bacillus,Acinetobacter,Sphingobium,Sphingomonas,AcidovoraxandRhodopseudomonaswerepredominantinthefrontandmiddleofDWDS,andwereallrelativelyresistanttochlorine.Chlorine-nonresistantbacteriawerepredominantintheterminalofDWDSwheretherewereacertainproportionofthenitrifyingbacteria(NitrosomonadaceaeandNitrospira).ThepipematerialsandflowvelocitiesmaybevariableinDWDS.Theeffectsofpipematerialsandflowvelocitiesonthechlorine-resistantbacteriainbiofilmandbulkwaterundermorethan0.97mg/Lfreechlorinewereinvestigatedbyheterotrophicplatecounts,flowcytometricanddenaturinggradientgelelectrophoresis.Resultsshowedthatbothchlorine-resistantbacteriacountsanddiversitywerevariedinpipematerials,whileflowvelocitiesonlyaffect-III- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文chlorine-resistantbacteriacountsinbiofilm.Intheessentiallymaturebiofilm,thechlorine-resistantbacteriacountsinthebiofilmsformedonthefivepipematerialswererankedintheorder:castiron>concrete>copper>polyethylene>stainlesssteel304.Inthebiofilmcommunitystructure,Moraxellaosloensis(memberofGammaproteobacteria)andSphingomonassp.(memberofAlphaproteobacteria)wereobservedinallthepipematerials,whileBacillussp.(memberofFirmicutes)wasdetectedexceptintheconcretepipe.Otherbacteriawereonlyfoundfromonetothreepipematerials.Itisnoteworthythatthereareelevenopportunisticpathogensintheseventeenclassifiedbacterialstrains.Thepurposeofthepresentstudywastoinvestigatetheeffectsofchlorine-resistantbacterialdiversitiesandinteractionsonbiofilmformationandchlorineresistance.Fivechlorine-resistantbacteria,viz.Acinetobactersp.,Acidovoraxdefluvii,Bacilluscereus,MicrobacteriumlaevaniformansandSphingomonassp.isolatedfromamodelDWDSwereusedtoformsingle,dualandmultispeciesbiofilmsby96-wellmicrotiter-plateassays,andthese72hculturedbiofilmswereusedtoassesstheirresistancetochlorine.Biofilmswerecharacterizedintermsofmass,metabolicactivityandplatecounts.Resultsshowedthatallofsingle-,dual-andmulti-specieswereabletoformedbiofilmswithin72h.ThelargestsinglebiofilmamountswasfoundforAcinetobactersp.andtheleastwasAcidovoraxdefluvii.Evidencesofmicrobialinteractionsindual-speciesbiofilmformationwerefoundforthefollowingcases:synergy/cooperationwasfoundforAcidovorax+Acinetobacter,Sphingomonas+Bacillus,Sphingomonas+AcidovoraxandAcidovorax+Microbacterium,andantagonism/competitionwasfoundforAcinetobacter+Microbacterium,Sphingomonas+MicrobacteriumandSphingomonas+Acinetobacter.AneutralinteractionwasfoundforAcidovorax+Bacillus,Bacillus+AcinetobacterandBacillus+Microbacterium.Multispeciesofbacteriaproducedstrongbiofilmsforthethreesamplingtimes.FivemixedmultispeciesbiofilmformationwasweaklyinhibitedinthepresentofMicrobacteriumlaevaniformans,andwasweaklyincreasedinthepresentofanyofthethreespecies(Acinetobactersp.,AcidovoraxdefluviiandBacilluscereus).Whilefivemixedmultispeciesbiofilmformationwasweaklyincreasedinthefirst,andthenwasweaklyinhibitedinthepresentofSphingomonassp.Thechlorineresistanceofbacteriainsingle-speciesbiofilmrankedfromhighto-IV- Abstractlow:Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii>Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp..Bacilluscereushadthehighestchlorineresistance,asthisspeciescouldproducespores,andtheoptimalsporesproducingconcentrationsofchlorinewere0.6mg/Land1mg/L.Inthedualspeciesbiofilm,duetoMicrobacteriumlaevaniformanscompetitionorneutralitywiththeotherfourspecies,chlorineresistanceofbacteriaindualspeciesbiofilmcomposedofMicrobacteriumlaevaniformanswereinhibitedtosomeextent.Multispeciesbiofilmbacteriaweremoreresistanttochlorinethansingle-anddual-speciesbiofilmbacteria.ThechlorineresistanceoffivemixedmultispeciesbiofilmbacteriawasstronglyimprovedinthepresentofBacilluscereus,whilethechlorineresistancewasinhibitedinthepresentofMicrobacteriumlaevaniformans.Sotherearepossibleapproachestochangechlorineresistanceofmultispeciesbiofilmbythecontrolofthesetwospecies(BacilluscereusandMicrobacteriumlaevaniformans)inrealDWDS.Keywords:drinkingwaterdistributionsystem;chlorine-resistantbacteria;bilfilm;bacterialcommunitydiversity;bacterialinteractions-V- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文目录摘要.........................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................III第1章绪论...........................................................................................................11.1课题背景及研究的目的和意义.......................................................................11.2供水管网中的微生物学研究进展...................................................................21.2.1供水管网中微生物与水质安全................................................................21.2.2供水管网中微生物多样性........................................................................41.2.3供水管网中的耐氯菌................................................................................61.2.4供水管网中微生物存在形式....................................................................81.3供水管网生物膜生长的影响因素...................................................................91.3.1供水管网生物膜生长的非生物学影响因素............................................91.3.2微生物种群对供水管网生物膜生长的影响..........................................121.4课题来源........................................................................................................151.5研究内容和技术路线.....................................................................................16第2章实验材料与方法.........................................................................................182.1实验装置........................................................................................................182.1.1以地表水为水源的供水管网..................................................................182.1.2生物膜挂片环形反应器..........................................................................182.1.3供水管网动态模拟系统..........................................................................202.2实验设备和试剂.............................................................................................222.2.1主要仪器设备..........................................................................................222.2.2实验主要试剂..........................................................................................222.3常规分析项目及检测方法.............................................................................222.4微生物分析项目及检测方法.........................................................................222.4.1生物膜采样方法......................................................................................222.4.2微生物形态观察......................................................................................242.4.3细菌计数..................................................................................................242.4.4微生物群落多样性分析..........................................................................262.5实验研究方法.................................................................................................272.5.1实际供水管网耐氯菌的检测..................................................................272.5.2管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响......................................29-VI- 目录2.5.3供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究..............................322.5.4供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究..................................35第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征.........................................................383.1引言................................................................................................................383.2供水管网主体水和生物膜中耐氯菌的数量变化.........................................383.2.1主体水中耐氯菌的数量变化..................................................................383.2.2生物膜中耐氯菌的数量变化..................................................................393.2.3供水管网中生物膜微生物相观察..........................................................403.3供水管网生物膜微生物群落结构分析.........................................................423.3.1微生物多样性指数分析..........................................................................423.3.2菌门和菌纲分类水平上微生物群落结构差异......................................433.3.3占优势的耐氯菌属分析..........................................................................453.4本章小结........................................................................................................47第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响.........................................484.1引言................................................................................................................484.2稳定余氯条件下管材对供水管网中耐氯菌生长的影响.............................484.2.1主体水中耐氯菌的变化..........................................................................484.2.2不同管材生物膜中的耐氯菌数量..........................................................504.2.3不同管材生物膜中的耐氯菌种群结构分析..........................................534.3余氯变化条件下管材对供水管网中耐氯菌生长的影响.............................574.3.1管壁生物膜对氯衰减的影响..................................................................574.3.2余氯变化条件下管材对生物膜中耐氯菌总数的影响..........................594.3.3余氯变化条件下管材对耐氯菌的种群结构变化的影响......................614.4PE和不锈钢管材中流速对供水管网中耐氯菌生长的影响........................644.4.1流速对主体水中耐氯菌总数的影响......................................................644.4.2流速对生物膜中耐氯菌总数的影响......................................................664.4.3流速对耐氯菌的种群结构变化的影响..................................................674.5本章小结........................................................................................................70第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究.................................715.1引言................................................................................................................715.2单一菌种生物膜的形成特性.........................................................................725.2.1单一菌种生物膜的生物量变化..............................................................725.2.2单一菌种生物膜的生物活性变化..........................................................725.2.3单一菌种生物膜的细菌总数..................................................................74-VII- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文5.2.4单一菌种生物膜形成能力比较..............................................................765.3双菌相互作用及混合生物膜的形成特性.....................................................775.3.1双菌混合生物膜的生物量变化..............................................................775.3.2双菌混合生物膜的生物活性变化..........................................................795.3.3双菌混合生物膜的细菌总数..................................................................825.3.4双菌相互作用及混合生物膜的形成能力比较......................................825.4多菌相互作用及混合生物膜的形成特性.....................................................855.4.1多菌混合生物膜的生物量变化..............................................................855.4.2多菌混合生物膜的生物活性变化..........................................................875.4.3多菌混合生物膜的细菌总数..................................................................895.4.4多菌相互作用及混合生物膜的形成能力比较......................................905.5本章小结........................................................................................................93第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究.....................................956.1引言................................................................................................................956.2生物膜细菌的耐氯性.....................................................................................956.2.1单一菌种生物膜细菌的耐氯性..............................................................956.2.2双菌混合生物膜细菌的耐氯性..............................................................996.2.3多菌混合生物膜细菌的耐氯性............................................................1026.3生物膜细菌的耐氯机制分析.......................................................................1056.3.1单一菌种的耐氯机制............................................................................1056.3.2细菌种群的协作与竞争........................................................................1076.3.3多物种生物膜细菌的群体效应............................................................1086.4供水管网中耐氯菌的控制策略...................................................................1096.5本章小结......................................................................................................112结论.....................................................................................................................114参考文献.................................................................................................................116攻读博士学位期间发表的论文及其它成果.........................................................135哈尔滨工业大学学位论文原创性声明及使用权限.............................................136致谢.....................................................................................................................137个人简历.................................................................................................................138-VIII- ContentsContentsAbtract(inChinese)..................................................................................................IAbstract(inEnglish)..............................................................................................IIIChapter1Introduction.............................................................................................11.1Background,objectiveandsignificanceofthesubject.....................................11.2Microbiologyindrinkingwaterdistributionsystem.........................................21.2.1Microbiologicalsafetyindrinkingwaterdistributionsystem...................21.2.2Microbiologicaldiversityindrinkingwaterdistributionsystem...............41.2.3Chlorine-resistantbacteriaindrinkingwaterdistributionsystem.............61.2.4Microbiologicalphasesindrinkingwaterdistributionsystem..................81.3Thefactorsinfluencingbiofilmgrowthindrinkingwaterdistributionsystem91.3.1Theabioticfactorsinfluencingbiofilmgrowth..........................................91.3.2Effectsofmicrobialpopulationsonbiofilmgrowth................................121.4Subjectsource..................................................................................................151.5Contentsandtechnicalrouteofthethesis.......................................................16Chapter2Materialsandmethods..........................................................................182.1Experimentalinstallations...............................................................................182.1.1drinkingwaterdistributionsystemofsourcefromsurfacewater............182.1.2Biofilmannularreactor.............................................................................182.1.3Modeldrinkingwaterdistributionsystem................................................202.2Experimentalinstrumentsandreagents...........................................................222.2.1Instruments................................................................................................222.2.2Reagents....................................................................................................222.3Routineanalysisitemsanddetectalmethods..................................................222.4Microbiologicalanalysis..................................................................................222.4.1Samplingmethodofbiofilm.....................................................................222.4.2Microbialmorphology..............................................................................242.4.3Bacterialcounting.....................................................................................242.4.4Analysisofmicrobialcommunitydiversity..............................................262.5Experimentalresearchmethods.......................................................................272.5.1Detectionofchlorine-resistantbacteriainrealdrinkingwaterdistributionsystem................................................................................................................272.5.2Effectsofpipematerialsandflowvelocitiesonchlorine-resistantbacteriagrowthindrinkingwaterdistributionsystem....................................................29-IX- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文2.5.3Biofilmformtionandchlorine-resistantbacteriainteractionsindrinkingwaterdistributionsystem...................................................................................322.5.4Chlorineresistanceandmechanismsofchlorine-resistantbacteriainbiofilmofdrinkingwaterdistributionsystem...................................................35Chapter3Distributionofchlorine-resistantbacteriainrealdrinkingwaterdistributionsystem..................................................................................................383.1Introduction......................................................................................................383.2Variationofchlorine-resistantbacteriacountsinbulkwaterandbiofilm......383.2.1Variationofchlorine-resistantbacteriacountsinbulkwater...................383.2.2Variationofchlorine-resistantbacteriacountsinbiofilm........................393.2.3Biotainthebiofilm...................................................................................403.3Microbialcommunitystructuresofbiofilmindrinkingwaterdistributionsystem....................................................................................................................423.3.1Analysisofmicrobialdiversityindices....................................................423.3.2Microbialcommunitystructuredifferencesatphylumandclasslevels..433.3.3Analysisofdominantchlorine-resistantbacterialgenera.........................453.4Briefsummary.................................................................................................47Chapter4Effectsofpipematerialsandflowvelocitiesonchlorine-resistantbacteriagrowthindrinkingwaterdistributionsystem.......................................484.1Introduction......................................................................................................484.2Effectsofpipematerialsonchlorine-resistantbacteriagrowthunderstablechlorineindrinkingwaterdistributionsystem......................................................484.2.1Chlorine-resistantbacteriacountsinbulkwater......................................484.2.2Chlorine-resistantbacteriacountsindifferentpipebiofilm.....................504.2.3Chlorine-resistantbacteriacommunitydiversityinbiofilm.....................534.3Effectsofpipematerialsonchlorine-resistantbacteriagrowthunderunstablechlorineindrinkingwaterdistributionsystem......................................................574.3.1Effectsofpipebiofilmonchlorinedecay................................................574.3.2Effectsofpipematerialsonchlorine-resistantbacterialnumbersinbiofilmunderunstablechlorine.........................................................................594.3.3Effectsofpipematerialsonchlorine-resistantbacterialcommunitydiversityinbiofilmunderunstablechlorine......................................................614.4EffectsofflowvelocitiesonChlorine-resistantbacteriagrowthinPEandstainlesssteeldrinkingwaterdistributionsystem.................................................644.4.1EffectsofflowvelocitiesonChlorine-resistantbacterialnumbersinbulkwater...................................................................................................................644.4.2EffectsofflowvelocitiesonChlorine-resistantbacterialnumbersin-X- Contentsbiofilm................................................................................................................664.4.3EffectsofflowvelocitiesonChlorine-resistantbacterialcommunitydiversityinbiofilm............................................................................................674.5Briefsummary.................................................................................................70Chapter5Biofilmformtionandchlorine-resistantbacteriainteractionsindrinkingwaterdistributionsystem........................................................................715.1Introduction......................................................................................................715.2Single-speciesbiofilmformation....................................................................725.2.1Variationofsingle-speciesbiofilmbiomass.............................................725.2.2Variationofsingle-speciesbiofilmrespiratoryactivity...........................725.2.3Bacterialcountsofsingle-speciesbiofilm................................................745.2.4Comparisionofsingle-speciesbiofilmformationability.........................765.3Dual-speciesinteractionsandbiofilmformation............................................775.3.1Variationofdual-speciesbiofilmbiomass................................................775.3.2Variationofdual-speciesbiofilmrespiratoryactivity..............................795.3.3Bacterialcountsofdual-speciesbiofilm..................................................825.3.4Comparisionofdual-speciesinteractionsandbiofilmformationability.825.4Multispeciesinteractionsandbiofilmformation.............................................855.4.1Variationofmultispeciesbiofilmbiomass...............................................855.4.2Variationofmultispeciesbiofilmrespiratoryactivity..............................875.4.3Bacterialcountsofmultispeciesbiofilm..................................................895.4.4Comparisionofmultispeciesinteractionsandbiofilmformationability.905.5Briefsummary.................................................................................................93Chapter6ChlorineresistanceandmechanismsofChlorine-resistantbacteriainbiofilmofdrinkingwaterdistributionsystem..................................................956.1Introduction......................................................................................................956.2Chlorineresistanceofchlorine-resistantbacteriainbiofilm..........................956.2.1Chlorineresistanceofbacteriainsingle-speciesbiofilm.........................956.2.2Chlorineresistanceofbacteriaindual-speciesbiofilm...........................996.2.3Chlorineresistanceofbacteriainmultispeciesbiofilm.........................1026.3Chlorineresistancemechanismsofchlorine-resistantbacteriainbiofilm...1056.3.1Chlorineresistancemechanismsofsinglebacteria................................1056.3.2Synergismandantagonismofbacterialpopulation................................1076.3.3Groupeffectsofmultispecies.................................................................1086.4Controlstrategiesofchlorine-resistantbacteriaindrinkingwaterdistributionsystem..................................................................................................................1096.5Briefsummary...............................................................................................112-XI- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文Conclusions.............................................................................................................114References...............................................................................................................116PaperspublishedintheperiodofPh.D.education............................................135Statementofcopyrightandletterofauthorization............................................136Acknowledgements................................................................................................137Resume....................................................................................................................138-XII- 第1章绪论第1章绪论1.1课题背景及研究的目的和意义集中式供应清洁卫生的饮用水系统是直到最近100多年间才出现的最重要[1,2]的里程碑事件。自20世纪中叶城市饮用水常规处理工艺（混凝、沉淀和澄清、过滤、消毒）普及以来，人们一直相信采用水厂加氯并保持管网一定余氯浓度的消毒技术就可以彻底控制饮用水的微生物等水质安全问题，对城市日益先进的饮用水水处理技术（臭氧活性炭深度处理、膜处理）更是完全放心。然而，自20世纪70年代在美国发现军团菌感染事件以来，发达国家陆续发现的饮用水微生物致病甚至死亡的事件，使这一认识被打破。实际上，即使采用了[3]先进的水处理技术，也不可忽视饮用水中微生物致病的危险。保障饮用水的微生物安全既是公共卫生部门的重要组成部分，也是水务工作者的首要目标。目前我国大多数经过水厂处理的出厂水水质都能达到或优于国家水质标准，但是通过供水管网系统输送到用户龙头时，水质却发生了巨大的变化。在供水管网系统这个巨大的反应器中，由于生物、化学和物理的作用，[4]水质就会发生一系列复杂的变化，随后也就可能会威胁公共卫生安全。确实，水传播疾病的原因调查表明，供水管网作为一个污染源并没有得到充分的研究，在供水输配过程中迫切需要进行充分的研究并制定有效的措施来充分保障水质。由于氯的消毒效率高、稳定性好、易于使用、成本低廉等优势，氯仍然是[5]全世界使用最广泛的消毒剂。加氯消毒的过程本身就是对耐氯性微生物选择[6][7]的过程。供水管网中至少有95%的微生物是附着在管壁生物膜上生长。细[8,9]菌在管壁或颗粒物上的附着会使细菌的耐氯性增加。某些细菌可以在含有一定余氯浓度的净水厂、供水管网中存活，这些对氯具有耐受性的细菌就可以称[10-13]作“耐氯菌”（chlorine-resistantbacteria，也译为“抗氯菌”）。这些存在于主体水中，特别是在生物膜中的耐氯菌会对饮用水的安全性造成危害。一方面有些耐氯菌本身就是病原菌或者条件致病菌，如分枝杆菌（Mycobacteriumspp.）、军团菌（Legionellaspp.）、铜绿色假单胞杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、土拉弗朗西斯菌（Francisellatularensis）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii）等[3,14-16]，如果它们没能被净水工艺去除或被消毒灭活，进入管网后会直接引起[3,14]用户感染介水传染病的风险；另一方面，由耐氯菌导致氯消毒的失效，并-1- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文由此引发供水管网中的细菌再生长，又进一步增加了细菌的耐氯性，使得供水管网中的细菌状况进一步加剧，从而引起了供水管网中的生物膜生长、微生物[2]介导的管道腐蚀、硝化作用、病原菌滋生等一序列的问题。当供水管网中的水力条件变化或受到其它干扰时，供水管网生物膜中臧匿的耐氯菌包括致病菌（如Mycobacterium）在内的多种微生物会进入主体水，导致用户龙头水细菌[17-20]总数、色度、浊度等水质指标超标，从而导致水质恶化、介水传染疾病的爆发。例如，在美国爆发的军团菌感染事件就是由军团菌这一耐氯菌引发的。已经有报道表明在加氯的供水管网中的细菌（Sphingobium、Sphingomonas、Pseudomonas、Acinetobacteror、非粪便型Enterobacteriaceae等）可能含有不[21]同的抗生素抗性。英国卡迪夫大学的Walsh等人在印度新德里自来水系统中分离到了可以产生新型金属β-内酰胺酶NDM-1的超级耐药细菌，这种携带有[22]NDM-1基因的超级细菌可以通过饮用水进行传播。某种细菌具有多重耐药性，我们便称之为多重耐药菌，或称超级细菌。携带有NDM-1基因的细菌便[16,23]是一种新型的“超级细菌”。“超级细菌”的出现可能预示着人类抗生素[24]时代的终结，这一问题已经成为全球医学领域的一大挑战。其中金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii）等耐氯菌[16,23]就是“超级细菌”。这一事件不仅证明了供水管网内存在着对氯消毒具有很强耐受性的致病菌，也凸显了供水管网水质的控制的重要性。因此，对供水管网中耐氯菌的研究日益受到广泛关注。由于耐氯菌处于一个贫营养条件下并维持较高浓度余氯的极端环境体系下，这大大限制了我们对供水管网中的耐氯菌及其耐氯机制的研究，为提出有效的耐氯菌控制方法带来了困难。然而研究供水管网中的耐氯菌及其耐氯机制对饮用水的微生物安全的评估、预防和控制至关重要。本文对供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制进行研究，以期为供水管网中的微生物安全的评估、预防和控制提供理论基础。1.2供水管网中的微生物学研究进展1.2.1供水管网中微生物与水质安全目前，大多数发达国家都制定了完善和严格的水质标准。众所周知，在饮用水和供水管网中的微生物会造成腐蚀、水质恶化、介水传染疾病的爆发等问题，其中涉及到水源性疾病爆发的公共卫生风险是最重要也是最难控制的问题。美国疾病控制与预防中心进行的调查显示，从1971年~2006年，至少780次疾-2- 第1章绪论病爆发事故与饮用水的污染有关，造成了577094人患病，93人死亡。在这些介水传染疾病中，33%是由源水受到污染导致的，39%是由不恰当或不彻底的[25]水处理工艺造成的，18%是由供水管网和用户水管污染造成的。饮用水的不安全主要是由微生物和化学物质引起的，其中由化学物质引起的疾病大约占[26]10%，而由微生物引起的疾病则多达90%。图1-12012年由于饮用不适合饮用和不清洁卫生的水造成腹泻死亡的[27]全球发展中国家分布图（每百万人口死亡数）Fig.1-1Globalmapofdiarrhoealdeathsduetoinadequatewater,sanitationandhygienein[27]2012(annualdeathspermillionpopulation)[28]饮用不清洁卫生的水是全球四大疾病诱因之一。据世界卫生组织（WHO）的报告，2000年~2007年在欧洲的14个国家（比利时、捷克共和国、克罗地亚、爱沙尼亚、芬兰、希腊、匈牙利、意大利、立陶宛、挪威、斯洛伐克、西班牙、瑞典和英国）有354起由饮用水引起的介水传染病事件，共造成了超过[29]47617例病例感染。据估计，在发展中国家，有45%的死亡是由于饮用受污染的水造成的。世界上有超过80%的废水不进行处理，这导致发展中国家每年[30]有数百万人死于跟腹泻相关的疾病。在这些发展中国家，相对于对没有病原体的饮用水的需求，化学污染是微不足道的。在这种情况下，安全只是相对的。[27]另据世界卫生组织（WHO）在2014年的报告（图1-1）估计，发展中国家在2012年有502000人由于饮用不适合饮用的水腹泻死亡，280000人由于饮用不卫生的水腹泻死亡，由于供水设施不适应输送饮用水造成的疾病可能会更-3- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文高。其中，中国在2012年由于饮用不适合饮用的水造成了2015人死亡，饮用不清洁卫生的水造成了4745人死亡。世界卫生组织建议对饮用水供水管网系统进行规范和管理可以显著改善饮用水的卫生安全。2011年中国疾病预防控制中心对各级供水设施的水样进行了调查。结果表[31]明，饮用水水质仍需进一步加强，集中式和二次供水水质合格率均未达90%。供应足够的清洁卫生的饮用水，并适当提高相应的卫生标准，改善供水管网的[14]卫生条件，能显著地降低介水传染病的发生。1.2.2供水管网中微生物多样性随着分子生物学的快速发展，对供水管网中微生物的研究方法已经跳出了传统的实验室纯培养的限制，越来越多的供水管网中非培养的细菌得以被发现。实际上，以高通量测序为代表的先进的分子生物学技术还没有被广泛的应用在这一领域，因此供水管网中细菌多样性还远远没有彻底地展现出来。总的来说，许多研究者对不同季节、水源、地点、供水规模、管材、消毒剂的供水管网的[32-37]细菌多样性作了详细的调查。根据一些研究者的总结，表1-1列出了目前在供水管网中发现的较为常见的细菌种类（包括门和属）和一些条件致病菌。由表1-1可知，变形菌门（Proteobacteria）的α-、β-和γ-变形菌纲，放线菌门（Actinobacteria），厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是供水管网中最常见的门/纲；其它8个门/纲类也在不同的供水管网中有所发现。而鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），假单胞菌属（Pseudomonas），食酸菌属（Acidovorax），短波单胞菌属（Brevundimonas），不动杆菌属（Acinetobacter），甲基杆菌属（Methylobacterium），微杆菌属（Microbacterium），芽孢杆菌属（Bacillus）等细菌则常见于供水管网中。研究发现，在供水管网中革兰氏阴性—+—（G）细菌的种类数目要多于革兰氏阳性（G）细菌，这是因为革兰氏阴性G++细菌的耐氯性要强于G细菌，G细菌细胞壁虽厚但组成简单，主要由肽聚糖组成，还有一定数量的磷壁酸，没有外膜，细胞壁上具有对消毒剂的敏感的多目—+标作用位点，而G细菌的胞壁虽然厚度较G细菌薄，但其层次较多，组成相对复杂,胞壁外膜为此类细菌所独有，该膜的化学成分为磷脂、脂多糖和蛋白[5,38,39]+质，并提供了对消毒剂的额外屏障。但也有研究认为，在供水管网中G—[40]+—细菌数目多于G细菌，并认为革兰氏阳性（G）细菌比革兰氏阴性（G）+—细菌耐氯性强，也与其细胞壁和细胞膜的结构有关，因为G细菌的细胞壁较G+细菌厚很多。对于G细菌，有效氯浓度在0.3~0.5mg/L的消毒剂才有灭菌效—[41]果；而对于G细菌，阈值就低了很多，大约为0.05mg/L。-4- 第1章绪论[1,21,42,43]表1-1供水管网中细菌种类[1,21,42,43]Table1-1Bacterialdiversityobservedindrinkingwaterdistributionsystems供水管网中细菌Proteobacteria（Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Gammaproteobacteria），常见门/纲Actinobacteria，Firmicutes，BacteroidetesProteobacteria（Deltaproteobacteria，Epsilonproteobacteria），Acidobacteria，Verrucomicrobia，少见门/纲Cyanobacteria，Nitrospirae，Planctomycetes，ChloroflexiGemmatimonadetes，Spirochaetes，Chlamydiae，Aquificae，Fusobacteria，AcidobacteriaSphingomonas，Pseudomonas，Acidovorax，Brevundimonas，Novosphingobium，Flavobacterium，Acinetobacter，Methylobacterium，Microbacterium，Bacillus，Micrococcus，Rhodococcus，常见属Ralstonia，Staphylococcus，Xanthomonas，Stenotrophomonas，Bradyrhizobium，Blastomonas，Sphingobium，Paracoccus，Bosea，Burkholderia，Streptococcus，Methylobacter，Polynucleobacter，Legionella，Porphyrobacter，Nitrospira，Arcicella，Herbaspirillum，Methylophilus，Dechloromonas，Denitratisoma，Sulfuricurvum，Clostridium，PirellulaErythromicrobium，Sediminibacterium，Nitrosomonas，Rheinheimera，Escherichia，Methylocaldum，Vibrio，Opitutus，Dyadobacter，Herminiimonas，Ideonella，Polaromonas，Runella，Paenibacillus，Gordonia，Rhodoferax，Hydrogenophaga，Aeromonas，Caulobacter，少见属Variovorax，Janthinobacterium，Curvibacter，Nocardia，Holophaga，Synechococcus，Flexibacter，Owenweeksia，Anabaena，Rubrivivax，Thiobacillus，Alcaligenes，Arthrobacter，Corynebacterium，Citrobacter，Enterobacter，Klebsiella，Moraxella，Seratia，Helicobacter，EscherichiaEscherichia，Klebsiella，Enterobacter，Citrobacter，Serratia，Helicobacter，Pseudomonas，条件Moraxella，Arthrobacter，Alcaligenes，Micrococcus，Aeromonas，Flavobacterium，致病菌Mycobacterium，Stenotrophomonasmaltophilla，Legionella，Bacillus，Clostridium，,Salmonella，Acanthamoeba，Naegleria，Crenothrix，Gallionella，Lepthothrix，Actinomycetes值得注意的是，对同一个样品不同的检测方法得出的细菌多样性也会有所差别。Vaz-Moreira等人运用纯培养法、PCR-DGGE、454-焦磷酸测序等技术对葡萄牙某城市给水处理厂不同水源、处理工艺和市政供水管网系统的不同地点[36]共19个采样点的主体水细菌多样性进行调查，结果表明不同的研究方法测定的细菌多样性有一定的差异，相比来说纯培养的方法检测的细菌多样性较单一，而PCR-DGGE法和454-焦磷酸测序检测的细菌多样性不相上下，比如PCR-DGGE检测到了绿弯菌门（Chloroflexi）的细菌，而454-焦磷酸测序却没-5- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文有；454-焦磷酸测序检测出了大量的拟杆菌门细菌，而PCR-DGGE检测显示只少量存在拟杆菌门细菌。即使如此，这3种检测方法得出的主要结论基本一致。相比来说，高通量测序技术可以在整体水平解析微生物群落结构，尽可能更真[44]实地揭示微生物群落的多样性。随着第2代高通量测序（IlluminaMiseqPE300）[45]技术的出现，为我们提供了更为有力的研究手段。该测序技术可以满足环境[44]样本大规模测序的需要，必将广泛地应用于供水管网中微生物多样性的研究中。1.2.3供水管网中的耐氯菌由于氯的消毒效率高、稳定性好、易于使用、成本低廉等优势，氯仍然是[5]全世界使用最广泛的消毒剂。加氯消毒的过程本身就是对耐氯性微生物选择[6]的过程，某些细菌可以在含有一定余氯浓度的净水厂、供水管网中存活，这些对氯具有耐受性的细菌就可以称作“耐氯菌”（chlorine-resistantbacteria，也[10-13]译为“抗氯菌”）。Langsrud等人对耐氯菌作了一个相对更理论化的定义，如果某个（或某种）微生物能够比其他微生物在更高的氯消毒剂中存活或生长，[6]这就说明该微生物具有更高的耐氯性，具有中等抗氯性的细菌就可以称为耐[6,32]氯菌。然而，因为消毒效率跟测试的条件、方法密切相关，因此，在科学[6,32]的范畴上，耐氯菌的耐受性只是一个相对的概念，并不是一个准确的术语。我国的《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》规定氯消毒与水接触30min以后，水中的自由性余氯量不低于0.3mg/L。因此，我们可以把能够在0.3mg/L以上的余氯的供水系统中存活30min以上的细菌称为耐氯菌。Ridgway等人在美国加州的Irvine市的加氯（＞0.5mg/LCl2）自来水中通过抑菌环实验和膜滤消毒实验最早发现了耐氯菌，这些耐氯菌被加氯的自来水优先选择，在管网下游存活并再生长；相反，在加州的GardenGrove市不加氯[10]的供水管网中，对氯敏感的细菌增多。Sun等人从长时间高氯浓度下的生物膜挂片旋转（AR）反应器中分离了一株耐氯性极强的新菌SphingomonasTS001，在4mg/L余氯作用240min后，仅能杀灭4.4%的TS001菌，同时作者认为长时间暴露在高浓度的消毒剂能够自然选择出对消毒剂抗性强的种群，这些种群在提高消毒剂的浓度下会变成优势种群，通常也会降低种群的丰富度，净水厂为避免低浓度余氯对耐氯种群的选择[11]的措施是采用多种消毒剂的方法来控制耐氯菌。一般认为，在供水管网中变形菌纲中的α变形菌纲和γ变形菌纲细菌，厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）细菌可能存在一定种类的耐-6- 第1章绪论[5,14,46-48]氯菌。假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、鞘脂单胞菌（Sphingomonas）、食酸菌属（Acidovorax）、葡萄球菌属（staphylococcus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、军团菌（Legionella）、弗朗西斯菌属（Francisella）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella），是多数研究者报[11,14,15,32,36,40,49-53]道的常见的较为耐氯的菌属。含氯消毒剂对细菌的原生质直接氧化，损伤细胞膜，并破坏膜的渗透性，或者渗透到细胞内部，与菌体蛋白和酶蛋白中氨基、硫氢基发生不可逆的氧化[54,55]反应，从而使细菌完全失活。Cloete在总结前人研究的基础上，总结了细[55]菌对杀菌剂的抵抗机制，可以分为以下7点：（1）通过生物膜基质，限制消毒剂扩散；（2）通过酶解毒或降解杀毒剂；（3）生物膜中的多糖蛋白复合物与消毒剂发生反应、或中和、或通过疏水作用、或吸附消毒剂，保护细菌细胞不与消毒剂反应；（4）生物膜的细菌细胞通过降低生长速率进入慢速生长期或饥饿期，或进入孢子期等生理状态，以降低细菌细胞的敏感性；（5）生物膜细菌通过对消毒剂的胁迫应答机制，产生某些降解酶或修复酶，从而对亚致死浓度的消毒剂敏感性降低，并产生了适应，从而达到对消毒剂的抵抗作用；（6）细菌细胞膜上的脂多糖层高度疏水性，可以抵抗亲水性的消毒剂的渗透作用，而疏水的消毒剂可以被亲水性的膜蛋白排除在外，同时细胞可以调节细胞膜的孔蛋白的数目（缺失表达或过量表达）排斥消毒剂；（7）对异源物质通过外排泵排出。由上可知，细菌对消毒剂的抗性主要是两方面的原因：细菌的个体原因和细菌群体原因。细菌个体细胞的抗性原因主要是通过个体细胞对消毒剂的外排和抑制（上述机制的（1）、（2）、（7）），而细菌群体原因主要通过生物膜对消毒剂的抵抗（上述机制的（3）、（4）、（5）、（6））。在实际供水管网中以生物膜对[12]消毒剂的抵抗性占大多数，生物膜中的细菌群体还可以产生协同抗消毒剂[12,56]（氯）作用。在实际环境中，消毒剂对具附着在环境材料表面形成生物膜[6]或形成粘液的抗性细菌具有选择作用。因此，在供水管网中，主要的耐氯菌将存在于生物膜中，并且多物种的生物膜比单物种的生物膜对消毒剂更具抗性[2,57]。目前关于多物种生物膜具更高的抗性的现象的机制尚不清楚，但研究微[2]生物群落多样性和种间关系可以更好地揭示这一现象，为供水管网中耐氯菌特别是耐氯的致病菌的控制提供一定的理论依据。-7- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文1.2.4供水管网中微生物存在形式[42,58]根据Liu等人和Proctor等人的总结，可将供水管网中的细菌分为4个部分（图1-2）：主体水悬浮细菌、附着在生物膜的细菌、粘附在悬浮颗粒上的细菌、粘附在松散沉积物的细菌。而实际上，大多数研究者只是将供水管网中的细菌分为主体水和生物膜细菌两部分，除附着在生物膜的那部分，其它3部分都会到达用户端。主体水中颗粒一般为输送至管网中的胶体、悬浮固体或沉积在管道底部的松散沉积物重新悬浮。在正常管网输送条件下，悬浮固体会随着主体水的配送到达用户端；而松散沉积物只有在消防、管道冲洗、爆管、[42]大用户用水等突然的水力条件变化才会悬浮起来。供水管网的主体水是营养物、微生物、颗粒物质的输送媒介。因为主体水流入供水管道中，管道内壁才会形成生物膜。[58]图1-2供水管网中微生物存在形式[58]Fig.1-2Distributioninadrinkingwatersystem在生物膜的生长过程中，主体水中的微生物和有机、无机物质吸附或沉积在管壁上，同时也改变了管道表面电荷和疏水性特征，为微生物黏附创造有利条件。在水流冲击下有些微生物容易从管壁脱离，处于一种不稳定的可逆粘附状态；有些微生物可以紧密地附着在管壁，进一步形成结构复杂的生物膜。随着微生物的继续黏附或再生长繁殖，生物膜的群落结构逐渐复杂化，甚至原生动物（protozoa）、无脊椎动物（invertebrates）、病毒（viruses）等也出现在生-8- 第1章绪论物膜中。当生物膜生长到一定厚度后，由于生物膜的内部扩散限制，造成营养[59]物质和氧气不足引起微生物死亡，使生物膜脱落。生物膜的形成速率与营养[60]物质的供给、附着的微生物自身属性等有关，而脱落则与水力冲击、氧化剂[61,62][63]（消毒剂）对胞外聚合物的影响以及营养的缺乏等有关。最终在不同的供水管网中生长的生物膜微生物结构和群落多样性也千差万别。主体水中的悬浮细菌可以说与用户最直接关联，通常主体水中的细胞数目35[35,64]在10~10cells/mL，只占供水管网的总细菌数目的不到5%（也有研究者[17,65,66]68认为不到2%）。生物膜中活性细菌却至少要占80%以上，可达10~10[42]cells/mL，但通常对供水管网的取样困难，生物膜细菌的检测并不常见。在供水管网中的生物膜对供水管网会产生深远的影响，例如，生物膜对金属管材的微生物腐蚀（MIC），生物膜是主体水中的微生物的主要来源，生物膜脱落产生的饮用水色度、浊度、气味等问题，生物膜对消毒剂消耗进而引起供水管网[67]中大量微生物繁殖。其中，生物膜中微生物生长问题是最为需要关注的问题，[14]因为它们可能直接影响主体水中的微生物的浓度。因此，应该着重关注长期忽视的供水管网生物膜的研究。1.3供水管网生物膜生长的影响因素1.3.1供水管网生物膜生长的非生物学影响因素有许多非生物学因素诸如水力条件、管材、消毒剂类型及浓度、水体中营[46,67,68]养物质浓度、温度、pH等，都会影响生物膜的形成和生长。由于供水管网是由管材、主体水、运行条件等构成的一个极其复杂的动态体系，越来越多的研究者都会研究两种及以上的供水条件对供水管网生物膜的形成和生长。Garmy等人利用生物膜挂片旋转（AR）反应器的PC挂片，以50/200rpm的转速，经历不同的营养期（加入不同质量的葡萄糖，低营养-高营养-低营养）[69]模拟研究供水管网生物膜的生长情况，结果表明，在生物膜生长初期，流速影响生物膜的生物量产率、生物膜体积密度、生物膜结构。较高流速在生物膜的固液界面能够使溶液中的营养基质传输入生物膜的效率更高，从而能够得到更高的生物量产率。当营养条件发生改变时，生物膜可通过改变生长速率（降低）以适应营养条件的变化（减少）。营养基质负荷能够显著影响生物膜中细菌与EPS的比例，而与转速不相关。在较低的营养条件下，EPS的比例会较高，而在较高的营养条件下，细菌的比例会增加。而Wang等人利用AR反应器的PC挂片模拟不同TOC浓度水平（是否经过颗粒活性炭过滤出水）和不同消毒-9- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文剂水平对生物膜生长的影响，结果表明，TOC对生物膜中的细菌数目没有显著影响，对生物膜的多样性影响有一些，但也未达显著水平；而不同消毒剂浓度[70]对生物膜的细菌数目和种群多样性均有很大的影响。Gibbs等人利用给水模拟系统在铸铁和PVC管道中通入正常余氯（1mg/L）的市政自来水数周后发现铸铁对氯衰减的作用较大，使得余氯对铸铁系统（主体水和生物膜）的细菌的灭活性能不如PVC系统。在消毒过程中，随着生物膜对余氯的消耗，生物膜会源源不断地释放微生物，包括可能的致病菌、耐氯菌，比如说内生孢子（Endospores）。铸铁对微生物生物膜的生长影响更大，这[71]可能是因为铸铁与氯的反应特性造成的或者是铸铁表面比PVC表面要粗糙。而Wang等人对美国的皮内拉斯县的实际供水管网以氯胺消毒转化为氯消毒过程中微生物种群数量和多样性进行了研究发现，转换加氯后细菌种群显著改变，加氯期间硝化细菌的数量大大减少，而一旦恢复加氯胺，细菌的种群和数量又会慢慢恢复到原来的水平。影响硝化细菌和微生物群落组成的显著因素是水龄[72]和采样点位置，而不是管材。短暂的加氯，对控制硝化细菌等种群并不长久。2Tsai等人在AR反应器上设置3种剪切力（0.07、0.17、0.29N/m）和3种余氯浓度（0、0.26、0.57mg/LCl2）共9种实验条件模拟供水管网培养生物[73]膜，结果表明，进水余氯浓度和剪切力对生物膜的生长没有交互作用。生物2膜细菌数目随余氯的增加而降低，而剪切力增加到一定水平（0.29N/m）才会显著降低生物膜的生物量。余氯浓度和剪切力交互影响主体水的细菌数目和余氯的消耗速率。在无氯或低浓度氯条件下，生物膜的生长速率随着剪切力的增加而增加，在较高浓度余氯下，生物膜的比生长速率随着剪切力的增加而减少。Paris等人利用流动室（Flowcell）反应器在玻璃片上和4种不同剪切力条件下培养50天形成生物膜，运用显微照相和流式细胞仪等技术对生物膜生长的动态过程进行了研究。结果表明，在生物膜生长初期（22d），生物膜细菌的积累与剪切力成正比。之后，细菌的积累速度不再与剪切力成正比，在50天后的生物膜中，不同剪切力生长的生物膜数量基本相同，但生物膜上细菌的空间分布有很大的差异。水力条件对生物膜的细菌数目的改变并不明显，但改变了生物膜细菌的空间分布。而Adam等人利用环形管网模拟系统研究不同空间、时间在不锈钢管壁上生物膜生长情况却得出了不一样的研究结果，Adam认为同时期的生物膜在空间变化上不显著，而在时间变化上较为显著，并将0~49天的生物膜划分为幼龄生物膜，571~1093天划分为老龄生物膜。Alexander等人由4个不同直径的同心不锈钢圆柱体组成的同心柱反应器（CCR）模拟5种不同剪切力，以水厂出水为进水模拟运行3个月研究生物膜-10- 第1章绪论[74]生长情况，结果表明，生物膜上的细菌多样性随剪切力的升高而降低，高剪切力条件下培养的生物膜中能发生自聚集的细菌比例最高，且这些自聚集的细菌具较高的疏水性能，而相互发生聚集的细菌比例较高的生物膜则在中等剪切力条件生长，剪切力会影响生物膜多样性也会影响聚集细菌的相对比例。Mathieu等人利用实验室的环状管网模拟系统在水泥砂浆涂衬管上间断加氯，利用qPCR技术观察生物膜上的细菌种群变化，结果表明，生物膜中β变形菌和γ变形菌纲细菌比α变形菌纲细菌对氯敏感性要低，β变形菌和γ变形菌纲更适应0.4mg/L高浓度余氯，在间断加氯中，变形菌门的细菌种群变化是可逆[75]的，变换的氯浓度会使变形菌门细菌恢复至原来的状态。Chu等人在实验室的管道模拟系统研究3种余氯浓度下的不锈钢管上生物膜的生长情况，结果表明余氯的存在与否对生物膜的生长影响很大，不加氯的情况下比存在余氯的情况下，HPC要高2~3个数量级，余氯对已经成熟的生物膜的抑制作用要小于正生长形成的生物膜，随着培养时间的延长，余氯对生物膜的抑制作用会减少。芽孢杆菌能够存活在较高浓度余氯下的不锈钢管道生物[40]膜中。Vaz-Moreira等人在葡萄牙的某加氯供水系统（水厂+管网）中发现，加氯消毒明显降低了细菌多样性和可培养性，可培养性细菌从阴性菌占主要，变为阳性菌抗酸性细菌占主要。从源头到龙头只有变形菌门是优势门类，并且发现[36]α变形菌纲和β变形菌纲种群是其优势纲。Wang等人利用AR反应器的PC挂片模拟不同TOC浓度水平（是否经过颗粒活性炭过滤出水）和不同消毒剂水平对生物膜生长的影响，结果表明，TOC对生物膜中的细菌数目没有显著影响，对生物膜的多样性有一些影响，但也未达显著水平；而不同消毒剂浓度对生物膜的细菌数目和种群多样性均有很大的[70]影响。陆品品等人研究了中国华南某市的加氯的不同供水管网的龙头水的微生物多样性发现，变形菌门细菌在管网所有样品中均占优势，且α变形菌纲细菌在变形菌门中在较高余氯浓度（0.48~0.76mg/L）下仍能占据绝对优势，并且发现[33]管网中存在一定比例的致病菌（Acinetobacter、Sphingomonas和Gemella）。Xue等人研究认为氯的存在会影响细菌表面功能团（氢键、聚合作用、疏水作用），从而阻止细菌从可逆到不可逆附着，因此也就会妨碍生物膜扩散到新[61]的表面形成新的生物膜。张明露等人对北京某一自来水厂的清水池生物膜的多样性进行了研究发现经消毒后细菌多样性大为减少，α变形菌纲比例上升，特别是鞘脂单胞菌属-11- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文（Sphingomonas）的细菌由消毒前进水端的46.45%上升到了清水池末端消毒后[32]的95.57%。管运涛等人利用AR反应器研究了不同水力条件下PE管材上生物膜发育[76]52情况。结果表明，生物膜生物量在7d内便稳定在10CFU/cm，但是生物膜的种群结构却还远未达稳定状态。水力条件对生物膜发育的影响不大。王薇等人调查了中国东部某市实际供水管网中灰口铸铁、镀锌管和不锈钢复合管等3种管材对管壁生物膜微生物种群多样性的影响，结果表明：可培养菌数和细菌总数大小排序为：灰口铸铁管>镀锌管>不锈钢复合管。高通量测序表明，生物膜种群多样性以灰口铸铁管的最高，镀锌管的则相对较为单一，不锈钢复合管的最低。供水管网生物膜种群以Proteobacteria为主，各管道Proteobacteria都高达90%以上，不同管材生物膜的微生物群落结构组成差异很[77]大。由此可知，由于水源不同、供水条件不同、气候温度的不同，各供水管网的微生物的数量和种群有很大差别。研究表明，水中的营养物质浓度与细菌的[43,78,79]再生长呈正相关，消毒剂浓度与细菌的再生长呈负相关。另外，虽然温度、溶解氧和pH是影响微生物生长的主要因素，但对于已知的供水管网来说，这些条件要么在水厂出厂水就已经调节好，在管网输送过程中基本保持恒定（溶解氧和pH），要么就是在实际管网中是不可人为控制的（温度），因此并没有很多研究者对此进行研究。在供水管网中，管材对微生物的再生长和生物膜的形[80]成具有复杂的影响，管材和水力条件会随着供水管网的延伸发生明显的变化[78][14]。无论管道材质如何，管道内壁都会生长生物膜。同时，水力条件的变换对生物膜的累积和脱落具有重要作用，以往研究多集中在水力条件、水质因素[43,46,78,79,81]（消毒剂和营养物）对细菌和生物膜的生长的影响上，而对水力条件与管材因素对细菌和生物膜的生长的影响研究较少，仍处于起步阶段，有关管材和水力条件模拟试验研究的报道还不多见。饮用水在供水管网系统中的水质稳定是实现安全优质供水的重要环节，对不同地区的供水管网系统生物膜进行针对性的研究，可以更合理地为保障特定地区的供水安全提供依据。1.3.2微生物种群对供水管网生物膜生长的影响生物膜的生态学是一个在附着生长条件（可能存在水力剪切）下，并存在由生物膜中微生物或占优势的微生物种群分泌的微生物代谢产物和信号小分子[82]（细胞信号通讯）的复杂功能集合体。在不同的生长条件下，细菌有能力发出信号并感知生物膜种群的密度并适时调整自身的生理状态，这种现象通常被-12- 第1章绪论[83]称为群体感应（Quorumsensing，QS）。因此，群体感应是一种细胞通讯控制的一种策略，这样可以使生物膜微生物群体避免不必要的过度繁殖和营养物[84]竞争。已有研究证明，群体感应在生物膜的细胞附着和脱落发挥着重要作用[85,86]。生物膜细菌作为外来入侵微生物，通过细胞间的相互作用和通讯交流的[87,88]复杂系统帮助适应不断变化的新环境。这些成功附着在生物膜表面的细菌[86]通过感知和响应外部环境，调节相应基因的表达来适应新的环境。材料表面可以提供一个生态位来促进细菌细胞之间复杂的相互作用的演化[89]。一旦细菌细胞被生物膜牢牢地束缚住，那么细菌群体的活动就要依赖于各[89]物种的代谢和生长。这种代谢活动包括营养物的摄取、细胞生长和繁殖，以[82]及胞外聚合物的合成。生物膜细胞群体的作用包括细菌种内群体的相互作用和细菌群体的种间的相互作用。微生物的代谢活动造成了生物膜表面的化学界面在时间和空间的梯度演变，也创造了一些在主体水相中才有的条件（在水相[90]中传质较好）。由上可知，供水管网生物膜是一个粘附在惰性或活性管材表面上，复杂的动态变化的微生物群体生存环境。这些微生物群体生活在一种贫营养条件仍维持较高浓度余氯的极端环境体系中。在实际环境中，不可能只是单物种的生物膜存在于供水管网中，在供水管网中通常都是复杂的多种微生物种群的混合生物膜。在此环境下，供水管网生物膜的微生物可以通过不均匀分布和生物群体[5,91]的相互作用来适应这种环境。在微生物的世界中，营养物的竞争是物种进化的主要驱动力之一。一些微生物因为能够更好地利用一些营养物可以更有效[92]地战胜竞争对手。任何微生物群体在结构、组成和功能上都会有复杂的相互作用。细菌物种之间的相互作用可能对生物膜形成和生长的初期产生深远的影响。因此，研究供水管网生物膜的种群间相互作用可以提高我们对供水管网中[89]的包括致病菌在内的微生物的存在的认识，也可以探索一种控制供水管网中[1]条件致病菌的新方法。在诸如供水管网的低营养环境中，寡营养专性细菌将会首先在供水管网中[93]附着，接下来富营养细菌才会利用寡营养细菌的分泌物或排泄物附着，因为[94]营养的竞争，竞争作用将会在微生物群落结构形成发挥重要角色。竞争关系（competition）是指两种微生物通过争夺生存空间和食物而相互抑制对方，竞[94-97]争的结果对两个群体均产生不利的影响，使两个群体的密度下降。协作关系（synergism）是指两个微生物群体生活在一起，互相获利，微生物群体密度增加，但这两者之间的关系没有专一性，它们分开时，能单独生活在各自的自然环境中。中性关系（neutralism）是指两种微生物各自的生命活动对对方既不-13- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文产生利益，也不产生危害，即微生物群体密度与原先微生物各自存在时的密度相差不大。然而，目前，研究供水管网生物膜的种群间相互作用的文献寥寥无几，仅见于国外的一些报道和综述中。表1-2列出了目前在国外文献报道的类似于供水管网的生物膜中细菌群体的种间相互作用。Simoes等人利用96孔细胞微培养板对Sphingomonascapsulata、Burkholderiacepacia、Staphylococcussp.、Acinetobactercalcoaceticus、Mycobacteriummucogenicum和Methylobacteriumsp.等6种菌的两两混合的生物膜的种间关系进行了研究，结果表明，Sphingomonascapsulata+Burkholderiacepacia、Sphingomonascapsulata+Staphylococcussp.和Burkholderiacepacia+Acinetobactercalcoaceticus混合表现为协作/合作关系；Sphingomonascapsulata+Mycobacteriummucogenicum、Sphingomonascapsulata+Acinetobactercalcoaceticus和Mycobacteriummucogenicum+Staphylococcussp.混合表现为竞争关系；Methylobacteriumsp.+Mycobacteriummucogenicum、Sphingomonascapsulata+Staphylococcussp.、Mycobacteriummucogenicum+Acinetobactercalcoaceticus和Methylobacteriumsp.+Acinetobactercalcoaceticus混合表现为中性关系。同时研究了种间关系的可能原因，只有Sphingomonascapsulata和Staphylococcussp.两种菌会产生群体感应物质（quorum-sensinginhibitors，QSI）。Zhang等人利用平面流动室反应器（planarflowcell）研究了PseudomonasaeruginosaPAO1和Flavobacteriumsp.CDC-65两种菌及其混合在不同流动速[98]率下的生物膜生长的情况，结果表明：外部流动条件对混合菌的相互作用影响很大，混合菌的协同或竞争作用因流动条件的不同而不同，低流速条件下，有限的营养条件，使混合菌更倾向于竞争关系；而高流速条件下则削弱了混合菌的竞争作用，两菌倾向于协作关系，因为高流速条件下，传质的加快，给细菌提供了更多的营养，同时协作可以共同抵御水力作用的剪切。但协作和竞争的界限很难区分和预测，也会随着个体细菌的行为有所差异。Christensen等人利用恒化器（chemostats）悬浮培养和流动室反应器附着生物膜培养研究了PseudomonasputidastrainR1和AcinetobacterstrainC6两种菌[92]及其混合菌在以苯甲醇为唯一碳源时的两种菌的种间关系，结果表明，在悬浮混合培养时菌株C6利用苯甲醇的效率要高于菌株R1，两种菌表现为竞争关系；而在生物膜中由于生物膜的不均匀性，菌株R1可以利用菌株C6的中间产物进一步降解，两菌表现为共生关系，菌株C6主要存在于固液两相的界面中，而菌株R1则主要存在于生物膜中，因此PseudomonasputidastrainR1和-14- 第1章绪论AcinetobacterstrainC6两种菌的种间关系会随着营养物水平、培养基质条件的变化而变化。表1-2目前报道的类似于供水管网的生物膜中细菌群体的种间相互作用Table1-2Relevantinterspeciesinteractionsinanalogousdrinkingwaterbiofilmcommunities种间关系菌株文献Sphingomonascapsulata+Burkholderiacepacia；Sphingomonascapsulata+[94]Staphylococcussp.；Burkholderiacepacia+Acinetobactercalcoaceticus协作/合作[98]PseudomonasaeruginosaPAO1+Flavobacteriumsp.CDC-65[92]PseudomonasputidastrainR1+AcinetobacterstrainC6Sphingomonascapsulata+Mycobacteriummucogenicum；Sphingomonas[94]capsulata+Acinetobactercalcoaceticus；Mycobacteriummucogenicum+Staphylococcussp.[98]PseudomonasaeruginosaPAO1+Flavobacteriumsp.CDC-65拮抗/竞争[92]PseudomonasputidastrainR1+AcinetobacterstrainC6Legionellapneumophil+Pseudomonasspp.（Acinetobacterspp.，Flavobacterium[1,99-101]spp.，Stenotrophomonasmaltophilia，Aeromonashydrophila，Burkholderiacepacia，Bacillusbrevis，Acidovoraxspp.和Sphingomonasspp.）Methylobacteriumsp.+Mycobacteriummucogenicum；Sphingomonas[94]中性capsulata+Staphylococcussp.；Mycobacteriummucogenicum+Acinetobactercalcoaceticus；Methylobacteriumsp.+Acinetobactercalcoaceticus由上可知，微生物的种间作用与它们所处的环境密切相关，环境不同，它们的种间作用也可能就不同。最近在供水管网微生物生态学的研究发现，微生[2,5,89,102]物群落多样性和种间关系也影响着微生物对消毒剂抗性。另外，也有研究者提出，利用供水管网的微生物的生态位的竞争和拮抗关系，从而对供水[1]管网中的一些致病菌进行控制。随着研究的深入，供水管网的微生物生态学必将得到应有的重视和更广的应用。1.4课题来源本课题来源于国家自然科学基金项目“基于分子生物学的供水管网中耐氯菌的鉴别及其多样性研究”（项目号：51108123）。-15- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文1.5研究内容和技术路线综上所述，由于供水管网中微生物的生长是一个复杂的过程，受许多可变的因素交互影响，如温度、季节营养、水质条件、水龄、消毒剂类型及浓度等[1,42]，研究者对供水管网中微生物的研究并不深入，并且研究结果也因人而异。供水管网生物膜通常都是复杂的微生物种群生物膜，对供水管网生物膜形成时的微生物生态学的研究，目前国内还没有人研究。由于供水管网是一个贫营养条件并维持较高浓度余氯的极端环境体系，供水管网的耐氯菌主要存在生物膜中，关于耐氯菌在生物膜中特别是多物种生物膜中具更高的耐氯性的现象和机制也尚不清楚，另外目前也很少有人从源头到龙头研究生物膜中耐氯菌的数量和种群多样性。本文对供水管网中耐氯菌群及其耐氯机制进行研究，以期为供水管网中的微生物安全的评估、预防和控制提供理论基础。其主要研究内容如下：（1）采用耐氯菌的检测计数法对东北某市净水厂加氯后和供水管网中不同采样点的主体水和生物膜中的耐氯菌的数量进行分析，并运用IlluminaMiSeq高通量测序技术研究了不同采样点的生物膜中的耐氯菌种群变化规律。（2）通过供水管网动态模拟系统，以东北某市市政供水为进水，在大于1mg/L的余氯浓度下，采用平板计数法、流式细胞技术法和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）等分析技术研究了管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响。（3）利用96孔微量细胞培养板振荡培养法，对在供水管网动态模拟系统分离的5种耐氯菌进行单一培养、两两混合培养、4种或5种多菌混合培养形成生物膜，比较不同时期生物膜的生物量、活性、细菌总数，并依此全面评估不同耐氯菌及其混合的生物膜形成能力和耐氯菌的菌群作用关系。（4）针对上述不同供水管网生物膜细菌加入不同浓度的余氯进行消毒，研究了不同生物膜细菌的耐氯性，并从耐氯菌个体、种间作用和群体效应方面分析了不同生物膜细菌的耐氯机制。基于以上研究内容，本研究的技术路线如图1-3所示：-16- 第1章绪论供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制研究稳定余氯余氯变化固定管水厂滤池、清水池和条件下条件下材中3种供水管网前、中、末端5种管材3种管材流速主体水生物膜主体水生物膜加氯耐氯菌种群多样性耐氯菌数目耐氯菌种群多样性（IlluminaMiSeq）耐氯菌数目（DGGE）实际供水管网耐氯菌数量、种管材及流速对供水管网中耐氯群分布规律菌生长的影响分离纯化五种代表性的耐氯菌单一菌种、两两混合、4或5种多菌混合96孔培养板形成生物膜不同时期加氯生物量生物活性细菌总数生物量细菌总数生物膜细菌的耐氯性耐氯菌的生物膜形成能力耐氯菌群作用关系生物膜细菌的耐氯机制供水管网中耐氯菌的控制策略图1-3本研究的总体技术路线Fig.1-3Technologyroadmapofthisstudy-17- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文第2章实验材料与方法2.1实验装置为研究某市以地表水为水源的供水管网的耐氯菌的生长规律，本实验以实际供水管网和实验室管网动态模拟系统为研究对象，各系统装置介绍如下。2.1.1以地表水为水源的供水管网[103]该供水管网由典型的寒区湖库型水源净水厂供水，实验期间该水厂原水浊度为0.34-14NTU，pH值6.10~7.49，碱度（CaCO3）8~48mg/L，氨氮为0.04~0.20mg/L，由于原水的氨氮低，在清水池和供水管网中，对氯消毒基本不产生影响，因此在本研究中不考虑氨氮对消毒的影响。净水厂建于2006~2009年，常规处理工艺（机械混合+水平轴机械絮凝+斜管沉淀+双层滤料翻板滤池过滤+液氯消4343毒），设计总供水能力90×10m/d，目前实际最高日供水量约为79×10m/d，43平均日供水量67×10m/d。根据该市的区域供水管网特征和水质特点，选取具有代表性的供水管网开展对比分析，该水厂的供水管网取样点基础信息见表2-1。2.1.2生物膜挂片环形反应器为了研究不同管材对耐氯菌生长的影响，共选用5种常用管材的挂片（铜（Cu），聚乙烯（PE），304不锈钢（不锈钢/STS），铸铁（CI）和水泥砂浆涂层的聚碳酸酯（水泥砂浆/CP）挂片）进行试验。其中，Cu、CI和CP挂片购自美国BioSurface技术有限公司，304不锈钢（简称不锈钢）挂片根据国标（GB/T12771-2000）生产的304不锈钢板材加工而成；PE挂片根据国标（GB/T13663-2000）生产的PE管材加工而成。利用国际上通用的生物膜挂片环形反应器（AR）（型号1320LJ，美国BioSurface技术有限公司）来模拟饮用水输送系统，见图2-1和图2-2。AR反应器由固定的外筒和旋转的转子组成，由配套的电机驱动转子转动，转子上挂有20个挂片，每个挂片生物膜附着的面积约为215.9~18.9cm。实验前将AR反应器和挂片用洗液清洗干净，之后再用70％乙醇（v/v）和蒸馏水冲洗3遍，干燥待用。-18- 第2章实验材料与方法表2-1供水管网中取样点Table2-1Thesamplesitesinthedrinkingwaterdistributionsystem编水龄距水厂（二泵站）材质（管材）和建设时间规格号（h）距离（km）121m×90m×4.6m，死库容H100清水池，水泥砂浆，建于2006~2009年为深0.5mH20.20.3水厂自用，PPR管，建于2012年树状管网末端进水管材（铸铁和镀锌铁），水箱材质为4.5m×3.0m×2.25m，死库H39.511.5玻璃钢，建于20世纪90年代初容为深0.1m进水管材（铸铁和镀锌铁），水箱材质为6.0m×4.0m×2.45m，死库H412.015.0镀锌铁，建于20世纪80年代初容为深0.1m进水管材（铸铁），水箱材质为水泥瓷砖，8.0m×6.0m×3.20m，死库H521.024.0建于20世纪80年代末容为深0.15m水泥砂浆铸铁管，始建于20世纪80年树状管网，管径H6*21.024.0代末100mm*H6采样点为H5采样点的二次供水管网。调节阀龙头水进水加氯排出NaClO储存液AR反应器蠕动泵图2-1AR反应器示意Fig.2-1Schematicdiagramoftheannularreactor-19- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文图2-2生物膜挂片环形反应器（AR反应器）Fig.2-2Annularreactor2.1.3供水管网动态模拟系统供水管网动态模拟系统如图2-3和图2-4所示。其中高位水箱材质为3043不锈钢，容积为1.2m，低位水箱材质为PVC，容积为50L，管段生物膜反应器为20段串联的小管段，PE管段长10cm，由外径30mm，壁厚3mm的新管道加工而成，304不锈钢（在下文中简称不锈钢）管段长12.5cm，由外径25mm，壁厚1mm的新管段加工而成。由于铸铁管管径普遍大于100mm，因此将直径800mm的铸铁新管段加工成挂片形式，挂片长12cm，宽2.5cm，厚0.9cm。高位水箱连接到低位水箱的干管为不锈钢管，其它辅助管道材料为PVC管，阀门为不锈钢材质。实验装置组装前，先将新购置的PVC管和低位水箱用10mg/L的NaClO溶液浸泡一个月，期间每3天换一次水，以降低PVC材质对水质的影响。之后，将实验新管段、PVC管和低位水箱先用洗液清洗一遍，再用70%（v/v）乙醇浸润冲洗一遍，用去离子水冲洗3遍，干燥待用。实验装置组装后，自来水注入高位水箱后，加入NaClO溶液搅拌使其余氯终浓度约为30mg/L，此后开启阀门1和水泵1，待30mg/L余氯的自来水注满低位水箱后关闭阀门1和水泵1，此时开启阀门2、3、4和水泵2以一定流速闭路循环运行2h，之后开启阀门5将水排出，此后重复上述步骤通过开关阀门和水泵状态注水、排水重复运行数次，以去除新供水管网动态模拟系统中管道的残留的微生物和杂质。供水管网动态模拟系统前处理完毕后，自来水注入高位水箱后，加入NaClO溶液（pH-20- 第2章实验材料与方法值调至近中性）后搅拌稳定2h。此后开启阀门1、2、3、5和水泵1、2，以新配制水样代替低位水箱和实验管道旧水，避免引入空气和扰动管道沉淀物，使水通过供水管网动态模拟系统直流排出，整个排出置换水过程持续约10min；此后，先开启阀门4，待自来水注满低位水箱后关闭阀门1和水泵1，之后再关闭阀门5。根据实验需要控制管材、余氯和流速等参数在管道内循环流动24h或12h。图2-3供水管网动态模拟系统示意Fig.2-3Schematicdiagramofdrikingwaterdistributionsystemsimulator图2-4供水管网动态模拟系统Fig.2-4Drikingwaterdistributionsystemsimulator-21- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文2.2实验设备和试剂2.2.1主要仪器设备试验所采用的主要仪器设备如表2-2所示。2.2.2实验主要试剂DAN提取试剂盒（美国MOBio）、ExTaq酶（大连TaKaRa）、过硫酸铵（美国Sigma）、TEMED（美国Sigma）、双甲叉丙烯酰胺（美国Sigma）、聚丙烯酰胺（美国Sigma）、硝酸银（美国Sigma）、尿素（美国Sigma）、IPTG（美国Sigma）、X-gal（美国Sigma）、琼脂糖（Bioweat）、氨卞青霉素（美国Sigma）、胰蛋白胨（英国Oxoid）、酵母提取物（英国Oxoid）、琼脂（英国Oxoid）、DNA分子量标准DL2000（大连TaKaRa）、pMD18-T载体（大连TaKaRa）、大肠杆菌感受态细胞DH5α（北京天根）、胶回收试剂盒（美国Omega）、SYBRGreenI（瑞士Invitrogen）、琼脂糖（西班牙Biowest）、结晶紫（天津光复）、甲醇（上海国药）、XTT粉（3,3"-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠，美国Sigma）、甲萘醌（维生素K3，美国Sigma）。其它实验试剂为国产分析纯级试剂。2.3常规分析项目及检测方法+-2--试验中温度、浊度、pH、NH4、Cl、SO4、NO3、TOC、总氮、总磷、总铁、总溶解性固体、总硬度、总碱度等常规指标分析均按国家标准方法测定[104,105]，余氯的测定方法采用DPD（N,N-二甲基-1,4-二苯胺）比色法。2.4微生物分析项目及检测方法2.4.1生物膜采样方法将管段（挂片）或实际附着材料上的生物膜用无菌蒸馏水轻轻润洗数遍以去除任何松散附着菌（这些松散附着菌不被认为是管壁生物膜细菌的一部分），用灭菌的小刀刮取或毛刷刷取（依采样条件定）管壁或附着材料上的生物膜。对于需要作微生物形态观察的样品直接固定；对于需要细菌计数的生物膜样品，悬浮于一定体积的无菌水中等待计数；对于需要进行分子生物学鉴定的样品则立即放入-20ºC冰箱保存。-22- 第2章实验材料与方法表2-2主要仪器设备Table2-2Themaininstrumentsandequipments仪器型号生产厂家紫外可见分光光度计T6新世纪北京普析通用仪器有限公司离子色谱仪ICS-3000美国Dionex（戴安）公司常多参数水质分析仪HACHHQ40D美国哈希公司规便携式余氯测量仪HACHPC-II美国哈希公司检TOC测定仪TOC-VCPH日本岛津公司测浊度计HACH2100P美国哈希公司项马弗炉SX2-4-10上海博迅实业有限公司目蠕动泵BQ50-1J河北保定兰格恒流泵有限公司超纯水仪Milli-Q美国Milliopore公司超净工作台DL-CJ-2ND哈尔滨市东联电子有限公司真空泵SHB-3河南郑州杜甫仪器厂超声波清洗器KQ-700江苏昆山超声仪器有限公司流式细胞仪AccuriC6美国BD公司高压灭菌锅YXQ-LS-50SII上海博迅实业有限公司全温震荡箱SPX-100B-D上海博迅实业有限公司生化培养箱MJX-160B-Z上海博迅实业有限公司微微量移液器10μL~1000μL德国Eppendorf公司生雪花制冰机XB70美国Grant公司物低速离心机TDZ5-WS湖南湘仪离心机仪器有限公司检离心机Eppendorf5418德国Eppendorf公司测DNA浓度测定仪NANODROP2000美国ThermoFisher公司项TM电泳仪PowerpacBasic美国伯乐公司目梯度PCR仪S1000美国伯乐公司凝胶成像系统GelDoc2000美国伯乐公司TM突变检测系统Dcodesystem美国伯乐公司扫描仪PowerLook1000Umax公司扫描电子显微镜Quanta200美国FEI公司酶标仪Model-680美国伯乐公司微型细胞培养板（酶标板）96孔U型美国康宁公司-23- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文2.4.2微生物形态观察2.4.2.1纯培养细菌形态观察细菌个体较小（一般1µm左右），普通的光学显微镜很难观察到其具体形态，因此本实验采用扫描电镜观察细菌形态，具体步骤如下：（1）培养：将预处理菌株接种到40mL左右的R2A液体培养基中，于25ºC120rpm摇床中恒温培养3-5天；（2）富集：取2mL上述培养液转移到2mL离心管中，置于离心机中5000rpm离心5min，倒掉上清液，重复数次；（3）固定：向上述离心管中加入2.5%戊二醛，并在4ºC下放置过夜；（4）冲洗：用pH7.0的PBS冲洗3次，每次10min；（5）脱水：先用50%、70%、80%、90%乙醇（v/v）进行梯度脱水，每次10min，然后用无水乙醇脱水3次，每次10min；（6）置换：用无水乙醇：叔丁醇（1:1）、纯叔丁醇各置换一次，每次10min；（7）干燥：用HCP-2型（HITACHI）临界点干燥仪进行干燥；（8）粘样：将样品观察面朝上粘贴在样品台上；（9）喷金和镜检：用E-1010（HITACHI）型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层厚度15nm金属膜。在Quanta200环境扫描电子显微镜（美国FEI公司）上观察。2.4.2.2生物膜微生物形态观察采用扫描电镜观察上述生物膜的形态，扫描电镜样品前处理方法如下：（1）样品在2.5%的戊二醛溶液中4ºC固定过夜；（2）倒掉固定液，用0.1mol/L，pH7.0的PBS漂洗样品三次，每次15min；（3）冷冻干燥；（4）样品黏附在样品台上，喷金，在Quanta200环境扫描电子显微镜（美国FEI公司）上观察。2.4.3细菌计数2.4.3.1异养菌平板计数测定细菌总数研究表明，消毒后的细菌再生长可分为3部分：消毒后活细菌的再生长，[106]细胞受损（暂时）失活细菌的复活，复活细菌的再生长。异养菌平板计数（HPC）[107,108]是供水管网中监测微生物水质的一个常见指标，目前供水管网中的很多[43,107,109,110]微生物水质模型就是基于平板计数法建立起来的。由于供水管网中的微生物已经适应了贫营养环境，很多微生物不能在传统的高营养物质的营养琼脂培养基中生长。研究结果表明，R2A培养基相对于营养琼脂（PCA）培养-24- 第2章实验材料与方法基更能够反应实际供水管网中的营养条件，R2A的异养菌平板计数（HPC）结[111-113]果要远高于PCA的平板计数。而且R2A平板计数法正可以检测出被消毒剂损伤的细菌，耐氯菌在R2A培养基上生长良好，供水管网的许多微生物[108,112,114]的纯培养鉴定也是基于HPC-R2A的方法，相对比较灵敏。因此本实验采用R2A培养基培养供水管网中的微生物。R2A培养基成分为：酵母提取物0.50g，胰蛋白胨0.50g，酸水解酪素0.50g，葡萄糖0.50g，可溶性淀粉0.50g，丙酮酸钠0.30g，K2HPO40.30g，MgSO4·7H2O0.05g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。在加入琼脂前用结晶的K2HPO4或KH2PO4调整pH值为7.2，对于液体培养基则不需加入琼脂。加入琼脂后，加热培养基使其沸腾，琼脂溶解后121ºC高压灭菌20min。将待计数的生物膜悬浮液置于超声波振荡器中冰浴超声振荡1min，间歇1min，如此重复3次，然后再漩涡振荡30s，使生物膜中的细菌能够均匀分布在悬浮液中，之后将悬浮液稀释适宜浓度在R2A固体培养基上进行异养菌总数平[7]板计数（HPC-R2A）。对于主体水，滤后水和供水末端水样直接倍比稀释，涂布于R2A固体培养基上；清水池、供水前端或消毒灭菌水样用0.22μm滤膜过滤10~100mL的水样，然后将滤膜截滤微生物的一面向上贴于R2A固体培养基上进行HPC计数。将处理好的R2A培养基平板放于20ºC倒置恒温培养10d，即可获得异养菌平板计数。2.4.3.2流式细胞仪测定细菌总细胞数基于流式细胞仪测定供水系统中的细菌总细胞数具有时间快、灵敏度高等优点，目前已有越来越多的研究者应用流式细胞仪测定供水管网中的细菌总细[115-117]胞数。在管材对生物膜生长的影响实验中，于0.5mL水样或稀释的生物膜悬浮液中加入5μLSYBRGreenI染色剂储备液（100倍稀释），在30ºC金属浴中避光染色10min，然后用AccuriC6流式细胞仪测定。测试水样细菌细胞浓35度应该控制在10~2×10cells/mL范围，当细菌细胞浓度超出该范围时需要进行稀释，为了不影响测试结果稀释液使用0.2µm滤膜过滤的Evian水。该过程从开始到得出结果大约需要15分钟，较传统平板计数法大大地提高了检测效率。仪器参数设置如下：流速为中速（mediumfludics），测定体积为50µL，阈值为600（FL1），AccuriC6相对于PartecCyFlowSL更加简单易于操作，但必须保持仪器清洁。-25- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文2.4.4微生物群落多样性分析2.4.4.1基于16SrRNA序列的变性梯度凝胶电泳TM将生物膜样品用PowerSoilDNAIsolationKit（美国MoBio）试剂盒提取生物膜上细菌总DNA。PCR反应体系为10×ExTaqbuffer5μL，dNTP4μL（2.5mM），引物各0.5μL（2.5μM），DNA模板2μL，ＥxTaqDNA聚合酶0.8μL，双蒸水37.2μL；PCR反应条件为94ºC预变性8min,94ºC50s，55ºC50s，72ºC50s，35个循环，72ºC10min；所用引物为真细菌通用引物，引物序列分别为8F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’），带GC夹。之后取500ng的PCR产物进行DGGE分析，采用美TM国Bio-Rad公司Dcode通用突变检测系统，电泳条件：聚丙烯酰胺浓度40%~60%，电压90V，温度60ºC，时间12h，然后进行银染，将DGGE图谱中的主要条带切下来碾碎并置于30μL的1×TE40ºC恒温水浴4h，然后于12000rpm离心3min，取3μL上清液作为模板，用上述PCR通用引物（不带GC夹）进行PCR扩增，然后用胶回收试剂盒纯化PCR产物，将纯化的PCR产物连接到pMD18-T载体上并转化到大肠杆菌DH5α中，随机挑选3个白色克隆进行PCR检测，将阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果与NCBI的BlastX进行序列比对，并挑选相关序列用MEGA5.2软件，以邻近距离法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，自展评估1000次。2.4.4.2基于16SrRNA序列的IlluminaMiSeq高通量测序将该市水厂和实际供水管网的的生物膜样品用PowerSoil™DNAIsolationKit（美国MoBio）试剂盒提取细菌总DNA，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基于16SrRNA序列IlluminaMiSeq高通量测序。具体步骤如下：用于测序的细菌16SrDNAPCR扩增引物为，Primer515F：GTGCCAGCMGCCGCGG；Primer907R：CCGTCAATTCMTTTRAGTTT。PCR采用TransGenAP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase，20μL反应体系，5×FastPfuBuffer4μL，2.5mMdNTPs2μL，ForwardPrimer(5μM)0.4μL，ReversePrimer(5μM)0.4μL，TemplateDNA10ng，FastpfuPolymerase0.4μL，补ddH2O至20μL。PCR反应参数：a.1×(95ºC2min)，b.25×(95ºC30s；55ºC30s；72ºC30s)，c.72ºC5min。全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（美国AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用-26- 第2章实验材料与方法QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，连接“Y”接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，按照每个样品测一万条序列加入1ngPCR产物的标准富集产物，然后用0.1M的NaOH溶液变性，获得单链DNA片段，构建测序文库后与8pM的等量PhiX试剂（美国Illumina公司）混合，最后上样600μL的混合DNA库，加入read1、read2和Index测序引物到500-cycle(2×250pairedends)试剂盒，在MiSeq仪器（美国Illumina公司）上完成测序。Miseq测序得到的PEreads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后，利用Uparse、Mothur、Fasttree等软件进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU可以进行多种多样性指数分析，基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，可以进行一系列群落结构和系统发育等深入的统计学和可视化分析。2.5实验研究方法2.5.1实际供水管网耐氯菌的检测在该市某净水厂清水池和供水管网（二次供水水箱）清洗期间（一般为4~5月），H1采样点采集清水池出水端下部距池底高0.5m处约50cm×50cm面积2池壁生物膜，H2采样点采集连接水龙头PPR管约100cm面积的管内壁生物膜，H3~H5采样点采集二次供水水箱进水端下部高0.15m处约30cm×30cm面积池壁生物膜，H6采样点采集管道维修期间的管道生物膜。在清洗前，开展供水管网的主体水水质测定，为期1年，每月采集水样一次。所采得的生物膜和主体水水样及时运回实验室，并保存在4ºC冰箱，在8h内进行相关项目的分析，用于IlluminaMiSeq高通量测序的生物膜样品存于-20ºC冰箱中。其中耐氯性细菌检测的水样与生物膜在同一时期内采集。表2-3为供水管网不同取样点主体水水质，由表所知，除细菌总数之外，[104,105]其它水质指标均按国家标准方法测定，该水厂的出厂水（H1）均优于《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》规定的相应水质指标，出水水质较好。由于[113]现行饮用水中菌落总数检验方法的局限性，并不能检出水中所有的细菌，某些由于消毒不彻底而导致的损伤型细菌，在规定的培养温度和培养时间，在营[112]养琼脂培养基上并不能形成可见的菌落，从而导致菌落总数的检出率偏低。-27- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文研究表明，R2A培养基适合培养贫营养环境中的微生物，比营养琼脂培养基具[118]有更好的灵敏度。因此R2A培养基的检测结果与《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》（PCA培养基测定）规定的菌落总数限值（100CFU/mL）并没有可比性，也不能直接做比较。目前，美国、德国等国家不仅制定了更为先进的饮用水指标，而且采用了新型的培养基，如贫营养的R2A培养基或者TSA-SB培养基，同时通过降低培养温度（20ºC~28ºC），延长培养时间等方法检测饮用水[113]中的HPC。相应地在美国EPA的饮用水水质标准规定用R2A培养基检测出[119]来的HPC就不能超过500CFU/mL。在出厂水0.6mg/L余氯水平下，自来水经24km、21h的管网输送，细菌总数仍然能够达到美国标准要求的HPC-[119][120]R2A小于500CFU/mL。清华大学的陆品品利用R2A培养基测定了南方某市氯胺消毒管网的主体水样品发现从出厂水到供水管网中的细菌总数（HPC）为10~10000CFU/mL，多数样品在500CFU/mL以下，少数样品超过500CFU/mL，甚至达10000CFU/mL以上。表2-3供水管网不同取样点主体水水质Table2-3Bulkwaterqualityinthedifferentsamplingsitesofdrinkingwaterdistributionsystem取样点H1H2H3H4H5/H6水质指标(单位)水温(ºC)9.59.710.310.410.5浊度(NTU)0.320.420.350.310.43pH6.916.936.926.966.95余氯(mg/L)0.620.410.390.310.24+NH4(mg/L)0.110.130.0920.120.069-Cl(mg/L)12.5413.3613.1913.6414.022-SO4(mg/L)4.806.345.526.186.51TOC(mg/L)1.871.982.012.091.93总铁(mg/L)0.110.100.150.160.19总溶解性固体(mg/L)37.839.439.539.743.1总硬度(以CaCO3计,mg/L)29.331.525.725.323.8总碱度(以CaCO3计,mg/L)21.120.222.323.525.5HPC(R2A,CFU/mL)43138145191362-28- 第2章实验材料与方法如表2-3所示，在一个完整的监测周期内，供水管网中的细菌再生长现象随着供水管线的延长有增大的趋势，但相关不显著。供水管网中细菌数目与管材、管龄相关度不明显，在新管网（管龄1-4年）中细菌再生长现象仍然很普遍，很严重。供水管网中细菌数目与消毒剂浓度呈一定的负相关（r=-0.51，p=0.04），细菌再生长现象在管网中由于消毒剂的存在受到一定程度的抑制，但这种抑制很有限，在余氯浓度大于0.2mg/L时仍然存在大量的细菌。Zhang等人在美国北卡罗莱纳州Durham县的两座加氯供水管网中也发现了细菌再生长现象，并且认为消毒剂浓度是决定HPC水平的最重要因子，管网中的细菌再生长是管网中水质化学、物理及运行参数等复杂的交互作用结果，而不是简单的[121]统计学关系。[75,120]耐氯菌的检测参考Mathieu等人和陆品品的方法，并做适当修改。根据该市水厂的运行经验，氯消毒接触时间30min以上，余氯浓度常年维持在0.5~0.7mg/L以上，鉴于此，选择0.6mg/L的余氯浓度作为耐氯菌的检测余氯浓度。在本研究中，认为在该水厂供水系统中能耐0.6mg/L的余氯的细菌即为耐氯菌。对于生物膜样品，在加氯前，引入超声波和漩涡振荡法分散细胞群体生物膜，使生物膜中的个体细胞释放出来，尽量减少消毒剂在生物膜基质中扩散限制和反应抑制作用，使氯更容易地进入到微生物细胞的表面，能有效地与[12,56]耐氯菌接触进行消毒作用，使得真正的耐氯菌得以检出。对生物膜悬浮液（经超声波和漩涡振荡处理）和主体水样品，置于经过灭菌处理的取样瓶（1L棕色细口瓶，密封），在样品中保持一定浓度的Cl2消毒剂（根据出厂水的平均余氯浓度，加入NaClO溶液（pH值调至近中性），由于生物膜悬浮液会消耗[122]更多的余氯，因此在生物膜悬浮液中比主体水中多加20%~50%的余氯，混匀，待余氯稳定后再测余氯浓度，使主体水和生物膜悬浮液的余氯终浓度均保持在0.60mg/L，常温过夜静置12h后，依据2.4.2的检测方法取样测定处理后水样中的HPC-R2A值，重复3次测定，作为管网出水和生物膜中可能的耐氯菌检测值。2.5.2管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响本研究分析了管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响，实验用水均为某寒区湖库型水源供水管网的自来水。实验期间进水水质如表2-4所示。共分为以下3个实验。-29- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文表2-4试验用水水质Table2-4Mainparametersofwatersamplesusedintheexperiments水质指标(单位)平均值标准差最小值最大值水温(ºC)15.78.26.225.1浊度(NTU)0.550.340.211.45pH6.890.406.527.45余氯(mg/L)0.120.310.0.010.31+NH4(mg/L)0.0630.0310.0420.12-Cl(mg/L)12.782.149.6516.382-SO4(mg/L)12.161.938.0714.94-NO3(mg/L)2.190.620.843.43TOC(mg/L)2.060.441.432.93AOC(μg/L)179.1144.23119.53237.65总磷(mg/L)<0.02总铁(mg/L)0.120.100.0440.43总溶解性固体(mg/L)123.0525.4691.84170.32总氮(mg/L)3.250.592.064.43总硬度（CaCO3）mg/L33.167.3224.5746.51碱度（CaCO3）mg/L23.044.1619.7326.28HPC(R2A,CFU/mL)984-*3910467***标准差远大于平均值；**测定该值时，正值学校8月中旬暑假期间，试验用水为滞留于管网中十几天的自来水。2.5.2.1稳定余氯条件下管材对耐氯菌生长的影响该实验在AR反应器中进行，模拟5种不同管材（铜（Cu），聚乙烯（PE），不锈钢（STS），铸铁（CI）和水泥砂浆涂层（CP））的供水管网对生物膜生长的影响，AR反应器如图2-3和图2-4所示。在AR反应器转速100rpm（对应2实际管径152mm水流速度0.3m/s所产生的剪切力0.372N/m）条件下，反应器以120mL/h进自来水，以3mL/h进60~80mg/L的NaClO溶液，以保持AR反应器中1.20±0.23mg/L（N=39）的余氯，水力停留时间（HRT）8h。主体水水样每周采集一次进行常规指标和细菌数目（HPC-R2A）分析。在反应器运行至12d、28d、49d、70d、91d、120d、159d、196d时采集生物膜样品进行耐氯菌数目（HPC-R2A和流式细胞仪）的分析，在第70d、120d、196d-30- 第2章实验材料与方法时采集生物膜样品进行PCR-DGGE分析。实验结果采用SPSS13.0软件对数据进行方差统计、多重比较和相关分析，用F检验判断实验组间是否存在差异统计学意义，p<0.05表示差异有统计学意义。生物膜的可培养性（C，%）计算公式为：C=(HPC-R2A/流式细胞仪测得的细菌总数)×100；灭活率（I）计算公式为：I=log10(HPC进水/HPC出水)。2.5.2.2余氯变化条件下管材对耐氯菌生长的影响采用9套供水管网动态模拟系统并联运行，实验设置铸铁、PE、不锈钢等3种管材，1mg/L、3mg/L和4.2mg/L3个余氯浓度共9种条件来模拟模拟不同管材和余氯的供水管网，供水管网动态模拟系统如图2-1和图2-2所示。在管道内闭路循环流动24h。此后保持水泵2的开启和阀门2、3、4的开启度，通过调节阀门1、5和水泵1开关状态使供水管网动态模拟系统直流排出置换水和闭路循环流动交替运行直至实验结束（生物膜取样时除外）。整个实验期间，所有模拟系统通过调节阀门2、3、4使水样以0.3m/s的流速运行，并且定期校准流速，实时调节阀门2、3、4的开启度，以保证流速稳定。待模拟系统运行3个月后（此时生物膜生长基本稳定），采集不同时刻的主体水水样，测定氯消毒剂浓度和耐氯菌总数（HPC-R2A）。同时采集生物膜，进行耐氯菌总数（HPC-R2A）测定，并对采集的不同处理的生物膜进行PCR-DGGE分析。由于在该试验添加的三种余氯浓度中，其中3、4.2mg/L这两种高浓度的余氯极大程度地抑制了主体水中耐氯菌的生长，特别是在不锈钢、PE的模拟供水系统中更是如此。因此，主体水中耐氯菌数目过少，余氯在高浓度下，各管材系统中的主体水中的耐氯菌的数量变化不明显。鉴于此，在本研究中的结果中并没有分析各管材系统中的主体水中的耐氯菌的数量变化。[123]余氯衰减拟合采用采用一级反应模型拟合。拟合公式见公式2-1：−ktC=Ce（公式2-1）t0式中，Ct—氯在反应时间为t时的浓度；C0—氯在反应时间为零时刻的浓度。2.5.2.3PE和不锈钢管材中流速对供水管网中耐氯菌生长的影响采用6套供水管网动态模拟系统并联运行，实验设置PE、不锈钢共2种管材，通过调节阀门2、3、4使水样分别以0.2m/s、0.4m/s和0.8m/s的流速共6种条件来模拟模拟不同管材和余氯的供水管网，供水管网动态模拟系统如图2-1和图2-2所示。在管道内闭路循环流动12h。此后保持水泵2的开启和阀门2、3、4的开启度，通过调节阀门1、5和水泵1开关状态使供水管网动态模拟系统直流排出置换水和闭路循环流动交替运行直至实验结束（生物膜取样时除-31- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文外）。整个实验期间通过调节高位水箱的加氯量保持低位水箱进水余氯约为1.0mg/L。并且定期校准流速，实时调节阀门2、3、4的开启度，以保证流速相对恒定。在反应器运行7、14、21、35、56、77、98d时分别从6套供水管网动态模拟系统中各取2段管段进行耐氯菌总数（HPC-R2A）测定。反应器运行至119d时，分别收集供水管网动态模拟系统中剩余6段管段内壁生物膜进行耐氯菌总数（HPC-R2A）测定和PCR-DGGE分析。实验期间定期收集主体水水样进行常规项目分析和HPC计数。水质实验结果表示为平均值±标准误差，采用SPSS13.0软件对数据进行方差统计分析，用F检验判断实验组间是否存在差异统计学意义，p<0.05表示差异有统计学意义。2.5.3供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究本实验采用96孔微量细胞培养板（96孔板）培养、定量检测的方法对从给水模拟管网系统分离到的共5株不同纲的耐氯菌，进行生物膜生长能力定量分析。（1）制备种子液本研究所用的5种耐氯菌均是本实验室自制的供水管网动态模拟系统中分[124]离并鉴定的常见耐氯菌株，菌株基本信息见表2-5。这些参试的耐氯菌在供[42,43]水管网中也比较常见，也是多数研究者报道的比较耐氯的菌属菌纲和γ变[5,11,14,15,32,36,40,46-52]形菌纲细菌，分别属于变形菌门（proteobacteria）的α变形菌纲（Gammaproteobacteria）、β变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ变形菌纲（Gammaproteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes）的芽孢杆菌纲（Bacilli），放线菌门（Actinobacteria）的放线菌纲（Actinobacteridae）。这5种菌在扫描电子显微镜下观察结果如图2-5所示。（2）生物膜生长[125,126]参考Stepanovic和Simoes等人的方法，并作适当修改。用R2A液体培养基，按1:100稀释种子液，在96孔U型平底有盖微量细胞培养板（美国8康宁公司）中加入总量为200μL经R2A液体培养基稀释的种子菌液（1×10CFU/mL）。单一菌种生物膜的生长直接加入200μL5种细菌的种子液。双菌生物膜的生长各取2×100μL的2种细菌的种子液加入到每个96孔板的培养孔中，多菌生物膜的生长各取5×40μL（全部5种菌混合）或4×50μL（除某单一菌种之外的4种菌混合）加入到每个96孔板的培养孔中。阴性（空白）对照孔只加入200μLR2A液体培养基。为加快生物膜的生长，将96孔微量细胞培养板-32- 第2章实验材料与方法加盖后在振荡培养箱中固定后，25ºC150rpm振荡培养24h、48h和72h。每24h用移液器小心吸出废弃的R2A液体培养基，轻柔加入新鲜的培养基。在每个培养期（24h、48h和72h），用移液器小心弃去培养孔内培养液，再用250μL灭菌的PBS溶液轻柔漂洗3次，以去除孔内未粘附和可逆粘附的浮游菌。将培养板自然风干30min，留待进一步实验或检测。表2-5参试菌种基本信息Table2-5Basicinformationoftestedbacteriastrains鉴定相似菌种细胞形态编号分类学地位菌落形态（相似度）形状Gram生化反应Sphingomonassp.圆形，宆状凸起，氧化酶阳短杆菌Sph（DQ840049，Alphaproteobacteria光滑，黄棕色或亮阴性性，过氧化（卵形）99%）黄色菌落氢酶阳性Acidovorax氧化酶阴defluvii凸面，光滑，米黄AcdBetaproteobacteria直杆菌阴性性，过氧化（NR026506，色或淡黄色菌落氢酶阳性99%）Acinetobactersp.圆形，凸面，光滑，氧化酶阴短杆菌Acn（FR677019，Gammaproteobacteria（略）不透明，浅阴性性，过氧化（球形）99%）黄色菌落氢酶阳性Bacilluscereus圆形，不光滑，不氧化酶阴Bac（GQ462533，Firmicutes，Bacilli规则边缘，乳白色杆菌阳性性，过氧化99%）菌落氢酶阳性Microbacterium圆形，轻微凸起，细长不规氧化酶阴laevaniformansActinobacteria，Mic粗糙，不透明黄色则杆菌（V阳性性，过氧化（JQ229810，Actinobacteridae菌落形）氢酶阳性99%）（3）结晶紫（CV）染色法定量检测生物膜的生物量[125]参考Stepanovic等人的方法，并作适当修改。在每孔内加入250μL98%（v/v）的甲醇固定15min，小心吸出废弃甲醇，自然风干后，再在每孔内加入250μL1%结晶紫染色液染色5min，用移液器吸取无菌蒸馏水缓和清洗培养孔内壁，以去除干净多余的染料，自然风干。每孔加入250μL33%（v/v）的冰醋-33- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文酸释放和溶解结晶紫。用酶标仪在570nm光波下测定各孔的OD570值，每种菌（混合菌）3个平行（孔）样。Sphingomonassp.（短杆菌（卵形））Acidovoraxdefluvii（直杆菌）Acinetobactersp.（短杆菌（球形））Bacilluscereus（杆菌）Microbacteriumlaevaniformans（细长不规则杆菌（V形））图2-5参试菌株扫描电镜照片（40000×或者20000×）Table2-5SEMimagesoftestedbacteriastrains(40000×or20000×)-34- 第2章实验材料与方法（4）甲基四氮盐（XTT）减低法测定生物膜的活性[94]参考Simoes等人的方法，并作适当修改。在每孔内加入200μL的XTT-甲萘醌溶液，使XTT终浓度达到50μg/mL，25ºC、150rpm避光孵育3h，吸取100μL上清液到新的微孔板中，然后在酶标仪下测定490nm波长处各孔的OD490值，每组菌（混合）3个平行（孔）样。由于OD490值普遍偏小，因此用生物膜比生长活性来表示：OD490/570。（5）平板计数法（HPC-R2A）测定生物膜的细菌总数在每孔内加入200μL无菌蒸馏水，用灭菌的牙签将附着在孔壁上的生物膜重悬浮，将待计数的生物膜悬浮液置于超声波振荡器中冰浴超声振荡1min，间歇1min，如此重复3次，然后再漩涡振荡30s，使生物膜中的细菌能够均匀分布在悬浮液中，之后将悬浮液稀释适宜浓度在R2A固体培养基上进行细菌总数计数（HPC-R2A），每种耐氯菌（混合）3个平行（孔）样。由于平板计数法的工作量巨大，本研究主要针对72h的生物膜进行计数。（6）生物膜形成能力和细菌种群间相互关系判定生物膜形成能力主要基于生物膜生物量的OD570值来判定，其标准参考[125]Stepanovic等人的方法如下，将大于阴性对照平均OD570值的3倍标准差（3SD）定义为临界值（cut-off值，ODc）。基于临界值ODc，菌组生物膜形成能力可以分为以下4种：OD570≤ODc为不具生物膜形成能力（0），ODc4ODc为强的生物膜形成能力（+++）。对于多菌种混合生物膜还可以考察某种菌的存在对另外种群生物膜的抑制或促进能力可以根据生物膜的生物量（OD570）或比生长活性（OD490/570）来判[127]定，其标准参考Simoes等人的方法，并作适当修改。将5种菌都存在的生物膜生物量（OD570）或比生长活性（OD490/570）定义为Bc值，将除某种菌之外的4种菌形成的生物膜生物量（OD570）或比生长活性（OD490/570）为B值。基于Bc值，某种菌对另外4种菌组生物膜形成的促进或抑制能力可以分为以下4种：B≥2Bc为强抑制（－－），2Bc>B>Bc为弱抑制（－），Bc>B>Bc/2为弱促进（+），Bc/2≥B为强促进（++）。2.5.4供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究本实验运用96孔微培养板作为筛选余氯去除和杀灭不同生物膜消毒效率[94]差异的快速和简单方法，比较分析不同耐氯菌单一菌种、混菌的生物膜耐氯性及其机制。-35- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文（1）氯消毒工作液准备[128,129]所有氯消毒实验均在pH7.0的PBS缓冲液（不耗氯溶液）中完成。用PBS缓冲液将NaClO试剂稀释成0.3mg/L、0.6mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L和10mg/L的余氯工作液，并用DPD试剂对工作液进行标定。工作液当天配制，并遮光保存在4ºC冰箱中，从配制到使用不超过2h。（2）氯消毒实验将2.5.3培养72h的生物膜冲洗完后，立即加入250μL不同浓度的余氯溶液中，每种菌（混合菌）至少需要96孔板的3×6=18个孔。另外，每种菌（混合菌）还需设置阴性对照孔，只加入250μLPBS缓冲液；阳性对照孔为不加氯处理的相应菌组72h的生物膜。为保证足量的余氯溶液与生物膜充分接触，所有消毒实验均在25ºC、150rpm振荡培养箱中完成。在1h消毒处理中，每[5]加入氯溶液20min后轻柔更换一次新鲜的对应氯溶液。经过1h的消毒后，轻柔加入250μL的0.5%（w/v）NaS2O3溶液漂洗2次，以中止余氯反应，之后加入250μL的灭菌的PBS溶液轻柔漂洗1次，以去除孔内未粘附和可逆粘附的浮游菌。将培养板自然风干30min，留待进一步检测。（3）氯消毒效果检测将消毒处理并漂洗完后的生物膜，参考2.5.3的方法进行生物膜的生物量、活性和细菌总数的测定。按照公式计算不同余氯浓度下的每种菌（混合菌）的生物膜生物量去除率及活性降低率（公式2-2）和生物膜细菌灭活率（log10(N0/N)）（公式2-3）。生物量去除率或活性降低率=1-加氯实验组OD值−阴性对照组OD值×100%（公式2-2）阳性对照组OD值−阴性对照组OD值阳性对照组细菌总数生物膜灭活率=log（公式2-3）10加氯实验组细菌总数当实验加氯组的吸光度小于空白组的吸光度时，就认为该实验组的去除率或降低率为100%，当实验加氯组的细菌总数低于R2A平板计数的检测限时（5CFU/mL），就以该菌组未加氯的阳性对照组的细菌总数的对数值（log10(N0)）作为该实验组的灭活率。（4）芽孢计数对于Bacilluscereus单一菌种生物膜的实验进行芽孢计数，具体方法如下，将充分混匀的生物膜悬浮液在80ºC孵育10min，以杀死Bacilluscereus的营养-36- 第2章实验材料与方法[130]细胞，将经80ºC处理的生物膜悬浮液进行HPC-R2A平板计数，即可得到该实验组的芽孢数目。对80ºC处理前后的Bacilluscereus的分别进行计数，即可计算得到该实验组的芽孢比例。-37- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征3.1引言[131]氯消毒会使耐氯菌成为优势菌，对耐氯菌也是一种正向选择。由于供水管网埋藏在地下，很少有人从水厂源头到龙头研究耐氯菌的存在。然而研究供水管网中的耐氯菌的生长对饮用水的微生物安全的评估、预防和控制至关重要，对制定有效的措施来充分保障“源头到龙头”的水质具有很强的现实意义。本章对东北某市以地表水为水源的净水厂的清水池和供水管网的主体水和生物膜的耐氯菌的数量展开了调研，并运用IlluminaMiSeq高通量测序技术对水厂加氯前后和实际供水管网中不同采样点的生物膜中的耐氯菌种群变化规律进行了研究，以期为保障供水的微生物安全的评估、预防和控制提供理论基础。3.2供水管网主体水和生物膜中耐氯菌的数量变化3.2.1主体水中耐氯菌的数量变化图3-1供水管网主体水中耐氯菌总数，如图3-1所示，在H1（清水池）水样中，耐氯菌总数为264CFU/mL，H2（水厂自用）的水样中耐氯菌总数为131CFU/mL，这说明在清水池中长期生活在较高浓度余氯下的细菌耐氯性能够逐渐累积，大多比较耐氯，因此耐氯菌总数相对较多。在出厂水0.6mg/L余氯水平下，自来水经管网输送，耐氯菌总数随着管线的延长逐渐增加，但差异不显著（p>0.05），耐氯菌总数均小于350CFU/mL。这与清华大学的陆品品研究[120]南方某市氯胺供水管网中的耐氯菌总数（2~420CFU/mL）基本相似，并且也认为水力停留时间的增加，余氯浓度的下降，耐氯菌的总数也在增加。《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》规定微生物指标中菌落指数小于100CFU/mL，与本文研究的使用方法都是培养基菌落计数法。但《生活饮用水标准检验方法微生物指标GB5750.12-200》使用的培养基是营养琼脂（PCA）培养基，其主要成分为蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，培养温度37ºC，培养时间2d；而本研究中使用的培养基是R2A培养基，其主要成分（见2.4.3.1）与PCA培养基差异较大，培养温度20ºC，培养时间10d。不同的培养基、培养时间、培养温度和培养方法都会对水样异养菌平板计数（HPC）的培养结果产生影响，由于现行饮用水中菌落总数检验-38- 第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征[113]方法的局限性，并不能检出水中大多数的细菌，某些由于消毒不彻底而导致的损伤型细菌，在规定的培养温度和培养时间，在营养琼脂培养基上并不能形[112]成可见的菌落，从而导致菌落总数的检出率偏低。本文研究的是耐氯菌，耐氯菌的部分细菌是受损细菌恢复性生长的细菌，而这部分细菌在营养琼脂培养[112]基上并不能形成可见的菌落，故本研究并没有采用PCA培养基检测耐氯菌，而是采用了R2A培养基检测耐氯菌。因此R2A培养基的检测的耐氯菌总数结果与《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》（PCA培养基测定）规定的菌落总数限值（100CFU/mL）并没有可比性。400320240(CFU/mL)数160菌总耐氯800H1H2H3H4H5取样点图3-1供水管网主体水中耐氯菌总数（HPC）Fig.3-1Chlorine-resistantbacteriacounts(HPC)inthebulkwaterofdrinkingwaterdistributionsystem3.2.2生物膜中耐氯菌的数量变化图3-2供水管网生物膜中耐氯菌总数，如图3-2所示，供水管网生物膜中2耐氯菌总数在1628~7413CFU/cm。同主体水中耐氯菌总数的规律相似，H1（清水池）的样品的生物膜中耐氯菌总数也相对较多，经管网延伸，随着消毒剂的浓度的下降，管网生物膜的耐氯菌总数呈增长趋势。对比同一采样点的管网主体水和生物膜发现，生物膜中耐氯菌总数至少高于主体水中耐氯菌总数1个数量级。因此，在生物膜中更容易发现耐氯菌，是导致水质恶化的主要原因[2,14]。由于生物膜中存在诸如胞外聚合物（EPS）等复杂的组分和更多的群体-39- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文细菌数目，从而减少了消毒剂在生物膜基质中扩散限制和反应抑制作用，使得[56]生物膜中细菌具更强的耐氯性。本研究在检测生物膜中的耐氯菌时，首先通过超声波和漩涡振荡法分散细胞群体生物膜，使生物膜中的个体细胞释放出来，尽量减少消毒剂在生物膜基质中扩散限制和反应抑制作用，也尽量使“真正”的耐氯细菌能得以检出。8000)640024800(CFU/cm数3200菌总耐氯16000H1H2H3H4H5取样点图3-2供水管网生物膜中耐氯菌总数（HPC）Fig.3-2Chlorine-resistantbacteriacounts(HPC)inthebiofilmofdrinkingwaterdistributionsystem3.2.3供水管网中生物膜微生物相观察对供水管网中（H1~H5）5个采样点的样品生物膜的扫描电镜观察结果见图3-3。由图可知，在清水池池壁上未观察到微生物，出厂水在管网输送过程中，生物膜中的微生物细胞数目随着输送距离的增加有增多的趋势，在管网的中末端，镀锌铁和水泥瓷砖材料上的生物膜中微生物数量较多，能见细菌团聚的形式存在，并形成了明显的腐蚀瘤，电镜照片显示腐蚀瘤内部是丰富的微生物，能见杆菌和球菌，以杆菌居多。玻璃钢材料上的生物膜中微生物数量也较多，而PPR管材上的生物膜中微生物数量相对较少，这可能是因为只经过了很短的管网输送（300m）。上述观察结果与细菌总数趋势完全一致。而在微生物种类上，这几种材料上生物膜中的微生物均能见杆菌和球菌，以杆菌居多。张向谊等和王薇等发现供水管网管壁生物膜中的微生物以球菌和杆菌为主，与本-40- 第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征[77,132]文研究结果基本一致。从电镜照片上来看供水管网中附着的生物膜的微生物形态相对比较接近，能见杆菌和球菌，以杆菌居多，差异不明显。H1H2H3H4H5图3-3供水管网生物膜扫描电镜观察结果（10000×）Fig.3-3SEMimagesofbiofilmindrinkingwaterdistributionsystem(10000×)-41- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文3.3供水管网生物膜微生物群落结构分析3.3.1微生物多样性指数分析将清水池、供水管网以及二次供水管中（H1~H6）6个采样点的生物膜样品提取细菌总DNA，再进行基于16SrRNA基因序列的IlluminaMiSeq高通量测序分析。以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元（OTU），基于随机选取一定数量的测序序列及其对应的OTU种类得到的稀释性曲线，见图3-4。由图可知，各个样品稀释性曲线基本平稳，说明测序数据量比较合理，测序结[133]果能够真实地反映样品中种群的结构关系。通过样品测序序列计算各样品中细菌多样性指数（表3-1），H1~H6样品测出了71~829个OTU。香农指数是衡量样品中物种多样性的重要指标，香农指数越高说明样品多样性越丰富，辛普森指数则与之相反，数值越高多样性越单一。艾斯指数用来估计群落中OTU[45]数目的指数，由Chao提出，在生态学中是估计物种总数的常用指数之一。H6800600相似性)H5400(97%H2OTUs200H4H3H10050001000015000200002500030000序列数图3-4各生物膜样品的稀释性曲线Fig.3-4Rarefactioncurveofbiofilms由表3-1可知，自来水经管网输送后，随着输送距离的延长，生物膜细菌多样性越来越丰富，这可能与管道材质、管龄、水龄有密切的关系。H2采样点由于处于水厂自用水的管网末端，该处的生物膜细菌多样性也较为丰富。H6是H5的二次供水，也属于树状管网，H6生物膜细菌多样性比H5生物膜细菌多样性有较大程度的增加。由此可知，供水管网生物膜细菌多样性与水厂距离-42- 第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征有关，但这并不是绝对的，还可能跟是否处于供水树状管网末端相关，树状管网供水能够显著增加了生物膜细菌多样性。表3-1基于16SrRNA基因序列的多样性指数统计Table3-1Bacterialdiversityindexbasedon16SrRNAgenesequences样品名称有效序列数OTU香农指数辛普森指数艾斯指数H112950721.540.37396.36H2110352423.760.059308.26H311560711.600.336125.09H477871372.740.138169.30H5138974804.330.046532.22H6270248295.120.025838.663.3.2菌门和菌纲分类水平上微生物群落结构差异对全部6个样品的有效序列进行归类操作分析，统计不同分类单元（OTU）所对应的细菌门类及相对丰度，结果见图3-5。由此可知，不同输送距离、管道材质、管龄的供水管网中生物膜样品的群落组成在门水平上存在明显差异，优势种群（门水平）存在巨大差异。在清水池池壁上占比大于1%的细菌门类仅2种（变形菌门和厚壁菌菌门），这两个门占到了清水池壁生物膜的99.48%。厚壁菌门细菌均为革兰氏阳性菌，它的细胞壁结构含有大量的肽聚糖，这与耐[134]氯性有关。经管网输送后，供水管网生物膜中变形菌门占总菌比例呈上升趋势，厚壁菌门呈急剧下降，在供水管网末端（H5和H6）还出现了2%~6%左右的硝化细菌（Nitrospirae硝化螺旋菌门），这与该取样点主体水的氨氮含量降低有关（表2-3）。在供水管网中占比第一的优势菌门类均为变形菌门，占总细菌量36.73%~99.68%不等，特别是在管网中段（H3）变形菌门细菌占99.68%，之后随着管网的延伸，变形菌门的比例下降，在供水末端二次供水（H6）只占36.73%。另外，在供水管网的中末端（H4和H5）和树状管网（H2和H6）中也出现较多数量的酸杆菌门细菌（Acidobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）细菌，分别占总细菌量1.16%~36.43%和0.72%~5.08%等。在供水管网的末端（H5和H6）细菌呈现多样化，原先占巨大优势的变形菌门被削弱，占比大于1%细菌门类达9种和12种。上述研究结果与其他研究者的结果基本一致。Luo等人在该寒区湖库型水源的原水的输送管道中也发现，生物膜上最大的种群依次为-43- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文变形菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、厚壁菌门和放线菌门（Actinobacteria）[135]。Martiny.A.C发现变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门、浮霉[114]菌门是主要的几个门类。)(%相对丰度H1H2H3H4H5H6图3-5生物膜样品门水平上的物种分布情况Fig.3-5Relativeabundanceofthemajorphyluminthebiofilms在本研究中，变形菌门是细菌中占比最大的一门（除H1清水池样品外，该样品可能受到污染，在后续将会讨论）。Huang等人在研究中国南京北河口水厂和供水管网发现变形菌门一直是优势菌，而且从滤池出水、清水池出水、管网出水占比依次递增，消毒后的细菌多样性下降，但在管网输送过程中多样[51]性会增加，这与本文的研究结果是一致的。变形菌门各纲水平微生物种群分布如图3-6。由图可见，α变形菌纲（Alphaproteobacteria）和γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）为变形菌门中占比最大的两个纲类，特别是γ变形菌纲在供水管网中段（H3）占比更是达到了94.07%（总细菌）；其次为β变形菌（Betaproteobacteria），δ变形菌（Deltaproteobacteria）只是少量地存在于供水末端（H5和H6）生物膜中。据Douterelo，McCoy和Poitelon等人报道，β变形菌对较高的消毒剂残留敏感，而α变形菌纲和γ变形菌纲种群可能在较高的[46-48]氯浓度存在时大量存在。生物膜内存在一定数量的β变形菌群体可能是由[136]于生物膜的保护作用。Vaz-Moreira等人在葡萄牙的某加氯供水管网中发现，只有变形菌门是优势门类，并且发现α变形菌纲和β变形菌纲种群是其优势纲-44- 第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征[36]。Lu等人研究了中国华南某市的加氯的不同供水管网的龙头水的微生物多样性发现，变形菌门细菌在管网所有样品中均占优势，其中α变形菌纲细菌在较[33]高余氯浓度（0.48~0.76mg/L）下仍能占据绝对优势。由上可知，多数研究者认为在加氯的供水管网中α变形菌纲和γ变形菌纲为优势菌群，这与本研究的结果是一致的。100AlphaproteobacteriaBetaproteobacteria80GammaproteobacteriaDeltaproteobacteria(%)60度40相对丰200H1H2H3H4H5H6图3-6生物膜样品中变形菌门各纲的物种分布情况Fig.3-6Relativeabundanceoftheclasssubordinatedtoproteobacteriainthebiofilms3.3.3占优势的耐氯菌属分析各采样点中的生物膜菌群种类组成在属水平上物种分布如图3-7。由图可知，在清水池和供水管网中段（H1、H3、H4）占比较多的优势菌均为假单胞菌属（Pseudomonas），占总细菌量16.85%~77.83%不等。假单胞菌属细菌是水生环境也包括饮用水中常见的细菌种属，是地球上最多样化和显著生态群落的[108]细菌之一，部分原因是因为其漫长的进化历史。在清水池池壁上占比较多的优势菌为肠球菌属（Enterococcus）、假单胞菌属和芽孢杆菌属（Bacillus），样品中存在大量的肠球菌，这可能是在清洗清水池时取清水池池壁的样品受到了外来污染。在清水池及供水管网前中段（H1、H2、H3、H4）生物膜样品中占比相对较多的优势菌是假单胞菌属、芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、鞘脂单胞菌（Sphingomonas）、食-45- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文)(%相对丰度H1H2H3H4H5H6图3-7生物膜样品属水平上的物种分布情况Fig.3-7Relativeabundanceofthemajorgenusinthebiofilms酸菌属（Acidovorax），说明这些菌对消毒剂有一定的耐受性，这些菌也是多数[32,36,40,49-51]研究者报道的常见的较为耐氯的菌属。在水厂自用水管网（H2）生物膜中红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）细菌占比最大（15%）。Gomez-Alvarez和Williams等人在美国辛辛那提的供水管网中也发现红假单胞菌属大量存在于[137,138]加氯的自来水中。在供水管网末端（H5和H6）细菌种类较多，还有很多未鉴定的细菌（Bacteriaunclassified、Subgroup2/6norank等），还发现一定比例的硝化细菌（Nitrosomonadaceae和Nitrospira）。硝化细菌（Nitrosomonadaceae和Nitrospira）一般在氯胺的供水管网中比较常见，这些[72,139]细菌都跟氨氮、亚硝氮的氧化有关。但也有研究者在加氯的或无氯供水管网发现，Liu等人就在中国华北的某城市加氯供水管网的末端也发现了硝化[140]细菌；Martiny等人在丹麦不加氯的供水管网中就分离出了大量的硝化细菌[114]（Nitrospira）；Poitelon等人在法国靠近塞纳河畔伊夫里（Ivry-sur-Seine）[48]的两座加氯水厂的供水管网也发现了硝化细菌（Nitrospira）。本文和大多数研究者类似，在余氯浓度较低的供水管网末端发现了硝化细菌，因此硝化细菌的耐氯性应该不如上述在供水管网前端常见的菌属。在供水管网末端，由于余-46- 第3章实际供水管网中耐氯菌的分布特征[131]氯浓度降低，缺少对耐氯菌的正向选择作用，非耐氯性菌占据优势地位，细菌种群多样性也更为丰富。因此，在供水管网末端可以考虑二次加氯，并定期进行消毒剂+冲洗联合清洗方式去除大部分生物膜，降低生物膜的细菌数量和种群多样性。3.4本章小结本章通过对东北某市净水厂加氯后和供水管网中不同采样点的主体水和生物膜中的耐氯菌的数量进行检测，并运用IlluminaMiSeq高通量测序技术对不同采样点的生物膜中的耐氯菌种群变化规律进行了研究，得出如下结论：（1）耐氯菌在该供水管网中普遍存在。生物膜中耐氯菌数目至少高于主体水的耐氯菌数目1个数量级。水厂和供水管网中生物膜的微生物形态能见杆菌和球菌，以杆菌居多。（2）在水厂清水池池壁的生物膜细菌多样性较低，但在供水管网生物膜中多样性会逐渐增加，在树状管网末端细菌多样性也会显著增加。（3）在供水管网中变形菌门的α变形菌纲和γ变形菌纲为优势菌纲。在供水管网中前端耐氯菌为优势菌属，包括Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Sphingobium、Sphingomonas、Acidovorax和Rhodopseudomonas等。在供水管网末端非耐氯性菌占据优势地位，细菌种群多样性也更为丰富，还发现一定比例的硝化细菌（Nitrosomonadaceae和Nitrospira）。-47- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响4.1引言由前一章研究可知，供水管网中耐氯菌是处于一个贫营养条件下维持较高浓度余氯的极端环境体系中占优势的菌群。以前大多数的研究都集中在较低余[40,43,79,氯浓度下（<1.0mg/L余氯）的供水管网中的微生物数量和多样性的研究141-143][32]。但是，市政供水通常用0.5mg/L~3.0mg/L的氯来控制细菌的生长。[32,37,79,144]在自来水厂附近，余氯可能会超过1.0mg/L。因此，非常有必要研究余氯大于1.0mg/L的浓度下耐氯菌的生长情况（数量和微生物多样性）。有许多因素诸如水力条件、管材、消毒剂类型及浓度、水体中营养物质浓[46]度等，都会影响供水管网中细菌的生长。研究表明，水中的营养物质浓度与[43,78,79]细菌的再生长呈正相关，消毒剂浓度与细菌的再生长呈负相关。在供水[80]管网中，管材对微生物的再生长和生物膜的形成具有复杂的影响，管材和水[78]力条件会随着供水管网的延伸发生明显的变化。无论管道材质如何，管道内[14]壁都会生长生物膜。同时，水力条件的变换对生物膜的累积和脱落具有重要作用，以往研究多集中在水力条件、水质因素（消毒剂和营养物）对细菌和生[43,46,78,79,81]物膜的生长的影响上，而对水力条件与管材因素对细菌和生物膜的生长的影响研究较少，仍处于起步阶段，有关管材和水力条件模拟试验研究的报道还不多见。本章通过动态供水管网模拟系统，在大于1mg/L余氯条件下研究了管材及流速对耐氯菌在主体水中（数量）和生物膜中（数量和种群）生长的影响，以期为供水管网耐氯菌的控制奠定理论基础。4.2稳定余氯条件下管材对供水管网中耐氯菌生长的影响采用国际上使用最为广泛的研究供水管网生物膜的生物膜挂片旋转（AR）[145]反应器，研究了5种管材（铜（Cu），聚乙烯（PE），304不锈钢（不锈钢/STS），铸铁（CI）和水泥砂浆涂层的聚碳酸酯（水泥砂浆/CP））在持续保持较高余氯（1.2mg/L）条件下耐氯菌的数量和种群变化的影响。4.2.1主体水中耐氯菌的变化[121]即使在较高浓度的消毒剂下，供水管网仍然会出现细菌再生长。AR反-48- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响应器的进水异养菌总数（HPCinlet）和出水耐氯菌总数（HPCoutlet）如图4-1所示。在最初的100天中，AR反应器出水耐氯菌总数呈轻微的但不显著的增加（从0.9到169CFU/mL，p>0.05）。在初始阶段，余氯明显抑制了主体水中细菌生长，使AR反应器进水（HPCinlet）的HPC下降了2-4log单位，剩下的这些菌均能耐受1.2mg/L的余氯。然而，从第100天到第166天，AR反应器出水中的耐氯菌总数快速增加（p<0.01），出水耐氯菌总数由从362CFU/mL增至1387CFU/mL。在实验中后期，余氯的抑制效率变弱（<1.0-logHPC）。166天后，出水耐氯菌总数没有变化，维持在1300CFU/mL左右。许多研究人员已经证实，供水管网中主体水中的细菌总数随时间的增加，这是由于生物膜细菌[146,147]的生长和脱落的结果，而不是因为细菌的再生长。众所周知，在供水管[148]网中，水中的细菌生长是几乎可以忽略的。本研究中AR反应器的水力停留[148]时间（HRT）约为8小时，远远低于1~17天的细菌世代时间。附着在管壁[148]的细菌不断地繁殖和脱落就会引起主体水中细菌数目的增加。基于上述分析，166天后主体水耐氯菌的数量达到稳定状态，可以合理地推断大多数管材生物膜的耐氯菌密度应该处于稳定状态。1400009000进水出水12000075001000006000(CFU/mL)(CFU/mL)80000数4500数600003000400001500进水异养菌总20000出水耐氯菌总00020406080100120140160180200培养时间(d)图4-1主体水中悬浮细菌和耐氯菌的数量变化（HPC）Fig.4-1Variationofsuspendedbacterialconcentrationandchlorine-resistantbacteriacounts(HPC)-49- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文4.2.2不同管材生物膜中的耐氯菌数量基于流式细胞仪（FCM）技术，对每个取样片上的生物膜样品中耐氯菌的总细胞数（TCC）进行测定（图4-2）。各管材挂片上生长的生物膜中的TCC在8个取样时间（12，28，49，70，91，120，159和196天）存在显著变化（p<0.01）（图4-2）。前12天，除了水泥砂浆涂层的聚碳酸酯（CP）生物膜外，铸4铁（CI）挂片上生长的生物膜中呈现了最高的耐氯菌细胞总数（5.1×10~1.7×7210cells/cm），高于同时期的其他管材生物膜中TCC的3~431倍以上（p<0.01）46（图4-2）。第28天后，CP生物膜中表现出第二高的TCC（7.0×10~3.6×102cells/cm），但只在后期（159天后），TCC才显著（p<0.05）高于其它三种管材（铜，不锈钢，聚乙烯）。在早期试验阶段（前12天）（图4-2），对五种实验管材管道生长的生物膜中的TCC进行了排序：水泥砂浆涂层的聚碳酸酯（CP）>铸铁（CI）>聚乙烯（PE）>不锈钢（STS）>铜（Cu）。但在试验结束阶段（197天），五种管材上生长的生物膜中的TCC顺序为：CI>CP>Cu>PE>STS。8)276(Cells/cm105Log4数3细胞总21CuPE耐氯菌不锈钢水泥砂浆铸铁0020406080100120140160180200培养时间(d)图4-2不同时期的生物膜中的耐氯菌总细胞数（TCC）Fig.4-2Chlorine-resistantbacterialtotalcellcounts(TCC)ofbiofilmsontheinnersurfacesofthereactorcouponsoverdifferentdates虽然在前120天，Cu管材表面的生物膜中表现了最低的耐氯菌数目，但随着Cu管材的腐蚀，生物膜形成能力增加，在实验结束时Cu管材附着的耐氯菌[141]数目排第3位。Jang等在铜管材中也观察到了同样的现象。除铜管之外，-50- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响附着在其它4种管材上的耐氯菌总数在不同的阶段都达到了稳定状态。PE管材生物膜中在第91天时耐氯菌总数达到稳定状态，CI管材生物膜中耐氯菌总数在第120天达到稳定状态。STS和CP管材生物膜中耐氯菌总数在第159天达到稳定状态，但铜管生物膜中耐氯菌总数在第196天时还呈继续增加趋势（图4-2）。这些结果与一些研究者的报道很相似。例如，Lehtola等人（2004）指出，PE管材在前37天达到稳定状态，但在铜管材生物膜中耐氯菌的数量在200天[149]时还继续增加。Holden等（1995）发现，铸铁上的生物膜在100和130天[150]达到稳定状态。这表明，管材可以明显着地影响生物膜中耐氯菌达稳定状态的时间。在管材表面上附着的耐氯菌总数（HPC）（图4-3），与观察到的耐氯菌总细胞数的趋势类似。整个实验阶段，附着到管材表面的耐氯菌总数表现出显著的（p<0.01）变化。CI管材生物膜中的耐氯菌总数也出现了最高值，是其它管材的（图4-3）25~504倍。前120天，PE管材生物膜中的HPC高于其他三个管材（Cu，STS，CP），但经过159天，CP取代了PE，生物膜上的HPC高于其他三个管材（Cu，STS，PE）。6)254(CFU/cm10Log3数总2耐氯菌1CuPE不锈钢水泥砂浆铸铁0020406080100120140160180200培养时间(d)图4-3不同时期的生物膜中的耐氯菌总数（HPC）Fig.4-3Chlorine-resistantbacteriacounts(HPC)ofbiofilmsontheinnersurfacesofthereactorcouponsoverdifferentdates®生物膜样品中的耐氯菌数目可以通过荧光染料（SYBRGreenI）加上流式细胞仪（FCM）计数观察。这适用于所有耐氯菌，包括可培养细菌，自养细菌-51- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文[115]和有生活力但不可培养（VBNC）细胞。一般总细胞的数量要比可培养细胞[115]的数目高1~2-logs。在本研究中，不同的管材生物膜中的耐氯菌可培养性差异显著（p<0.001），同种管材在不同的采样时间内差异不显著（p>0.05）（图4-4）。PE管材上的生物膜中表现了最高的可培养性（1.52~2.37%），CI管材生物膜中表现了第二高的可培养性（1.33~2.12%）；Cu管材生物膜中表现出适中的可培养性，范围在1.04~1.27%之间；而CP和STS生物膜中呈现很低的可培养性的低值，范围分别在0.58~0.77%和0.65~0.92%之间。除了PE管材，附着在管材上的耐氯菌可培养性随时间保持较稳定的小幅波动。Vaz-Moreira等人认[36]为加氯消毒可以减少细菌的多样性和降低可培养性，但它并不适用所有的管道材料。不同材料的生物膜可培养性差异很有可能是由于各种管材上附着的可培养耐氯细菌种类的不同造成的。2.52.0(%)1.51.0可培养性0.5CuPE不锈钢水泥砂浆铸铁0.0020406080100120140160180200培养时间(d)图4-4不同时期管材生物膜中耐氯菌可培养性Fig.4-4Chlorine-resistantbacterialculturabilityofbiofilmsontheinnersurfacesofthereactorcouponsoverdifferentdates由此可知，管道材料明显影响着生物膜中的耐氯菌密度和可培养性。在早期阶段，Cu管生物膜上附着了最少的耐氯菌，这是因为Cu管能释放铜离子，[79]这些铜离子能够抑制细菌生长。随后，在铜管表面上生长的耐氯菌被胞外聚合物（EPS）覆盖，EPS能够显著地增加生物膜耐受抗生素和消毒剂如铜和氯[122]的能力。与此同时，附着到铜管的表面上的耐氯菌加速了铜的腐蚀，使生物膜中的耐氯菌水平高于不锈钢（STS）管材。这大概是因为铜和消毒剂反应消-52- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响[149]耗大量的氯，耐氯菌种群已适应或已经选择生存在铜表面上。不锈钢管在159天后耐氯菌总数最低。Jang也报道不锈钢管在实验结束时[141]表现出最低的细菌数。不锈钢是一种中度疏水的材料，在本实验中的pH6.75条件下略微表现负的表面电荷。由于细菌的表面也带负电，所以不锈钢表面上的负的静电力会阻碍细菌的粘附。另外，不锈钢是一种耐腐蚀的金属材料，当[151]暴露在空气和水界面时能够瞬间形成一个薄的、耐腐蚀的铬氧化物膜。因此，耐氯菌不容易附着在不锈钢表面上。五个新的常用管道材料，PE管表面上生长的生物膜中的耐氯菌具有最高的可培养性，并且随时间增长略有增加。另外，在前70天中，PE管生物膜中的耐氯菌数量高于不锈钢管和Cu管的1~2logs。[149]据报道，PE管材会释放大量的可溶性有机碳（DOC）和磷到水里。磷能够增加生物膜中细菌数和提高生物膜上细菌的可培养性，但降低了胞外多糖（EPS）的产生。因此，在早期阶段，反应器中的PE管可以促进耐氯菌的生长，但是随着消毒剂的停留，较少的EPS将影响生物膜中耐氯菌的再生长。整个实验过程中，铸铁上生长的生物膜中呈现最高的耐氯菌数量和第二高[79]的可培养性。消毒剂可能大大影响铸铁腐蚀，Appenzeller等人认为饮用水中[152]的铁可促进细菌的生长和可培养性。铁锈不仅使耐氯菌附着的铁管表面的孔[153]隙度和粗糙度增加，而且也可以作为一种耐氯菌的营养物质。另外，铁管更[14]易与消毒剂反应从而降低其消毒作用。因此，与其它管材相比，附着在铸铁上的耐氯菌会受到更多的保护而不会被氯杀灭。在相同培养条件下，附着于水泥砂浆上的耐氯菌总数与附着在PE上的耐氯菌总数是成一定比例的（水泥/PE=5.79）。此外，在最初的实验阶段（12d），水泥砂浆表面的耐氯菌总数最高。[154]研究表明，水泥砂浆的孔隙度要大大高于铸铁、Cu、不锈钢和PE等材料。在生物膜形成初期，水泥砂浆可提供更多的内部表面积供耐氯菌生长，并可为[154]耐氯菌等微生物提供了更多的保护。但与铸铁管相比，高剂量的氯能加速化[7]学腐蚀铸铁管。铁锈的增加不仅有利于耐氯菌附着的管表面的孔隙度和粗糙度，也可以作为一种营养，而且铁锈能中和余氯，在余氯接触生物膜并其反应[14,153]前去除。因此，在实验前期，水泥砂浆管上相对较高的耐氯菌数量可能是因为水泥砂浆表面的孔隙度和粗糙度，而不是来自水泥砂浆上的化学物质与氯的反应。因此，在供水管网中，管材的特性是影响耐氯菌再生长的重要因素。4.2.3不同管材生物膜中的耐氯菌种群结构分析由于在70d和120d生长的Cu和不锈钢管材上较薄的生物膜，DNA提取产量较低（小于5ng/μL，A260/A280比值<1.30）不能够有效地进行16SrRNA-53- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文基因PCR扩增。因此，只有通过PCR-DGGE分析第196天的生物膜样品来研究AR反应器中不同管材生物膜中的耐氯菌群落的多样性（图4-5）。为更进一步研究不同管材生物膜中的耐氯菌种群结构，从41个条带中挑取了22个明显的有代表性的条带进行测序，测序序列经过NCBI比对，做成进化树图（图4-6）。在1.20mg/L高浓度的余氯条件下，所有管材样品中，变形菌门（Proteobacteria）占大多数，其中，α变形菌纲和γ变形菌纲是优势菌群，而β变形菌纲则较少，仅在铸铁和水泥砂浆材料上存在（图4-5和图4-6）。据Douterelo，McCoy和Poitelon等人报道，Betaproteobacteria对较高的消毒剂敏感，而α变形菌纲和γ[46-48]变形菌纲的种群可能在较高的氯浓度下大量存在。铸铁和水泥砂浆生物膜上存在β变形菌纲细菌可能是由于它们表面的孔隙度和粗糙度造成的。α变形[155]菌纲是贫营养种群，可在余氯存在的贫营养条件下生存。γ变形菌纲，被描述为饮用水生物膜的生长过程中“先锋”，它位于生物膜的内层，因此不易受氯[156]消毒剂扩散的影响。从左至右泳道分别为：Cu、PE、不锈钢、铸铁、水泥砂浆涂层聚碳酸酯图4-5不同管材生物膜样品的PCR-DGGE凝胶图谱Fig.4-5DGGEgelimageformaterialbiofilmsamples本研究中，在相同的高浓度余氯及培养条件下，同时期内不同管材生长的生物膜中耐氯菌种群多样性有很大差异（图4-5和图4-6）。在所有管材内，都-54- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响图4-6基于图4-5标记的典型DGGE条带序列构建的进化树Fig.4-6Dendrogramconstructedonbasisofpartial16SrDNAsequencesoftherespectiveDGGEbandsmarkedinFig.4-5发现大量的Pseudomonadaceae（主要是Moraxellaosloensis和pseudomonassp.）和Sphingomonadales（仅Sphingomonassp.）。同时，在Cu、PE、不锈钢和铸铁管材上，也发现了大量的Bacillale（仅Bacillussp.）和Rhizobiales（Brucellaceae和Methylobacteriaceae），而Burkholderiales（四种不同的科）仅在铸铁和水泥砂浆管材上发现。Moraxellaosloensis是一种好氧的耐氯菌，在水厂的清水池壁-55- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文[32,53]上和牙科诊室的氯消毒台上发现过。在加氯饮用水中，Sphingomonassp.很可能是引起生物膜生长的原因，可能是因为这种菌可快速侵占管材表面，其[32]胞外分泌物可将管材表面覆盖，并且能利用多种碳源作为营养物质。Bacillussp.由于其孢子的形成显示出极强的生理差异，这种菌对不利条件有高度耐受性，且与铁的腐蚀有关。例如，尽管使用浓度高达70mg/L的游离氯，Bacillussp.孢子仍然不能从不锈钢、铸铁、铜及PVC片上完全去除。然而，在本研究中，在水泥砂浆管材上并没有发现Bacillussp.。Shane等人也在这种管材中发现了[157]这种有趣的现象。Bacillus孢子的表面由于其外层蛋白质及外壁而具有疏水[158]性，同时在细胞表面具有肽聚糖，可减弱附着于多孔、亲水结构如水泥砂浆材料表面的能力。PE的疏水特性可减弱孢子附着能力，然而金属管材表面携带正电荷，增加了带负电荷的孢子的附着。许多研究发现，Rhizobiales（尤其是Methylobacteriaceae）在PVC、不锈钢管、铜管，铸铁管中占主导地位。这可[141]能是因为他们可以利用各种碳源作为其营养物质。然而，在本研究及Luo[135]等人的研究中，Rhizobiales并未在水泥管道的生物膜中检测到。目前还不清楚为什么Rhizobiales的数目是如此之低，可能是因为附着的Rhizobiales的生存能力被水泥抑制。另外，在本研究中，在铜、不锈钢和PE管材生物膜中发现了Stenotrophomonasmaltophila（属于Gammaproteobacteria），该菌种已经从[143,159]铜、不锈钢、PE和PVC管的生物膜中分离，并且发现与铜腐蚀有关。其它种类的耐氯菌只在一种或者两种管材中发现（图4-5和图4-6）。例如，Acinetobacter仅在塑料管道及铸铁管中发现，而Herbaspirillumsp.，Ferribacteriumsp.和Alcaligenaceae仅在铸铁管中发现。在铁材料的供水管网[142]中，这些菌种与铁的腐蚀有关。Janthinobacteriumsp.，Acidovoraxsp.，Ralstoniasp.和Acidobacteriumsp.仅在水泥管中被发现。这些菌种也在水泥内[135]衬复合钢管的生物膜中被发现。Mycobacteriumsp.是一种在饮用水系统中常见的细菌并且对氯的耐受性很强。奇怪的是，在本研究的5种管材生物膜中都没有发现Mycobacteriumsp.的存在。然而，其他研究者也有过类似的报道。Zhang，Kwon和Hong等人虽然采用了焦磷酸测序的方法，在氯残留量较高的水（0.6~3[32,37,144]mg/L）中仍然没有发现这种菌的存在。这可能是由于Mycobacterium存活能力较差或实验误差造成的。这些研究结果的差异可能不仅是由于分析方法和样品提取步骤的不同造成的，还可能和水的化学性质，流动形态，消毒效率，管道的使用年限和温度等条件有关。[2]供水管网中致病菌的存在和生长是饮用水水质安全的核心问题。在本研究中，Sphingomonassp.，Brucellasp.，Herbaspirillumsp.，Alcaligenaceae，-56- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响Ralstoniamannitolilytica，Stenotrophomonasmaltophila，Moraxellaosloensis，Acinetobactersp.，Pseudomonassp.，Corynebacteriumjeikeium和Bacillussp.[33,43,160-162]为条件致病菌，可能会引起免疫力低的人群受感染。高浓度消毒剂的存在不足以杀灭生物膜上的病原体，并且它们可以被释放到主体水中。值得注意的是，在17个已鉴定的耐氯菌种属中，有11个种属是条件致病菌。这些条件致病菌对氯有相当的耐受性。所有管材表面都附着了4~7种的病原菌：铸铁管的表面附着较多种类的致病菌，而铜和水泥管的表面附着了较少[3,14,种类的致病菌。也许，在供水管网中，耐氯菌可能含有致病菌是不可避免的15]。已有报道表明在加氯的供水管网中的细菌（Sphingobium、Sphingomonas、Pseudomonas、Acinetobacteror、Staphylococcus等）可能含有不同的抗生素耐[21]受性。而这一抗抗生素的特征正符合“超级细菌”的特征，因此，应特别关注供水管网中的耐氯致病菌向“超级细菌”的演变，一旦这种现象在全球的饮用水中蔓延，人类对耐氯致病菌的防治就无药可用。因此，应该非常警惕饮用水中特别是供水管网生物膜中的耐氯致病菌的生长。4.3余氯变化条件下管材对供水管网中耐氯菌生长的影响通过供水管网动态模拟系统，研究了3种余氯浓度变化（1mg/L、3mg/L、4.2mg/L）条件下的铸铁、304不锈钢（简称不锈钢）和聚乙烯（PE）3种管材对生物膜中耐氯菌生长的影响，进水为市政供水，各供水管网动态模拟系统运行期间流速均稳定在0.3m/s，温度维持在28~35ºC之间，平均温度32ºC。除余氯浓度有所变化，其它进水水质均相同。持续运行供水管网动态模拟系统，期间每24h换一次水，相当于水龄24h。4.3.1管壁生物膜对氯衰减的影响待模拟系统运行3个月后，在不同时刻采集各供水管网模拟系统的主体水水样，测定生物膜+模拟系统对不同余氯浓度的余氯消耗情况，同时测定了不加试验管段的各模拟系统对不同余氯浓度的余氯消耗情况作为对照，在生物膜的作用下余氯衰减情况则由上述两种余氯衰减相减计算得到。在铸铁管、不锈钢管和PE管组成的管壁生物膜作用下，余氯浓度随时间变化曲线如图4-7所示，余氯衰减拟合曲线如图4-8所示，拟合方程如表4-1。由试验结果可以看出，在不同余氯条件下培养的球墨铸铁管、不锈钢管和PE管的生物膜作用下，随着-57- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文5PE1mg/LCl2PE3mg/LCl2PE4.2mg/LCl2不锈钢1mg/LCl2不锈钢3mg/LCl24不锈钢4.2mg/LCl2铸铁1mg/LCl2）铸铁3mg/LCl2铸铁4.2mg/LCl2mg/L3（度2余氯浓100510152025时间(h)图4-7不同管壁生物膜氯衰减情况Fig.4-7Chlorinedecayindifferentpipebiofilm8PE1mg/LCl2PE3mg/LCl2PE4.2mg/LCl2不锈钢1mg/LCl2不锈钢3mg/LCl2不锈钢4.2mg/LCl2铸铁1mg/LCl26铸铁3mg/LCl2铸铁4.2mg/LCl2)04C/C-ln(200510152025时间(h)图4-8不同管壁生物膜氯衰减拟合曲线Fig.4-8Chlorinedecayfittedcurveindifferentpipebiofilm氯浓度的增加，余氯的衰减速率有所降低；不同浓度的余氯的衰减速率在球墨铸铁管壁生物膜作用下均最快，较低浓度的余氯在不锈钢管壁生物膜作用下衰减得比PE管壁生物膜作用下快；但当余氯浓度进一步增加时，在PE管中氯衰减速率比不锈钢管中快。反应开始1h后，铸铁管、不锈钢管和PE管中氯浓度-58- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响分别降低了41.5%、8.9%和17.9%。氯在供水管网消耗过程中，管壁生物膜对氯的消耗要远大于氯在主体水的消耗，因此试验结果可以进一步说明铸铁管管壁更容易发生腐蚀，更容易生长生物膜，引起管壁处卫生状态恶化，加速消毒剂在管壁处消耗。在投加较高浓度的消毒剂时，与不锈钢相比，PE管管壁生物膜更容易与氯反应而消耗氯。这是因为PE管道生物膜中的耐氯菌数量高于不[149]锈钢生物膜中的耐氯菌数量。另外PE管道本身会释放部分消耗氯的有机物。表4-1不同管壁生物膜氯衰减拟合结果Table4-1Chlorinedecayfittedcurveindifferentpipebiofilm-12管材消毒剂浓度mg/L拟合公式衰减速率常数(h)相关系数RPE1.0y=0.1698x0.16980.9794PE3.0y=0.0758x0.07580.9781PE4.2y=0.0609x0.06090.9300不锈钢1.0y=0.2021x0.20210.9917不锈钢3.0y=0.0637x0.06370.9737不锈钢4.2y=0.0357x0.03570.8992铸铁1.0y=0.3928x0.39280.9434铸铁3.0y=0.2423x0.24230.9852铸铁4.2y=0.1788x0.17880.95984.3.2余氯变化条件下管材对生物膜中耐氯菌总数的影响供水管网动态模拟系统运行3个月后，采集不同余氯变化条件下的3种管材生物膜样品，进行耐氯菌（HPC-R2A）计数，结果见图4-9，由图可知，球墨铸铁管、不锈钢管和PE管的生物膜中，球墨铸铁管生物膜中附着的耐氯菌最多，PE管其次，不锈钢最少，铸铁管生物膜中附着的耐氯菌总数比PE管、不锈钢管生物膜上的耐氯菌总数高2个数量级。不同管材在不同氯浓度情况下生长的生物膜的耐氯菌总数的变化规律并不一致，PE管生物膜上的耐氯菌总数随着氯浓度的升高，呈现出“U”型变化，先随着氯浓度的上升而下降，当下降一定时，而又随着氯浓度的升高而升高，但耐氯菌总数没有高于较低浓度的余氯处理；不锈钢管生物膜上的耐氯菌总数随着氯浓度的升高呈现出上升的趋势，当氯浓度上升到一定时，又会下降；铸铁管上的耐氯菌总数随着氯浓度的升高，在试验余氯浓度（1~4.2mg/L）下耐氯菌的生长并没有得到抑制。各管-59- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文材中不同余氯浓度培养的生物膜中耐氯菌数目相差均不到7倍，而不同管材中生物膜耐氯菌数目相差很大，因此在1~4.2mg/L余氯浓度下，管材对生物膜中耐氯菌的数量生长的影响要高于余氯。71mg/L3mg/L4.2mg/L)26(CFU/cm510Log数4总3耐氯菌2PE不锈钢铸铁管道材质图4-9不同管壁生物膜生耐氯菌总数（HPC）Fig.4-9Chlorine-resistantbacteriacounts(HPC)ofbiofilmsindifferentpipebiofilm由前一节的分析表明，在供水管网中，管材的特性是影响耐氯菌再生长的[79]重要因素。铸铁管材容易与氯消毒剂反应从而降低其消毒作用，氯的浓度越[7]高，铸铁腐蚀越厉害，铁锈不仅使耐氯菌附着的铁管表面的孔隙度和粗糙度[14,153]增加，而且也可以作为一种耐氯菌的营养物质。因而，随着余氯浓度的升高，铸铁管材上的耐氯菌总数逐步增加。不锈钢是一种中度疏水的材料，在本实验中的pH6.85条件下略微表现负的表面电荷。由于细菌的表面也带负电，所以不锈钢表面上的负的静电力就会阻碍细菌的粘附；另外，不锈钢也是一种金属材料，余氯的浓度的升高会增加不锈钢的腐蚀程度，但它也是一种较为耐[151]腐蚀的金属材料，余氯对不锈钢的腐蚀程度较小。因此，耐氯菌不容易附着在不锈钢表面上，随着余氯浓度的升高，耐氯菌的数目可能会有增加的情况。PE管材会释放大量的可溶性有机碳（DOC）和磷到水里，磷能够增加生物膜中[149]的细菌数，但也会降低胞外多糖（EPS）的产生。因此，在较低余氯浓度阶段，PE管能够附着较多的耐氯菌，但是随着余氯浓度的升高，较少的EPS将影响生物膜中耐氯菌的再生长，耐氯菌的数目也会呈降低趋势。-60- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响4.3.3余氯变化条件下管材对耐氯菌的种群结构变化的影响在供水管网动态模拟系统运行3个月后生物膜生长基本达到稳定时，运用16SrRNA序列PCR-DGGE技术研究了余氯变化条件下3种管材生物膜中耐氯菌的种群结构变化（图4-4）。由图4-10可知，铸铁管生物膜上耐氯菌群与PE和不锈钢管材生物膜上耐氯菌群有很大的不同。为更进一步研究不同实验条件下管道生物膜的细菌种群结构，挑取了45个明显的有代表性的条带进行测序，测序序列经过NCBI比对，做成进化树图（图4-11）。由图4-10和图4-11可知，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）在所有9个生物膜样品中都存在，其中，变形菌门中γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）普遍存在各运行条件的管道生物膜中，而β变形菌纲（Betaproteobacteria）则在铸铁管中存在较多，这可能由于铸铁的腐蚀产物保护了部分β变形菌纲免受氯消毒剂的杀[136]灭。三种管壁生物膜的耐氯菌的多样性程度依次为铸铁>不锈钢>PE。其中，铸铁管壁生物膜中耐氯菌的群落结构最为复杂、生物多样性程度最高，鉴定出了17个菌属；不锈钢管壁生物膜中耐氯菌的群落结构简单、生物多样性程度较高，鉴定出了8个菌属；PE管壁生物膜中耐氯菌的群落结构极为简单、生物多样性程度很低，仅鉴定出了7个菌属；另外，三种管材生物膜中细菌种属差别很大，γ变形菌纲中的不动杆菌属（Acinetobacter）在所有9个生物膜样品中均存在且相对数量较多。不动杆菌属粘附力极强，容易形成胞外聚合物。由此可见，易分泌胞外聚合物等特殊性质的细菌容易在各类管壁上聚集而成为优势菌。同种管材管壁生物膜的耐氯菌种群多样性在中低浓度（1mg/L和3mg/L）时相差不大，而高浓度（4.2mg/L）的余氯则明显降低了耐氯菌的种群多样性。世界卫生组织（WHO）2008年颁布的饮用水水质指南规定，应该在出厂水中添加2~3mg/L的氯以达到满意的消毒效果和维持管网中的余氯浓度，并且最大的[163]氯使用量可达到5mg/L。国家卫生部和国家标准化委员会于2006年联合颁布的《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》则规定出厂水最高限制为4mg/L，最低不能低于0.3mg/L的余氯。而本实验的4.2mg/L的余氯已经超出《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》的规定。因此，在1~3mg/L的余氯浓度下，管材对生物膜中耐氯菌的多样性的影响要大于余氯。-61- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文H1H2H3H4H5H6H7H8H94312623456287891011121329301431151632334534443635371818171919238202039212404241泳道H1：PE管，1mg/LCl2；H2：PE管，3mg/LCl2；H3：PE管，4.2mg/LCl2；H4：不锈钢管，1mg/LCl2；H5：不锈钢管，3mg/LCl2；H6：不锈钢管，4.2mg/LCl2；H7：铸铁管，1mg/LCl2；H8：铸铁管，3mg/LCl2；H9：铸铁管，4.2mg/LCl2图4-10不同实验条件下生物膜样品的PCR-DGGE凝胶图谱Fig.4-10PCR-DGGEgelimageofbiofilmsamplesindifferentexperiments-62- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响图4-11基于图4-10记的典型DGGE条带序列构建的进化树Fig.4-11Dendrogramconstructedonbasisofpartial16SrDNAsequencesoftherespectiveDGGEbandsmarkedinFig.4-10-63- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文4.4PE和不锈钢管材中流速对供水管网中耐氯菌生长的影响本研究通过供水管网动态模拟试验，研究了PE和不锈钢管材中不同流速（0.2m/s、0.4m/s和0.8m/s）对主体水和生物膜中耐氯菌的数量生长和种群变化的影响，以期为供水管网中耐氯菌的控制奠定理论基础。4.4.1流速对主体水中耐氯菌总数的影响本研究中，不同运行条件的设置及其出水水质变化和方差分析分别见表4-2和表4-3。在模拟实际管道运行工况的实验中，加氯水在各模拟装置循环流动12h后，水质均有不同程度变化。其中，以余氯、TOC变化较为显著（p<0.001），其余水质变化均未达显著水平。各模拟装置进水余氯浓度为0.97mg/L，12h后衰减至0.20mg/L左右；进水TOC为2.14mg/L，12h后增至2.99~3.59mg/L。管材对主体水中余氯、TOC均有显著影响，而流速只对余氯的衰减影响显著。表4-2不同实验条件下出水水质变化Table4-2Outletwaterqualitychangesindifferentexperiments运行条件温度浊度总溶解性固TOC总铁余氯流速pH管材(ºC)(NTU)体(mg/L)(mg/L)(mg/L)(mg/L)(m/s)0.221.99±3.180.62±0.227.38±0.06107.90±11.583.38±0.420.20±0.090.19±0.04聚乙0.421.44±3.150.65±0.257.39±0.06103.46±10.413.52±0.390.20±0.100.16±0.04烯（PE）0.822.98±3.330.71±0.267.42±0.07102.15±10.003.59±0.400.20±0.080.15±0.050.221.81±3.190.60±0.197.37±0.06106.75±11.542.99±0.420.22±0.080.25±0.06不锈钢0.421.25±3.110.61±0.237.38±0.06107.78±10.053.13±0.400.21±0.080.22±0.060.822.61±3.230.67±0.237.41±0.06110.19±13.163.05±0.460.21±0.080.20±0.07本实验中供水管网动态模拟系统辅助管道和低位水箱材质均为PVC，有研究表明，塑料管材（PVC、PE等）在输送自来水时，会向水体中溶出可溶性有[149]机碳（DOC），因此，本实验中不同装置的水体中TOC均会有不同程度的升高（表2-4和表4-2），与不锈钢管材的模拟系统出水TOC相比，PE管材的模拟系统出水TOC增加更为显著。本实验中，PE管材的出水TOC浓度随着流速的增大而增加，但未达显著水平。初始氯浓度在0.97mg/L时，经循环流动12h后，各装置的氯衰减率都达74%以上，介于Gibbs等人在1mg/L余氯浓-64- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响度下培养的两种管道成熟生物膜（PVC和镀锌铁管）的氯衰减率（0.72和0.86）[71]之间。本实验中PE管道生物膜对氯衰减率高于不锈钢管道生物膜对氯衰减率，并且流速也是影响PE管道中氯衰减的重要因素之一（p<0.01），这是因为PE管道本身会释放部分消耗氯的有机物，流速越快，释放的有机物也会越多，另外PE管道生物膜中的耐氯菌数量也会高于不锈钢生物膜中的耐氯菌数量。表4-3不同实验条件下出水水质方差分析（F检验）Table4-3ANOVAofoutletwaterindifferentexperiments(Ftest)运行条件温度浊度pH溶解性固体TOC总铁余氯耐氯菌总数管材0.150.400.302.8529.08***0.2932.06***39.07***流速1.791.193.060.211.260.036.94**0.54管材×流速0.7480.561.281.246.49***0.089.24***8.13***PE管内不同流速1.000.641.561.361.220.014.44*0.55不锈钢管内不同流速0.790.561.510.390.500.043.140.10***：在p<0.001水平下差异显著；**：在p<0.01水平下差异显著；*：在p<0.05水平下差异显著图4-12是稳定水力条件下，各供水管网动态模拟系统进出水中耐氯菌总数随系统运行时间的变化。运行期间进水耐氯菌总数维持在1~15CFU/mL，管材对出水耐氯菌总数影响显著（p<0.001，见表4-3）。各装置运行初期（前11d）出水耐氯菌总数略低于进水耐氯菌总数。随着运行时间的增加，各装置出水耐氯菌总数逐步增加，首先是PE管中出水耐氯菌总数逐步快速增加，第53d后增速放缓，至第81d后出水耐氯菌总数基本维持在1100~1800CFU/mL之间，流速对其影响不大（p>0.5），在0.4m/s流速时出水耐氯菌总数略高于0.2m/s和0.8m/s时的出水耐氯菌总数。在前39d时不锈钢管中出水耐氯菌总数呈缓慢上升，之后进入快速上升状态，第81d后增速放缓，至第96d后出水耐氯菌总数基本维持在480~580CFU/mL之间，流速对不锈钢管中出水耐氯菌总数的影响与PE管中相似。各装置稳定运行后，出水耐氯菌总数比进水耐氯菌总数增加25倍以上，本实验中进水经循环流动12h的时间远少于实际细菌增殖继代的时间（1~17d），而且本实验装置是相对封闭的系统，没有大量外源细菌[148]的引入，因此，出水耐氯菌总数主要来源于管壁生物膜上附着耐氯菌的脱落。-65- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文4进水PE0.2m/sPE0.4m/sPE0.8m/s不锈钢0.2m/s不锈钢0.4m/s不锈钢0.8m/s3(CFU/mL)102Log数1总0耐氯菌-10102030405060708090100110120运行时间(d)图4-12不同实验条件下出水耐氯菌总数（HPC）随时间变化Fig.4-12Chlorine-resistantbacteriacounts(HPC)ofoutletwaterindifferentexperimentsoverdifferentdates4.4.2流速对生物膜中耐氯菌总数的影响图4-13是不同实验条件下各管道生物膜耐氯菌总数随系统运行时间的变化。整个运行期间，管材对生物膜上附着耐氯菌总数的影响要大于流速。不论何种水力条件，PE管道生物膜耐氯菌总数均显著大于同一时期的不锈钢管道生物膜耐氯菌总数（p<0.001），运行前期（14d前）PE和不锈钢生物膜耐氯菌总数均快速增长，第21d后两类管材上附着的耐氯菌总数增速放缓，至第56d2左右PE管道生物膜耐氯菌总数基本稳定，达7000~16000CFU/cm，至第98d2左右不锈钢管道生物膜耐氯菌总数基本稳定，达2500~6000CFU/cm。由于塑[149]料管材（PVC、PE等）在输送水时，会向水体中溶出DOC和磷，因此PE管材生物膜上的微生物可以得到更多的营养物来进行增殖生长。不同流速条件中，0.8m/s流速下生长的PE和不锈钢管道生物膜耐氯菌总数均显著低于同类管材中其它流速下生长的生物膜（p<0.001），两类管材均在0.4m/s流速下生长的生物膜耐氯菌总数达到最大，但0.2m/s和0.4m/s流速下生长的生物膜耐氯菌总数差异均不显著（p>0.1）。上述研究结果与Lehtola等人研究相似，Lehtola等人研究认为在小于0.3m/s流速条件下管道生物膜中的生物量随流速的增大而增大，在0.5m/s流速条件下管道生物膜中的微生物由于-66- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响[164]冲刷作用开始出现明显的脱落，数量开始减少。研究表明，生物膜上的生物量增加主要是微生物在管壁上的增殖，增加流速有助于主体水中的营养物质向生物膜内部扩散，从而使生物膜中的耐氯菌增殖加快。但是，流速的升高，对生物膜的冲刷作用也会加大，渗透进生物膜内部的消毒剂也会增多，因而生物[78]膜的生长也会受到抑制，而当流速达到3m/s~4m/s时才足以使生物膜大部[164]分脱落。因此，生物膜上的耐氯菌数目会随着水流速度的增加先呈增加趋势，而后又会减少。5PE0.2m/sPE0.4m/sPE0.8m/s不锈钢0.2m/s)2不锈钢0.4m/s不锈钢0.8m/s4(CFU/cm10Log数总3耐氯菌20102030405060708090100110120运行时间(d)图4-13不同实验条件下生物膜耐氯菌总数（HPC）随时间变化Fig.4-13Chlorine-resistantbacteriacounts(HPC)ofbiofilmindifferentexperimentsoverdifferentdates4.4.3流速对耐氯菌的种群结构变化的影响在管道生物膜生长达到稳定时，基于16SrRNA序列运用PCR-DGGE技术研究了不同实验条件下的管道生物膜中耐氯菌种群结构变化（图4-14）。由图4-14可知，管材对生物膜上附着耐氯菌种群的影响要大于流速对其的影响，PE管材和不锈钢管材间的条带相似度小于30%，而同种管材内的不同流速间的条带相似度均大于80%。为更进一步研究不同实验条件下管道生物膜中的耐氯菌种群结构，从41个条带中挑取了18个明显的有代表性的条带进行测序，测序序列经过NCBI比对，做成进化树图（图4-15）。-67- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文泳道PE1：PE管，v=0.2m/s；PE4：PE管，v=0.4m/s；PE3：PE管，v=0.8m/s；SS1：不锈钢管，v=0.2m/s；SS2：不锈钢管，v=0.4m/s；SS3：不锈钢管，v=0.8m/s图4-14不同实验条件下生物膜样品的PCR-DGGE凝胶图谱Fig.4-14PCR-DGGEgelimageofbiofilmsamplesindifferentexperiments由图4-14和图4-15可知，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）在所有6个生物膜样品中都存在，其中，变形菌门中主要是α变形菌纲（Alphaproteobacteria）和γ变形菌纲（Gammaproteobacteria），而β变形菌纲（Betaproteobacteria）则较少。另外，放线菌门（Actinobacteria）在0.2m/s流速下生长的PE管道生物膜上也有发现。Zhu等人在之前的研究中也发现α变形菌纲和γ变形菌纲在较高浓度余氯下（1.20mg/L）存在更多，而β变形菌纲相对存在较少，这可能是因为β变形菌纲对氯较为敏感，而α变形菌纲和γ变[7]形菌纲对氯相对较为迟钝，并且α变形菌纲更能在贫营养条件下生长。从条带的相对亮度来看，α变形菌纲中的鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonasechinoides，条带10）和厚壁菌门中的蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus，条带5）-68- 第4章管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响在所有6个生物膜样品中均存在且相对数量较多，且不锈钢管生物膜中相对含量要多于PE管生物膜。鞘氨醇单胞菌属能够利用种类繁多的碳源，并且可以分泌胞外聚合物（EPS），这样有助于其更迅速地粘附在管壁上，并能抵抗较高[32]浓度的氯。而芽孢杆菌属具有特殊的生理多样性，能够在不利环境条件下形成芽孢，在度过不利条件后，又能重新扩增繁殖，这些具孢子的细菌能够更加[40]耐氯。由此可见，某些具形成孢子（生理多样性）或易分泌胞外聚合物等特殊性质的细菌容易在各类管壁上聚集而成为优势菌。图4-15基于图4-14标记的典型DGGE条带序列构建的进化树Fig.4-15Dendrogramconstructedonbasisofpartial16SrDNAsequencesoftherespectiveDGGEbandsmarkedinFig.4-14-69- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文4.5本章小结本章通过供水管网动态模拟系统，以东北某市市政供水为进水，在大于1mg/L的余氯浓度下，采用平板计数法、流式细胞技术法和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）等分析技术研究了管材及流速对供水管网中耐氯菌生长的影响，得出如下结论：（1）在稳定的高氯浓度（1.20mg/L）的供水模拟管网中，管材对生物膜中耐氯菌数量和种群多样性影响均显著。管材的特性是影响耐氯菌再生长的重要因素。各管材生物膜中耐氯菌数量达到稳定的时间长短顺序为：铜>不锈钢≈水泥砂浆>铸铁>PE。在试验阶段结束后（197天），五种管材上生长的生物膜的耐氯菌细胞总数大小顺序为：铸铁>水泥砂浆>铜>PE>不锈钢。α变形菌纲和γ变形菌纲在所有管材生物膜中均存在且为优势菌群，Sphingomonassp.和Pseudomonadaceae细菌在所有5种管材中均大量存在；Bacillussp.和Methylobacteriaceae细菌也经常见于铜、PE、不锈钢和铸铁管道生物膜中。其它耐氯菌则只存于1~3种管材中。此外，有三分之二的已鉴定出细菌为耐氯致病菌，铸铁管材中存在较多种类的耐氯致病菌。（2）在余氯变化条件（1.0~4.2mg/L）下，铸铁、不锈钢、PE三种管材生物膜中，铸铁生物膜对氯消耗最大。余氯的升高，耐氯菌的生长并没有完全受到抑制，相反在不锈钢管和铸铁管中生物膜中耐氯菌数量反而有一定的增加。铸铁生物膜的耐氯菌的种群多样性最为丰富，同种管材管壁生物膜的种群多样性多样性在中低浓度（1mg/L和3mg/L）的余氯多样性相差不大。（3）在进水余氯0.97mg/L下，管材对耐氯菌生长的影响要大于流速。不同流速中，生物膜细菌总数先随着流速的增大而略微增大，进一步加大流速时生物膜细菌总数则显著减少。某些具形成孢子（Bacillussp.）或易分泌胞外聚合物（Sphingomonassp.）等特殊性质的细菌容易在这两种管材上聚集而成为优势菌，而某些具疏水性的细菌在不锈钢管材上则不易聚集，特别是在流速增大的时候更难聚集。-70- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究5.1引言为确保供水管网输送安全、达标的饮用水，研究供水管网中的微生物生态[1,2,89]学对设计新型和有效的控制措施非常有必要。最近的研究发现，供水管网中的细菌受管网中的微生物种群多样性及其相互作用（种间关系）的影响，[2,5,94,127,多物种的细菌在生物膜形成能力上和在抵抗消毒剂上有着巨大的优势128,165][2]，由于这些微生物已经适应了寡营养的环境，因此非常有必要研究寡营养培养条件下的耐氯菌种群多样性和种间关系对生物膜的形成的影响。目前采用96孔的聚苯乙烯微量细胞培养板（96孔培养板）来研究生物膜的形成和消毒的方法在国内饮用水领域还未见报道，近几年才开始在国外饮用水领域的研[5,94,127,128]究有所报道。聚苯乙烯表面的物理化学性质类似于供水管网中的一[94]些管道材料，如不锈钢、聚氯乙烯等。在本研究中，从第4章在高氯浓度下（1~4.2mg/L）运行的供水管网模拟[124]系统的管道生物膜中分离的5种菌（Acinetobactersp.、Acidovoraxdefluvii、Bacilluscereus、Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.）均为条件[7,14,21,43]致病菌，由第3章、第4章以及由李阳青研究表明这些菌均较为耐氯[124][42,43]，而且在供水管网中非常常见。参试的5种耐氯菌来源于3个不同的门（变形菌门（proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）），5个不同的纲（变形菌门的α变形菌纲（Gammaproteobacteria）、β变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ变形菌纲（Gammaproteobacteria），厚壁菌门的芽孢杆菌纲（Bacilli）和放线菌门的放线菌纲（Actinobacteridae）），在供水管网中非常具有代表性。为评估参试的5种耐氯菌种群多样性和种群间相互作用对生物膜形成的影响，本研究利用96孔培养板振荡培养形成生物膜，并对不同时间培养（24h、48h和72h）的生物膜的生物量、活性和细菌总数加以测定，并全面评估不同耐氯菌及其混合菌的生物膜形成能力，探索供水管网中耐氯菌生物膜生长的规律，为供水管网生物膜中耐氯菌的控制提供理论基础。-71- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文5.2单一菌种生物膜的形成特性5.2.1单一菌种生物膜的生物量变化图5-1是5种耐氯菌经24h、48h和72h培养后生物膜的生物量。培养时间对这5种菌的生物量影响均显著（p<0.05），均在72h时生物量最大，除Microbacteriumlaevaniformans菌外，其它4种菌均随着培养时间的延长，生物量均逐渐增加，72h的生物量均显著大于24h的生物量（p<0.05），其中，Acinetobactersp.，Bacilluscereus和Microbacteriumlaevaniformans在72h的生物量均显著大于24h和48h的其各自生物量（p<0.05）。除Acidovoraxdefluvii外，48h生长的生物膜生物量均与24h生长的生物膜生物量差异不显著（p>0.05）。Acinetobactersp.在24h和72h生长的生物膜生物量最大，除24h时显著大于同期Sphingomonassp.生物膜生物量（p<0.05）外，均未显著大于同期其它3种细菌生物膜生物量（p>0.05）。Acidovoraxdefluvii在48h生长的生物膜生物量最大，并显著大于同期其它4种菌的生物膜生物量（p<0.05），然而有趣的是，Acidovoraxdefluvii在72h生长的生物膜生物量却最小。这说明Acidovoraxdefluvii菌的生物膜在48h内就能达到成熟。在24h生长的生物膜生物量大小依次是：Acinetobactersp.>Microbacteriumlaevaniformans>Bacilluscereus>Acidovoraxdefluvii>Sphingomonassp.。在48h生长的生物膜生物量大小依次是：Acidovoraxdefluvii>Acinetobactersp.>Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Microbacteriumlaevaniformans。在72h生长的生物膜生物量大小依次是：Acinetobactersp.>Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Microbacteriumlaevaniformans>Acidovoraxdefluvii。5.2.2单一菌种生物膜的生物活性变化图5-2是5种细菌在24h、48h和72h培养期间的生物膜活性。由图可知，这5种单一菌种生物膜的活性均较低，其OD490均小于0.125，而且每种菌的OD490的方差（SD）均较大。除Bacilluscereus和Sphingomonassp.菌外，其它菌在不同的培养时期，生物膜的活性差异均不显著（p>0.05）。Bacilluscereus和Sphingomonassp.的生物膜均在72h的活性最大，并显著大于其24h的活性（p<0.05）。相对来说，Microbacteriumlaevaniformans和Acinetobactersp.的生物膜活性均较大，且这两种菌的生物膜活性差异不显著（p>0.05），在整个培养期内均显著大于Acidovoraxdefluvii生物膜活性（p<0.05），在24h-72- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究和72h时均显著大于Sphingomonassp.生物膜活性（p<0.05）。在24h生长的生物膜活性大小依次是：Acinetobactersp.>Microbacteriumlaevaniformans>Bacilluscereus>Acidovoraxdefluvii>Sphingomonassp.。在48h生长的生物膜活性大小依次是：Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp.>Sphingomonassp.>Bacilluscereus>Acidovoraxdefluvii。在72h生长的生物膜活性大小依次是：Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp.>Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii。0.6AcidovoraxAcinetobacter0.5BacillusMicrobacterium570SphingomonasOD0.40.3生物量0.2生物膜0.10.0244872培养时间(h)图5-1不同培养时间的单一菌种生物膜生物量（OD570）Fig.5-1OD570valuesasameasureofsingle-speciesbiofilmmassoverdifferentincubationtime由于OD490值普遍偏小，因此用生物膜比生长活性来表示：OD490/OD570(OD490/570)。图5-3是5种细菌在24h、48h和72h培养期间生长生物膜比生长活性。除Acinetobactersp.菌外，其它菌在不同的培养时期，生物膜比生长活性差异均不显著（p>0.05）。Acinetobactersp.在72h的生物膜比生长活性显著小于24h和48h的生物膜比生长活性（p<0.05）。在不同的培养期内，除Acidovoraxdefluvii在48h的生物膜比生长活性最小外，其它菌均是72h的生物膜比生长活性最小。Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.的生物膜比生长活性随着培养时间的延长呈现出先升高后降低的趋势，而Acinetobactersp.和Bacilluscereus呈现出逐渐降低趋势。在培养初期（24h），5种菌的生物膜比生长活性差异不显著（p>0.05），随着培养时间的延长（48h-73- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文和72h），5种菌的生物膜比生长活性差异显著（p<0.05）。在48h和72h时，Microbacteriumlaevaniformans的生物膜比生长活性均显著大于其它4种菌（p<0.05），而其它4种菌的差异则均不显著（p>0.05）。在24h生长的生物膜比生长活性大小依次是：Acinetobactersp.>Microbacteriumlaevaniformans>Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii。在48h生长的生物膜比生长活性大小依次是：Microbacteriumlaevaniformans>Sphingomonassp.>Acinetobactersp.>Bacilluscereus>Acidovoraxdefluvii。在72h生长的生物膜比生长活性大小依次是：Microbacteriumlaevaniformans>Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acinetobactersp.>Acidovoraxdefluvii。0.15AcidovoraxAcinetobacterBacillusMicrobacteriumSphingomonas0.12490OD0.09活性0.06生物膜0.030.00244872培养时间(h)图5-2不同培养时间的单一菌种生物膜活性（OD490）Fig.5-2OD490valuesasameasureofsingle-speciesbiofilmrespiratoryactivityoverdifferentincubationtime5.2.3单一菌种生物膜的细菌总数由于异养菌平板计数法的耗时长，劳动强度大，本研究只选取了培养末期72h的5种菌生物膜的细菌总数进行计数，其结果如图5-4。由图可知，62Acinetobactersp.的生物膜细菌总数为1.81×10CFU/cm，显著大于其它细菌5生物膜的细菌总数（p<0.05）；而其它细菌的生物膜细菌总数均小于9×102CFU/cm，且差异不显著（p>0.05）。培养末期5种菌生长的生物膜细菌总数大小分别为：Acinetobactersp.>Bacilluscereus>Sphingomonassp.>-74- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究Acidovoraxdefluvii>Microbacteriumlaevaniformans。其中，生物膜最大的细菌总数约高于生物膜最小的细菌总数55倍。1.5AcidovoraxAcinetobacter1.2Bacillus490/570MicrobacteriumODSphingomonas0.9活性生长0.6比0.3生物膜0.0244872培养时间(h)图5-3不同培养时间的单一菌种生物膜比生长活性（OD490/570）Fig.5-3OD490/570valuesasameasureofsingle-speciesbiofilmspecificrespiratoryactivityoverdifferentincubationtime7)26(CFU/cm10Log数5细菌总4生物膜3AcidovoraxAcinetobacterBacillusMicrobacteriumSphingomonas图5-4培养72h的单一菌种生物膜细菌总数（HPC）Fig.5-4Bacteriacounts(HPC)ofsingle-speciesbiofilmduring72hincubationtime-75- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文5.2.4单一菌种生物膜形成能力比较[125]根据Stepanovic等人的方法，将参试的5种耐氯菌在不同培养时期的生物膜形成能力进行判定和排序，并依此分为不具生物膜形成能力，弱的生物膜形成能力，中等的生物膜形成能力和强的生物膜形成能力，其评定结果见表5-1。由表5-1可知，随着培养时间的延长，5种菌的生物膜形成能力均呈增强趋势，在24h培养期，只有Acinetobactersp.和Microbacteriumlaevaniformans菌表现出了弱的生物膜形成能力，其它3种菌均不具生物膜形成能力；在48h培养期，除Microbacteriumlaevaniformans菌不具生物膜形成能力外，其它4种菌均具弱的生物膜形成能力；而在72h培养期，所有5种菌均形成了生物膜，特别是Acinetobactersp.表现出了强的生物膜形成能力。表5-1五种供水管网中的耐氯菌的生物膜形成能力Table5-1Biofilmformingabilitiesoffivechlorine-resistantbacteriaisolatedfromDWDS不同培养时间（h）生物膜形成能力细菌244872Acidovoraxdefluvii0++Acinetobactersp.+++++Bacilluscereus0+++Microbacteriumlaevaniformans+0++Sphingomonassp.0+++注：0，不具生物膜形成能力；+，弱的生物膜形成能力；++，中等的生物膜形成能力；+++，强的生物膜形成能力。由上述分析表明，所有参试的5种细菌在72h均能形成生物膜（表5-1）。参试的5种细菌生物膜比生长活性与生物膜生物量均呈一定程度的负相关（图5-1和图5-3）。在细菌细胞粘附在材料表面后，一些复杂的胞外聚合物就会增加，生物膜中一些具非代谢活性的生物量也会随之增加，因而也就降低了生物[94]膜的比生长活性。在72h培养期，Acinetobactersp.表现出了强的生物膜形成能力，Bacilluscereus、Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.表现出了中等的生物膜形成能力，Acidovoraxdefluvii表现出了弱的生物膜形成能力。这些判定结果与生物膜细菌计数的结果也是一一对应的（表5-1，图5-1[94,165]和图5-4）。这些研究结果与Ren等人和Simoes等人的研究结果基本一致。虽然Microbacteriumlaevaniformans在培养初期（24h）就表现出了弱的生物膜-76- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究形成能力，但在接下来的24h中却表现出了不具生物膜形成能力。研究表明，细菌最初在管材上具较强的吸附和生物膜形成能力并不代表在之后就具强的生[143]物膜形成能力，也并不能最终决定生物膜的特征。在实际环境中，不可能只是单物种的生物膜存在于供水管网中，在供水管网中通常都是复杂的多种微生物混合生物膜，因此需要研究两种耐氯菌甚至更多种耐氯菌混合的生物膜形成情况。5.3双菌相互作用及混合生物膜的形成特性5.3.1双菌混合生物膜的生物量变化虽然双菌混合生物膜与实际供水管网中的多物种生物膜的复杂性还是有一定的差距，复杂的种群多样性往往会有多种多样的种间和种内关系交错影响着[2,95]多物种生物膜的形成，因而目前仍然不清楚多物种的混合生物膜形成机制[95]。双菌生物膜可以作为一种简化来研究不同物种的种间关系在生物膜形成的作用，并且可以减少其它干扰，进而很清楚地明晰两物种的关系（竞争、协作、[2,94,95]中性）。由参试的5种细菌两两混合共形成10组混合生物膜在不同培养期内的生物量见图5-5。由图可知，除Acidovorax+Acinetobacter和Acinetobacter+Microbacterium混合生物膜在整个培养期内生物膜生物量差异显著（p<0.05）外，其它8组双菌混合生物膜在整个培养期内生物膜生物量差异均不显著（p>0.05）。Acidovorax+Acinetobacter和Acinetobacter+Microbacterium的混合生物膜在72h的生物量均显著大于24h和48h的对应生物膜的生物量（p<0.05），而24h和48h的它们对应生物膜的生物量差异则不显著（p>0.05）。十组混合生物膜中，Acidovorax+Acinetobacter，Acidovorax+Bacillus，Acinetobacter+Microbacterium，Bacillus+Microbacterium和Sphingomonas+Acidovorax的混合生物膜随培养时间的延长，生物量逐渐增加；Bacillus+Acinetobacter和Sphingomonas+Acinetobacter的混合生物膜随培养时间的延长，生物量先减少后增加；Acidovorax+Microbacterium和Sphingomonas+Microbacterium的混合生物膜随培养时间的延长，生物量先增加后减少；Sphingomonas+Bacillus的混合生物膜随培养时间的延长，生物量逐渐减少。Sphingomonas+Acinetobacter和Sphingomonas+Bacillus的混合生物膜在24h的生物量最大，Acidovorax+Microbacterium和Sphingomonas+Microbacterium的混合生物膜在48h的生物量最大，其它另外6组混合生物膜菌均在72h的生物量最大。不同双菌混合生-77- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文1.25Acd+AcnAcd+BacAcd+MicAcn+MicBac+AcnBac+Mic1.00Sph+AcdSph+AcnSph+Bac570Sph+MicOD0.75生物量0.50生物膜0.250.00244872培养时间(h)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-5不同培养时间的双菌生物膜生物量（OD570）Fig.5-5OD570valuesasameasureofdual-speciesbiofilmmassoverdifferentincubationtime物膜生物量在同一培养期内差异均达显著水平（p<0.05），在24h培养期，Sphingomonas+Bacillus的混合生物膜生物量显著大于其它9组双菌混合生物膜生物量（p<0.05），而其它9组双菌混合生物膜差异则不显著（p>0.05）；在48h培养期，Sphingomonas+Bacillus和Acidovorax+Microbacterium的混合生物膜生物量均显著大于其它双菌混合生物膜生物量（p<0.05），而Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜生物量显著小于其它双菌混合生物膜生物量（p<0.05），其它7组双菌混合生物膜差异则不显著（p>0.05）；在72h培养期，Acidovorax+Acinetobacter的混合生物膜生物量显著大于其它9组双菌混合生物膜生物量（p<0.05），其它9组双菌混合生物膜差异则不显著（p>0.05）。在24h形成的生物膜生物量大小依次是：Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Sphingomonas+Acidovorax>Bacillus+Microbacterium>Acidovorax+Bacillus>Sphingomonas+Acinetobacte>Acinetobacter+Microbacterium>Sphingomonas+Microbacterium>Acidovorax+Acinetobacter。在48h形成的生物膜生物量大小依次是：Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Microbacterium>Sphingomonas+Acidovorax>Acidovorax+Acinetobacter>Acidovorax+Bacillus>Bacillus+-78- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Acinetobacter+Microbacterium>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter。在72h形成的生物膜生物量大小依次是：Acidovorax+Acinetobacter>Sphingomonas+Acidovorax>Acidovorax+Microbacterium>Acinetobacter+Microbacterium>Acidovorax+Bacillus>Sphingomonas+Bacillus>Bacillus+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter。5.3.2双菌混合生物膜的生物活性变化由10组双菌混合形成的生物膜在不同培养期内的生物膜活性见图5-6。由图可知，除Bacillus+Acinetobacter混合生物膜在24h的活性显著大于48h和72h的生物膜活性（p<0.05）外，其它9组双菌混合生物膜在整个培养期内生物膜活性差异均不显著（p>0.05）。十组双菌混合生物膜中，Acidovorax+Acinetobacter和Acidovorax+Microbacterium的混合生物膜随培养时间的延长活性逐渐升高。Acidovorax+Bacillus，Bacillus+Acinetobacter，Bacillus+Microbacterium和Sphingomonas+Bacillus的混合生物膜随培养时间的延长活性逐渐降低。Acinetobacter+Microbacterium的混合生物膜随培养时间的延长活性先降低后升高，在24h的活性最高。Sphingomonas+Acidovorax，Sphingomonas+Acinetobacter和Sphingomonas+Microbacterium的混合生物膜随培养时间的延长活性先升高后降低。不同双菌混合生物膜活性在同一培养期内差异均达显著水平（p<0.05），在24h培养期，Sphingomonas+Bacillus的混合生物膜活性显著大于其它9组混合生物膜活性（p<0.05），而Acidovorax+Microbacterium，Bacillus+Acinetobacter和Acinetobacter+Microbacterium的混合生物膜活性差异则不显著（p>0.05），但显著大于其它6组双菌混合生物膜活性（p<0.05）；在48h培养期，Acidovorax+Microbacterium和Sphingomonas+Bacillus的混合生物膜活性均显著大于其它双菌混合生物膜活性（p<0.05）；在72h培养期，Acidovorax+Microbacterium的混合生物膜活性显著大于其它双菌混合生物膜活性（p<0.05），而Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜活性则显著小于其它双菌混合生物膜活性（p<0.05）。在24h形成的生物膜活性大小依次是：Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Acinetobacter+Microbacterium>Acidovorax+Acinetobacter>Sphingomonas+Acidovorax>Acidovorax+Bacillus>Bacillus+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter>Sphingomonas+Microbacterium。在48h形成的生物膜活性大小-79- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文依次是：Acidovorax+Microbacterium>Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Acinetobacter>Sphingomonas+Acidovorax>Acinetobacter+Microbacterium>Acidovorax+Bacillus>Bacillus+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter。在72h形成的生物膜活性大小依次是：Acidovorax+Microbacterium>Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Acinetobacter>Acinetobacter+Microbacterium>Sphingomonas+Acidovorax>Acidovorax+Bacillus>Bacillus+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter。0.4Acd+AcnAcd+BacAcd+MicAcn+MicBac+AcnBac+MicSph+AcdSph+AcnSph+Bac4900.3Sph+MicOD活性0.2生物膜0.10.0244872培养时间(h)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-6不同培养时间的双菌生物膜活性（OD490）Fig.5-6OD490valuesasameasureofdual-speciesbiofilmrespiratoryactivityoverdifferentincubationtime十组双菌混合生物膜在不同培养期内的生物膜比生长活性见图5-7。参试的10组双菌混合生物膜比生长活性与生物膜生物量均呈一定程度的负相关（图5-5和图5-7）。Acidovorax+Acinetobacter，Acidovorax+Bacillus，Acinetobacter+Microbacterium，Bacillus+Acinetobacter，Bacillus+Microbacterium和Sphingomonas+Microbacterium双菌混合生物膜在整个培养期内生物膜比生长-80- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究1.2Acd+AcnAcd+BacAcd+MicAcn+MicBac+AcnBac+MicSph+AcdSph+AcnSph+Bac490/5700.9Sph+MicOD活性0.6生长比0.3生物膜0.0244872培养时间(h)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-7不同培养时间的双菌生物膜比生长活性（OD490/570）Fig.5-7OD490/570valuesasameasureofdual-speciesbiofilmspecificrespiratoryactivityoverdifferentincubationtime活性差异显著（p<0.05）；而Sphingomonas+Bacillus，Acidovorax+Microbacterium，Sphingomonas+Acidovorax和Sphingomonas+Acinetobacter双菌混合生物膜在整个培养期内生物膜比生长活性差异则不显著（p>0.05）。Bacillus+Acinetobacter混合生物膜在24h的比生长活性显著大于48h和72h的生物膜的比生长活性（p<0.05），而48h和72h比生长活性差异则不显著（p>0.05）。除Sphingomonas+Acinetobacter和Sphingomonas+Microbacterium的混合生物膜在48h的比生长活性最高，24h的比生长活性最低外，其余8组双菌混合生物膜均在24h的比生长活性最高，其中Acidovorax+Microbacterium的混合生物膜随培养时间的延长比生长活性先降低后升高，另外7组混合菌生物膜随培养时间的延长比生长活性逐渐降低。在培养早期（24h）不同双菌混合生物膜比生长活性差异显著（p<0.05），而在培养中末期（48h和72h）不同双菌混合生物膜比生长活性差异则不显著（p>0.05）。在24h培养期，Acinetobacter+Microbacterium混合生物膜比生长活性显著大于其它9组双菌混合生物膜比生长活性（p<0.05），Sphingomonas+Microbacterium和Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜比生长活性则显著小于其它8组双混-81- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文合生物膜比生长活性（p<0.05）。在24h形成的生物膜比生长活性大小依次是：Acinetobacter+Microbacterium>Acidovorax+Acinetobacter>Bacillus+Acinetobacter>Acidovorax+Microbacterium>Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Bacillus>Bacillus+Microbacterium>Sphingomonas+Acidovorax>Sphingomonas+Acinetobacter>Sphingomonas+Microbacterium。在48h形成的生物膜比生长活性大小依次是：Acidovorax+Microbacterium>Sphingomonas+Bacillus>Acinetobacter+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Acidovorax+Acinetobacter>Sphingomonas+Acidovorax>Sphingomonas+Microbacterium>Acidovorax+Bacillus>Sphingomonas+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium。在72h形成的生物膜比生长活性大小依次是：Acidovorax+Microbacterium>Sphingomonas+Bacillus>Sphingomonas+Microbacterium>Acinetobacter+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter>Sphingomonas+Acidovorax>Acidovorax+Acinetobacter>Bacillus+Acinetobacter>Acidovorax+Bacillus>Bacillus+Microbacterium。5.3.3双菌混合生物膜的细菌总数在培养末期（72h）的10组双菌混合生物膜的细菌总数见图5-8。由图可62知，Acidovorax+Acinetobacter混合生物膜细菌总数为8.04×10CFU/cm，显著大于其它9组双菌混合生物膜的细菌总数（p<0.05）；其次Sphingomonas+Bacillus，Sphingomonas+Acidovorax，Bacillus+Acinetobacter和Sphingomonas+6262Acinetobacter混合生物膜细菌总数为3.5×10CFU/cm~6.2×10CFU/cm，亦显著大于其它5组双菌混合生物膜的细菌总数（p<0.05）；其它双菌混合生62物膜细菌总数则均小于2×10CFU/cm。其中，细菌总数最大的Acidovorax+Acinetobacter生物膜约高于细菌总数最小的Acidovorax+Microbacterium生物膜40倍。5.3.4双菌相互作用及混合生物膜的形成能力比较上述10组双菌混合在不同培养时期的生物膜形成能力评定结果见表5-2。Sphingomonas+Bacillus和Acidovorax+Microbacterium混合生物膜在整个培养期内均表现出了中等强度以上的生物膜形成能力。在24h培养期，Sphingomonas+Bacillus混合就已经具有强的生物膜形成能力；Acidovorax+Microbacterium混合则表现出中等强度的生物膜形成能力；Acidovorax+Acinetobacter混合不具生物膜形成能力；除此之外，另外7组双菌混合均具弱-82- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究的生物膜形成能力。在48h培养期，Sphingomonas+Bacillus和Acidovorax+Microbacterium混合具强的生物膜形成能力；Acidovorax+Acinetobacter和Acidovorax+Bacillus混合具中等的生物膜形成能力；Sphingomonas+Acinetobacter混合则不具生物膜形成能力；除此之外，另外5组双菌混合均具弱的生物膜形成能力。在72h培养期，所有双菌混合均具有生物膜形成能力，其中，Acidovorax+Acinetobacter，Acidovorax+Microbacterium和Sphingomonas+Acidovorax混合具强的生物膜形成能力。Bacillus+Microbacterium，Sphingomonas+Microbacterium和Sphingomonas+Acinetobacter混合随着培养时间的延长，生物膜形成能力基本不变，而Sphingomonas+Bacillus混合随着培养时间的延长，生物膜形成能力有降低趋势，其它6组双菌混合均随着培养时间的延长生物膜形成能力呈增强趋势。8)27(CFU/cm10Log6数细菌总5生物膜4Acd+AcnAcd+BacAcd+MicAcn+MicBac+AcnBac+MicSph+AcdSph+AcnSph+BacSph+Mic(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-8培养72h的双菌生物膜细菌总数（HPC）Fig.5-8Bacteriacounts(HPC)ofdual-speciesbiofilmduring72hincubationtime从微生物生态学的角度来看，竞争和协作的微生物种间关系并存在供水管[93,94]网中。有研究表明，由于生物膜的种间协作关系，Acinetobactersp.和Pseudomonasputida混合的双菌生物膜比原先的单一细菌生物膜更稳定、生物[166]量更多；同样，由于Pseudomonasaeruginosa的存在，使得Burkholderiacepacia和Pseudomonasaeruginosa双菌生物膜中的Burkholderiacepacia细胞数-83- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文[167]目比Burkholderiacepacia单一菌种生物膜的细胞数目多10倍。而Giao等人则发现从饮用水生物膜中分离出来的Acidovoraxspp.和Sphingomonasspp.对Legionellapneumophila菌有竞争作用，使得Legionellapneumophila的可培[168]养性显著下降。表5-2两种细菌混合的生物膜形成能力Table5-2Biofilmformingabilitiesofdual-speciesofbacteria不同培养时间（h）生物膜形成能力两种细菌混合244872Acidovorax+Acinetobacter0+++++Acidovorax+Bacillus+++++Acidovorax+Microbacterium++++++++Acinetobacter+Microbacterium++++Bacillus+Acinetobacter++++Bacillus+Microbacterium+++Sphingomonas+Acidovorax+++++Sphingomonas+Acinetobacter+0+Sphingomonas+Bacillus++++++++Sphingomonas+Microbacterium+++注：0，不具生物膜形成能力；+，弱的生物膜形成能力；++，中等的生物膜形成能力；+++，强的生物膜形成能力。在供水管网的低营养环境中，寡营养专性细菌将会首先在供水管网中附着，[93]接下来富营养细菌才会利用寡营养细菌的分泌物或排泄物附着，因为营养的[94]竞争，竞争作用将会在微生物群落结构形成发挥重要角色。一般来说，在同等培养条件下，当双菌生物膜的生物量或细菌总数大于两个单一菌种生物膜的生物量或细菌总数之和，即可认为协作（合作）关系（synergy/cooperation），与原先两个单一菌种生物膜的生物量或细菌总数之和相当，则可认为是中性关系（neutralinteraction），若小于原先两个单一菌种生物膜的生物量或细菌总数[94-96]之和则可认为是竞争关系（competition）。在本研究的10组双菌生物膜中（图5-6和图5-8），Acidovorax+Acinetobacter，Sphingomonas+Bacillus，Sphingomonas+Acidovorax混合生物膜生物量和细菌总数均较大，并且是原先两个单一菌种生物量和细菌总和的4~8倍，因此归为种间协作关系；Acidovorax+Microbacterium混合生物膜的生物量和细菌总数虽然较小，是原先-84- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究两个单一菌种生物量和细菌总和的2倍，因此也归于种间协作关系。Acinetobacter+Microbacterium混合生物膜的生物量和细菌总数虽然较大，但比原先两个单一菌种生物量和细菌总和要小，因此归为种间竞争关系。Sphingomonas+Microbacterium和Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜在24h培养期的生物量略大于原先两单一菌种生物量之和，在48h和72h菌小于原先两单一菌种生物量、细菌总数之和，因此可以认为在培养初期表现为中[94]性关系，之后则为种间竞争关系。Acidovorax+Bacillus，Bacillus+Acinetobacter和Bacillus+Microbacterium混合生物膜在各培养期的生物量和细菌总数均与相应的两菌生物量或细菌总数之后相当，因此归为中性关系。如果从生物膜的活性和比生长活性来看，这10组生物膜的活性和比生长活性基本上都小于原先两个单一菌种的活性和比生长活性之和，因此不能用活性来判定微生物的种间关系。Simoes等人研究认为在两种细菌表现为协作关系的混合往往生物膜的比生[94]长活性都较小，并且比生长活性和生物量的关系是相反的关系。上述细菌混合中，Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜表现为竞争关系在Simoes等人[94]的研究中也有同样的报道。Liu等人发现存在于土壤中Sphingomonassp.和[169]Bacillussp.能够很好地种间协作，并有效地去除降解氯氰菊酯农药。在含铁的基质中或材料上，Acidovorax+Bacillus可能会表现为种间协作关系，因为Bacillussp.是一种铁还原菌（iron-reducingbacteria），而Acidovoraxsp.一种铁[170,171]氧化菌（iron-oxidizingbacteria），但由于培养基质中和材料上并不存在铁的化合物，因此没有表现出种间协作关系，而是表现为中性关系。由于微生物的种间关系非常复杂，经常会受到它们所处的环境（营养条件、水力条件、生物膜的结构、空间位置等）的干扰，因此，到目前为止，自然环境中甚至是实验室的条件中的微生物的种间关系的作用机制至今仍不清楚，也并没有形成[92,94,95]一个统一的实验方法和结论。为更好地确定生物膜中微生物种间关系的作用机制，目前有研究者从以下的一些实验来确定：测定微生物的生长速率，微生物的运动性（motility），微生物细胞分泌的一些代谢物或抑制物质、信号转导物质、群体感应（quorumsensing）物质（如乙酰高丝氨酸内酯[94,95]（acyl-homoserinelactone（AHL）、铁螯合剂等）。5.4多菌相互作用及混合生物膜的形成特性5.4.1多菌混合生物膜的生物量变化微生物群落中各个群落之间存在各种的相互作用，有些相互作用对某一群-85- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文体是有利的，而对其他群体是不利的或没有影响，由于这种正负相互作用使得[96]微生物群落保持生态平衡。在供水管网中的微生物群落正是由于正负相互作用使得系统中多种微生物组成的生物膜保持一种平衡，而当系统中的某种微生物缺失或过量时，也将打破这种生态平衡。研究表明，许多水生细菌，包括Pseudomonasspp.，Acinetobacterspp.，Flavobacteriumspp.，Stenotrophomonasmaltophilia，Aeromonashydrophila，Burkholderiacepacia和Bacillusbrevis均能[99,172]产生细菌素或类细菌素的物质抑制Legionellapneumophila的生长。在供水管网中可能存在一种生物控制的方法，即通过刺激一些非致病微生物的生长[1]来抑制一些致病微生物的生长。因此，在供水管网中也可能存在一种“关键性”的微生物，这种微生物的存在与否会显著地改变供水管网中的微生物种群密度或种群多样性。为寻找这种微生物，我们可以通过人为地加入或缺失某种细菌，以评估该种细菌对多细菌生物膜的作用，从而为控制供水管网的多物种生物膜提供理论依据。由参试的5种细菌中的4种或5种菌混合共6组多菌混合生物膜在不同培养期内的生物量见图5-9。由图可知，与单一菌种和双菌生物膜相比，6组多菌混合生物膜在整个培养期内生物量均较大，OD570均大于0.6，而且没有随培养时间的延长发生显著的变化（p>0.05），6组多菌混合生物膜在72h的生物量均大于24h和48h的相应多菌混合生物膜的生物量。除缺Microbacterium（withotMicrobacterium）混合生物膜在24h的生物量最小外，其它多菌混合生物膜均在48h的生物量最小。在24h和72h培养期，不同多菌混合生物膜生物量差异未达显著水平（p>0.05）；而在48h培养期，缺Microbacterium混合生物膜生物量显著大于其它5组多菌混合生物量（p<0.05），其它多菌混合生物膜生物量差异则不显著（p>0.05）。在整个培养期，缺Microbacterium混合生物膜生物量均最大，缺Acidovorax混合生物膜生物量均最小。在24h和48h形成的生物膜生物量大小均为：缺Microbacterium混合>全部5种菌>缺Sphingomonas混合>缺Acinetobacter混合>缺Bacillus混合>缺Acidovorax混合。在72h形成的生物膜生物量大小依次是：缺Microbacterium混合>缺Sphingomonas混合>全部5种菌>缺Bacillus混合>缺Acinetobacter混合>缺Acidovorax混合。-86- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究2.5全部5种菌缺Acd缺Acn缺Bac2.0缺Mic缺Sph570OD1.5生物量1.0生物膜0.50.0244872培养时间(h)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-9不同培养时间的多菌混合生物膜生物量（OD570）Fig.5-9OD570valuesasameasureofmultispeciesbiofilmmassoverdifferentincubationtime5.4.2多菌混合生物膜的生物活性变化六组多菌混合生物膜在不同培养期内的活性见图5-10。除全部5种菌混合生物膜在不同的培养时期差异显著（p<0.05）外，其它5组多菌混合生物膜并没有随培养时间的延长活性发生显著的变化（p>0.05）。缺Bacillus混合和缺Sphingomonas混合生物膜活性随着培养时间的延长逐渐增大，其它4组多菌混合生物膜活性在不同培养期的大小均为：48h>72h>24h。在24h培养期，缺Acidovorax混合生物膜活性显著大于其它多菌混合的生物膜活性（p<0.05），缺Sphingomonas混合生物膜活性最小，显著小于其它多菌混合的生物膜活性（p<0.05），其他4组多菌混合生物膜活性差异则不显著（p>0.05）；而在48h和72h培养期，这6组多菌混合生物膜差异均不显著（p>0.05）。在24h形成的生物膜活性大小为：缺Acidovorax混合>缺Acinetobacter混合>缺Bacillus混合>缺Microbacterium混合>全部5种菌>缺Sphingomonas混合。在48h形成的生物膜活性大小为：缺Acinetobacter混合>全部5种菌>缺Acidovorax混合>缺Sphingomonas混合>缺Microbacterium混合>缺Bacillus混合。在72h形成的生物膜活性大小依次是：缺Acinetobacter混合>-87- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文缺Acidovorax混合>全部5种菌>缺Sphingomonas混合>缺Bacillus混合>缺Microbacterium混合。1.5全部5种菌缺Acd缺Acn缺Bac1.2缺Mic缺Sph490OD0.9活性0.6生物膜0.30.0244872培养时间(h)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-10不同培养时间的多菌混合生物膜活性（OD490）Fig.5-10OD490valuesasameasureofmultispeciesbiofilmrespiratoryactivityoverdifferentincubationtime六组多菌混合生物膜在不同培养期内的生物膜比生长活性见图5-11。在整个培养期内，所有多菌混合生物膜并没有随培养时间的延长比生长活性发生显著的变化（p>0.05）。除缺Microbacterium混合生物膜比生长活性在24h最大外，其它多菌混合生物膜比生长活性菌均在48h最大。在24h培养期，缺Acidovorax混合生物膜比生长活性著大于其它5组多菌混合的生物膜比生长活性（p<0.05），缺Bacillus混合和缺Acinetobacter混合生物膜也较大，并显著大于其它3组多菌混合生物膜比生长活性。在48h培养期，缺Acidovorax混合和缺Acinetobacter混合显著大于其它4组多菌混合生物膜比生长活性（p<0.05），缺Microbacterium混合生物膜比生长活性著小于其它多菌混合的生物膜比生长活性（p<0.05）。在72h培养期，这6组多菌混合生物膜比生长活性差异不显著（p>0.05）。在24h形成的生物膜比生长活性大小为：缺Acidovorax混合>缺Bacillus混合>缺Acinetobacter混合>缺Microbacterium混合>全部5种菌>缺Sphingomonas混合。在48h形成的生物膜比生长活性大小为：缺-88- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究Acidovorax混合>缺Acinetobacter混合>缺Bacillus混合>全部5种菌>缺Sphingomonas混合>缺Microbacterium混合。在72h形成的生物膜比生长活性大小依次是：缺Acinetobacter混合>缺Acidovorax混合>缺Bacillus混合>全部5种菌>缺Sphingomonas混合>缺Microbacterium混合。1.6全部5种菌缺Acd缺Acn缺Bac缺Mic缺Sph490/5701.2OD活性0.8生长比0.4生物膜0.0244872培养时间(h)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-11不同培养时间的多菌混合生物膜比生长活性（OD490/570）Fig.5-11OD490/570valuesasameasureofmultispeciesbiofilmspecificrespiratoryactivityoverdifferentincubationtime5.4.3多菌混合生物膜的细菌总数在培养末期（72h）的6组多菌混合生物膜的细菌总数见图5-12。由图可72知，缺Microbacterium混合生物膜细菌总数为1.46×10CFU/cm，显著大于其它5组细菌多菌混合生物膜的细菌总数（p<0.05）；其次，缺Bacillus，缺62Acidovorax和全部5种菌混合生物膜细菌总数也均较大（6.8×10CFU/cm~8.762×10CFU/cm），大于缺Acinetobacter混合和缺Sphingomonas混合生物膜的细6262菌总数（分别为5.9×10CFU/cm和3.5×10CFU/cm）。与单一菌种和双菌混合生物膜的细菌总数相比，多菌混合生物膜最大的细菌总数仅高于多菌混合生物膜最小的细菌总数不到4倍。-89- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文8)2(CFU/cm107Log数6细菌总生物膜5缺Acd缺Acn缺Bac缺Mic缺Sph全部5种菌(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图5-12培养72h的多菌混合生物膜细菌总数（HPC）Fig.5-12Bacteriacounts(HPC)ofmultispeciesbiofilmduring72hincubationtime5.4.4多菌相互作用及混合生物膜的形成能力比较由不同培养时期的多菌生物膜生物量分析，6组多菌混合的生物膜形成能力评定结果见表5-3。由表可知，在整个培养期内，这6组多菌混合均具有强的生物膜形成能力。与单一菌种、双菌相比，多菌混合的生物膜形成能力明显增强。由此可见，生物膜中细菌种类组成越复杂，生物膜形成能力越强。研究[5]表明，多物种的生物膜可以提高生物膜的种群稳定性和生物量，Stenotrophomonasrhizophila，Xanthomonasretroflexus，Microbacteriumoxydans和Paenibacillusamylolyticus4种菌混合形成的生物膜表现出了很强的协同作用，[165]混合生物膜的生物量比4种单一生物膜生物量的总和多了3倍。在本研究中，不同时期六组多菌混合生物膜的生物量和细菌总数均比相应单一菌种生物膜的生物量和细菌总数总和大，一般都在2倍以上，最大的4种菌缺Microbacteriumlaevaniformans生物膜的细菌总数要高于相应单一菌种生物膜的细菌总数之和的4倍。而多菌混合生物膜的比生长活性均小于相应单一菌种生物膜的比生长活性总和。同单一菌种和双菌生物膜类似，多菌生物膜的比生长活性也与生物量呈负相关。-90- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究表5-3多种细菌混合的生物膜形成能力Table5-3Biofilmformingabilitiesofmultispeciesofbacteria不同培养时间（h）生物膜形成能力多种细菌混合244872全部5种菌+++++++++缺Acidovorax+++++++++缺Acinetobacter+++++++++缺Bacillus+++++++++缺Microbacterium+++++++++缺Sphingomonas+++++++++注：0，不具生物膜形成能力；+，弱的生物膜形成能力；++，中等的生物膜形成能力；+++，强的生物膜形成能力。[127]参考Simoes等人的方法，根据多菌种混合生物膜的生物量（OD570）或比生长活性（OD490/570），对某种菌的存在对另外多种群混合生物膜的抑制或促进能力进行了判定，并依此分为强抑制、弱抑制、弱促进、强促进能力，其判定结果见表5-4和5-5。在整个培养期内，Microbacteriumlaevaniformans对5种菌混合生物膜具有弱的抑制作用，而Acinetobactersp.，Acidovoraxdefluvii和Bacilluscereus对5种菌混合生物膜具有弱的促进作用；在24h和48h的5种菌混合生物膜中，Sphingomonassp.弱促进了混合生物膜的生长，而在72h时，Sphingomonassp.则表现出了弱抑制混合生物膜的生长。而运用生物膜比生长活性进行判定时，除24h的Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.，以及48h的Sphingomonassp.的判定结果与运用生物量的判定结果一致，其它情况判定结果均相反。Simoes等人研究发现，在由Acinetobactercalcoaceticus，Burkholderiacepacia，Methylobacteriumsp.，Mycobacteriummucogenicum，Sphingomonascapsulata和Staphylococcussp.6种细菌组成的混合生物膜中，Mycobacteriummucogenicum和Sphingomonascapsulata能够明显抑制生物膜的生长，而Acinetobactercalcoaceticus和Burkholderiacepacia能够促进混合生物膜的生长；Methylobacteriumsp.和Staphylococcussp.对混合生物膜的生长几乎无影响，并且实验证实Mycobacteriummucogenicum和Sphingomonascapsulata抑制混合生[127]物膜的生长原因是这两种菌产生了抑制其它细菌生长的胞外分泌物质。Guo等人在微生物燃料电池（MFCs）的阳极生物膜上接种Microbacteriumsp.后，-91- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文表5-4单细菌对5种细菌混合生物膜的生物量的影响Table5-4Effectsofsingle-speciesbacteriaonthemassoffive-speciesbiofilms不同培养时间（h）单细菌对混合生物膜的生物量的影响细菌244872Acidovorax+++Acinetobacter+++Bacillus+++Microbacterium－－－Sphingomonas++－注：－－，强抑制；－，弱抑制；+，弱促进；++，强促进。表5-5单细菌对5种细菌混合生物膜的比生长活性的影响Table5-5Effectsofsingle-speciesbacteriaonthespecificrespiratoryactivityoffive-speciesbiofilms不同培养时间（h）单细菌对混合生物膜的比生长活性的影响细菌244872Acidovorax－－－－Acinetobacter－－－－Bacillus－－－－Microbacterium－+++Sphingomonas+++注：－－，强抑制；－，弱抑制；+，弱促进；++，强促进。发现Microbacteriumsp.明显抑制了产电菌Deinococcussp.和Paenibacillussp.[173]的生长，使产电效率明显降低。在本研究中，Microbacteriumlaevaniformans，Acinetobactersp.和Sphingomonassp.的研究结果与以上两项研究结果相似。[32]Sphingomonassp.能够利用种类繁多的碳源，可能会因为营养的竞争，产生一些抑制物质来抑制其它细菌的生长，因而竞争/拮抗作用将会在含Sphingomonas[94]sp.的混合生物膜中发挥重要角色。Microbacteriumlaevaniformans属于放线菌门（Actinobacteria）的放线菌纲（Actinobacteridae）。研究表明，从水环境中分离出来的众多放线菌门细菌（包括Microbacteriumsp.）明显抑制了Bacilluscereus，Acinetobactercalcoaceticus和Salmonellatyphi的生长，并且发现放线菌门（Actinobacteria）细菌能够分泌一些具杀菌作用的次生代谢物质（如多聚-92- 第5章供水管网生物膜的形成及耐氯菌群作用关系研究[174]乙酰）。Acinetobactersp.能够与几乎所有的细菌发生共聚集（coaggregation），在多物种的淡水生物膜中，Acinetobactersp.能够促进一些不能够凝聚的细菌凝[175,176]聚，从而可以促进生物膜的形成。Acidovoraxdefluvii是一种铁氧化菌[171]（iron-oxidizingbacteriumIOB），在实际管网中也容易促进多物种生物膜的[177][37]形成并发生红水现象，而且Acidovoraxsp.能够利用多种物质进行代谢，[50]也容易在塑料制品的材料上吸附并形成生物膜。Bacillussp.由于其芽孢的形成显示出极强的生理差异和适应性，尽管使用浓度高达75mg/L的游离氯，芽[178,179]孢仍然不能从不锈钢、铸铁、铜及PVC片上完全去除。由上述分析可知，尽管在生物膜形成初期，单一菌种或双菌生物膜的形成能力有限，但如果在较长培养时间的生物膜中或者在多物种（4种以上细菌混合）的生物膜中，均具有很强的生物膜形成能力。虽然诸如Microbacteriumlaevaniformans、Sphingomonassp.等菌能够抑制多物种生物膜的形成，但这种抑制作用仍然较弱，不足以完全控制多物种生物膜的生长。因此有必要通过消毒或者其它的方式对多物种生物膜进行控制，在接下来的内容中我们将探讨氯消毒剂对多物种生物膜的杀灭作用以及多物种生物膜对消毒剂的抗性机制。5.5本章小结本章利用96孔微量细胞培养板振荡培养法，对在供水管网动态模拟系统分离的5种耐氯菌进行单一培养、两两混合培养、4种或5种多菌混合培养形成生物膜，比较不同时期生物膜的生物量、活性、细菌总数，并全面评估了不同耐氯菌及其混合的生物膜形成能力和耐氯菌的菌群作用关系，得出如下结论：（1）从供水管网分离出的5种耐氯菌（Acinetobactersp.、Acidovoraxdefluvii、Bacilluscereus、Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.）在72h均能形成生物膜，Acinetobactersp.表现为强的生物膜形成能力，Bacilluscereus、Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.表现为中等强度的生物膜形成能力，Acidovoraxdefluvii表现为弱的生物膜形成能力。（2）由于双菌生物膜的种间协作关系，Acidovorax+Acinetobacter，Sphingomonas+Bacillus，Sphingomonas+Acidovorax和Acidovorax+Microbacterium混合生物膜表现为强的生物膜形成能力；由于双菌生物膜的种间竞争关系，Acinetobacter+Microbacterium，Sphingomonas+Microbacterium和Sphingomonas+Acinetobacter表现为弱或中等强度的生物膜形成能力；由于双菌生物膜的种间中性关系，Acidovorax+Bacillus，Bacillus+Acinetobacter和Bacillus+Microbacterium表现为中等强度的生物膜形成能力。-93- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文（3）与单一菌种、双菌相比，多菌的生物膜形成能力明显增强，在整个培养期内均表现为强的生物膜形成能力。Microbacteriumlaevaniformans对5种菌混合生物膜具有弱的抑制作用；Acinetobactersp.，Acidovoraxdefluvii和Bacilluscereus对5种菌混合生物膜具有弱的促进作用；Sphingomonassp.对5种菌混合生物膜先表现为弱的促进作用，后表现为弱抑制作用。-94- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究6.1引言世界卫生组织（WHO）2008年颁布的饮用水水质指南规定，应该在出厂水中添加2~3mg/L的氯以达到满意的消毒效果和维持管网中的余氯浓度，并且[163]最大的氯使用量可达到5mg/L。国家卫生部和国家标准化委员会于2006年联合颁布的《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》则规定出厂水最高限制为4mg/L，最低不能低于0.3mg/L的余氯。上述水质标准都是以主体水（悬浮菌）[61]为控制对象的消毒策略，显然这并不足以抑制生物膜中的细菌再生长或增殖。研究供水管网生物膜的消毒控制将有助于确定最佳的消毒参数，并可确保供水管网输送（微生物）安全、优质的饮用水。因此本章的主要目的是了解供水管网耐氯菌的种群多样性及其相互作用对生物膜细菌的耐氯性的影响。根据国内[5,11,62,136,180]外众多研究者的主体水和生物膜的氯消毒研究现状和某湖库型水源供水管网的余氯分布特点，本研究针对生物膜氯消毒设置了0.3、0.6、1、2、4和10mg/L的余氯浓度进行研究，为研究供水管网生物膜细菌的耐氯性的生物学机制，通过对第5章不同耐氯菌及其双菌、多菌混合形成的生物膜进行加氯处理，运用96孔微培养板作为筛选余氯去除和杀灭不同生物膜消毒效率差异[94]的快速和简单方法，比较分析不同耐氯菌及其混菌的生物膜耐氯机制，为供水管网中的耐氯菌控制提供理论基础。6.2生物膜细菌的耐氯性6.2.1单一菌种生物膜细菌的耐氯性在96孔微培养板实验中，5种耐氯菌生物膜经过不同浓度余氯消毒60min后生物膜生物量去除率见图6-1。消毒前的5种单一菌种生物膜的生物量和细菌总数见表6-1。不同浓度的余氯对这5种单一菌种生物膜生物量去除率差异均显著（p<0.05）。其中，在0.3mg/L时，Microbacteriumlaevaniformans耐氯性最强，其次为Sphingomonassp.；之后随着余氯浓度的升高，Sphingomonassp.和Bacilluscereus耐氯性逐渐增强，在2mg/L或更高的余氯浓度，这两种细菌的耐氯性均显著大于其它细菌的耐氯性（p<0.05）。相对来说，Bacilluscereus更耐高浓度的氯，不同浓度余氯对Bacilluscereus生物膜生物量去除率差异不-95- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文显著（p>0.05），即对余氯浓度不敏感，而其它4种细菌均差异显著（p<0.05），对余氯浓度较为敏感。这4种单一菌种生物膜中，Acidovoraxdefluvii和Acinetobactersp.生物膜在高浓度余氯（≥2mg/L）下的生物量去除率均不显著（p>0.05），而在较低浓度余氯（≤1mg/L）下的生物量去除率差异显著（p<0.05）；Sphingomonassp.和Microbacteriumlaevaniformans生物膜则在2mg/L和4mg/L的生物量去除率差异显著（p<0.05）。在10mg/L的余氯下，Bacilluscereus生物膜生物量去除率不到87%，而在此浓度下，其它4种菌的生物膜生物量去除率均大于92%。Acinetobactersp.生物膜在所研究的6种余氯浓度下均最敏感，生物量去除率均最大。在0.6mg/L以上的余氯浓度，Acidovoraxdefluvii生物膜对氯也较为敏感。一般来说，这5种菌的耐氯性由强至弱分别为：Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Microbacteriumlaevaniformans>Acidovoraxdefluvii>Acinetobactersp.。AcidovoraxAcinetobacterBacillusMicrobacterium100Sphingomonas(%)80去除率60生物量40生物膜2000.30.612410余氯浓度(mg/L)图6-1不同余氯浓度对单一菌种生物膜生物量去除率Fig.6-1Percentageofbiofilmmassremovalforsingle-speciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment由表6-1和图6-1，生物膜生物量与生物膜细菌的耐氯性（生物量去除率）并无显著的正相关性（p>0.05）。相反，Acinetobactersp.生物膜的生物量和细菌总数最大（见表6-1），但对氯却最敏感。因此可以认为，对于个体细菌来说，耐氯性主要取决于细菌细胞本身的耐氯机制，跟种群密度关系不大。图6-2是5种单一菌种生物膜经过不同浓度余氯消毒60min后生物膜活性-96- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究降低率，在4mg/L和10mg/L的余氯浓度，5种菌的生物膜活性降低率均为100%。在所有处理的样品中，过半数的样品OD490小于空白组的OD490，另外消毒前的5种菌的生物膜的OD490均小于0.125（见表6-1），这说明甲基四氮盐（XTT）减低法应用在生物膜消毒的活性测定上有一定的局限，测定值过小，区分度不够，也容易造成较大的误差。有鉴于此，在接下来的消毒实验中不测定生物膜活性降低率。表6-1消毒前单细菌生物膜生物量、活性和细菌总数Table6-1Initial(beforedisinfection)biofilmmass,respiratoryactivityandHPCofsingle-species细菌总数细菌生物量（OD570±SD）活性（OD490±SD）2（log10CFU/cm±SD）Acidovoraxdefluvii0.169±0.0550.029±0.0124.72±0.21Acinetobactersp.0.431±0.1410.103±0.0156.23±0.39Bacilluscereus0.293±0.0900.089±0.0195.90±0.27Microbacterium0.209±0.0800.124±0.0234.49±0.28laevaniformansSphingomonassp.0.236±0.1100.068±0.0245.75±0.20AcidovoraxAcinetobacterBacillusMicrobacteriumSphingomonas100(%)80降低率60活性40生物膜2000.30.612410余氯浓度(mg/L)图6-2不同余氯浓度对单一菌种生物膜活性降低率Fig.6-2Reductionrateofbiofilmrespiratoryactivityforsingle-speciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment-97- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文图6-3是5种单一菌种生物膜经过不同浓度余氯消毒60min后生物膜细菌灭活率。除在0.3mg/L的低浓度余氯对Bacilluscereus生物膜细菌灭活率略大于Sphingomonassp.外，Bacilluscereus生物膜细菌灭活率在其余浓度的余氯均最小，耐氯性最强。在余氯浓度为0.3mg/L和1mg/L时，Microbacteriumlaevaniformans生物膜细菌灭活率最大，除此之外，Acinetobactersp.生物膜在其余浓度余氯的灭活率均最大，对氯均最为敏感。在0.3mg/L和1mg/L的较低浓度余氯下，这5种单一菌种生物膜细菌灭活率差异不显著（p>0.05）；在0.6mg/L的余氯时，Bacilluscereus生物膜细菌灭活率显著小于其它4种菌生物膜细菌灭活率（p<0.05），其它4种菌生物膜细菌灭活率差异不显著（p>0.05）；当余氯浓度升高（≥2mg/L）后，5种单一菌种生物膜细菌灭活率差异均达显著性水平（p<0.05），Bacilluscereus和Sphingomonassp.生物膜细菌灭活率均较小，并显著小于其它3种菌的灭活率（p<0.05）；Microbacteriumlaevaniformans和Acinetobactersp.生物膜细菌灭活率均较大，并显著大于其它3种菌的灭活率（p<0.05）。各单一菌种生物膜均在低浓度余氯（≤1mg/L）下差异不显著（p>0.05），当余氯>1mg/L时，Acinetobactersp.生物膜细菌灭活率呈显著的梯度式增加（p<0.05），由1mg/L的1.23-log增加到10mg/L的4.20-log；当余氯>2mg/L时，Acidovoraxdefluvii和Microbacteriumlaevaniformans生物膜细菌灭活率呈显著的梯度式增加（p<0.05），分别由2mg/L的1.11-log、1.74-log增加到10mg/L的2.35-log、4.15-log；而Sphingomonassp.和Bacilluscereus的生物膜细菌灭活率只在4mg/L和10mg/L余氯时灭活率呈显著差异（p<0.05），分别由4mg/L的1.12-log、1.08-log增加到10mg/L的2.20-log、1.44-log。与结晶紫法测得的结果相似，这5种菌的耐氯性由强至弱分别为：Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii>Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp.。相对来说，Acinetobactersp.和Microbacteriumlaevaniformans对氯较为敏感，而Acidovoraxdefluvii、Sphingomonassp.和Bacilluscereus耐氯性较强，较为耐氯。除2mg/L余氯时生物膜细菌灭活率与生物膜细菌总数呈中等强度的正相关（r=0.52；p=0.044）外，其它余氯浓度时生物膜细菌灭活率与生物膜细菌总数均不相关（p>0.05）。因此也可以认为，对于个体细菌来说，耐氯性主要取决于细菌细胞本身的耐氯机制，跟种群密度关系不大。-98- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究5Acidovorax)Acinetobacter/NBacillus04(NMicrobacterium10Sphingomonaslog3灭活率2细菌1生物膜00.30.612410余氯浓度(mg/L)图6-3不同余氯浓度对单一菌种生物膜细菌灭活率Fig.6-3Log10reductionofbacteriaforsingle-speciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment6.2.2双菌混合生物膜细菌的耐氯性由5种耐氯菌两两混合共10组双菌混合形成的生物膜经过不同浓度余氯消毒60min后生物膜生物量去除率见图6-4，消毒前的10组双菌混合生物膜的生物量和细菌总数见表6-2。除1mg/L余氯对10组双菌混合生物膜生物量去除率差异不显著（p>0.05）外，其它浓度的余氯对10组双菌混合生物膜生物量去除率差异均显著（p<0.05）。其中，在0.3mg/L余氯时，Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜细菌的耐氯性最强，当余氯浓度≥0.6mg/L时，Sphingomonas+Bacillus混合生物膜细菌的耐氯性最强；在1mg/L余氯时，Sphingomonas+Acinetobacter混合生物膜对氯最敏感，在其它浓度余氯（0.3mg/L、0.6mg/L和≥2mg/L）时，Acinetobacter+Microbacterium混合生物膜对氯最敏感。在低浓度余氯（≤0.6mg/L）下，绝大多数的双菌混合生物膜细菌的耐氯性比与之对应的单一菌种生物膜细菌的耐氯性均有所增加。在较高浓度余氯（≥1mg/L）下，分别与Acinetobactersp.和Acidovoraxdefluvii混合的双菌混合生物膜细菌的耐氯性比Acinetobactersp.和Acidovoraxdefluvii单一菌种生物膜细菌的耐氯性均有所增加；除Sphingomonas+Bacillus混合生物膜细菌的耐氯性增加外，与Bacilluscereus混合其余3组双菌混合生物膜细菌的耐氯性均比Bacilluscereus单一菌种生物膜细菌的耐氯性要弱；与Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.分别混合的双菌混合生物膜细菌的耐氯性大-99- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文多数比Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.单一菌种生物膜细菌的耐氯性要强。十组双菌混合生物膜中，除Sphingomonas+Bacillus和Acidovorax+Acinetobacter混合生物膜外，其余8组双菌混合生物膜在高浓度余氯（≥2mg/L）下的生物量去除率均不显著（p>0.05），Sphingomonas+Bacillus混合生物膜在4mg/L和10mg/L的生物量去除率差异显著（p<0.05），Acidovorax+Acinetobacter混合生物膜在2mg/L和4mg/L的生物量去除率差异显著（p<0.05）。一般来说，这10组双菌混合生物膜细菌的耐氯性由强至弱分别为：Sphingomonas+Bacillus>Sphingomonas+Acidovorax>Sphingomonas+Acinetobacter≈Sphingomonas+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter≈Bacillus+Microbacterium≈Acidovorax+Acinetobacter>Acidovorax+Bacillus>Acidovorax+Microbacterium>Acinetobacter+Microbacterium。除0.3mg/L余氯时生物量去除率与生物膜生物量呈显著的中等强度正相关（r=0.59；p=0.001）外，其它余氯浓度时生物膜细菌灭活率与生物膜生物量均不呈显著相关性（p>0.05）。Acd+AcnAcd+BacAcd+MicAcn+Mic100Bac+AcnBac+MicSph+AcdSph+AcnSph+BacSph+Mic(%)80去除率60生物量40生物膜200.30.612410余氯浓度(mg/L)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图6-4不同余氯浓度对双菌生物膜生物量去除率Fig.6-4Percentageofbiofilmmassremovalfordual-speciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment-100- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究表6-2消毒前两种耐氯菌混合生物膜生物量和细菌总数Table6-2Initial(beforedisinfection)biofilmmassandHPCofdual-species2两种细菌混合生物量（OD570±SD）细菌总数（log10CFU/cm±SD）Acidovorax+Acinetobacter0.944±0.2916.88±0.39Acidovorax+Bacillus0.491±0.2056.17±0.24Acidovorax+Microbacterium0.577±0.1275.29±0.30Acinetobacter+Microbacterium0.555±0.2726.25±0.24Bacillus+Acinetobacter0.324±0.0936.68±0.28Bacillus+Microbacterium0.262±0.1025.96±0.32Sphingomonas+Acidovorax0.601±0.2686.70±0.40Sphingomonas+Acinetobacter0.135±0.0416.56±0.28Sphingomonas+Bacillus0.486±0.2106.76±0.32Sphingomonas+Microbacterium0.138±0.0235.73±0.23不同浓度余氯对10组双菌混合形成的生物膜消毒60min后生物膜细菌灭活率见图6-5，消毒前的10组双菌混合生物膜的细菌总数见表6-2。除0.3mg/L余氯对10组双菌混合生物膜生物量灭活率差异不显著（p>0.05）外，其它浓度的余氯对这10组双菌混合生物膜细菌灭活率差异均显著（p<0.05）。其中，除0.6mg/L余氯Sphingomonas+Bacillus混合生物膜细菌灭活率（0.31-log）略大于Sphingomonas+Acidovorax混合生物膜细菌灭活率（0.30-log）外，Sphingomonas+Bacillus双菌混合生物膜细菌灭活率在其它5种余氯浓度中均最小（0.25~1.63-log）。在0.6mg/L、1mg/L和10mg/L余氯时Acinetobacter+Microbacterium双菌混合生物膜细菌灭活率最大，分别为0.99-log、1.21-log和3.45-log；在2mg/L和4mg/L余氯时Acidovorax+Acinetobacter混合生物膜细菌灭活率最大，分别为2.00-log和2.93-log；在0.3mg/L余氯时Acidovorax+Bacillus混合生物膜细菌灭活率最大为0.64-log。同运用结晶紫法测定的结果相似，与Acinetobactersp.混合的双菌生物膜细菌的耐氯性均比Acinetobactersp.单一菌种生物膜细菌的耐氯性均有所增加，而与Bacilluscereus和Sphingomonassp.细菌混合的生物膜细菌的耐氯性大多数比Bacilluscereus和Sphingomonassp.单一菌种生物膜细菌的耐氯性要弱；与Microbacteriumlaevaniformans和Acidovoraxdefluvii细菌混合生物膜细菌的耐氯性大多数比Bacilluscereus和Sphingomonassp.单一菌种生物膜细菌的耐氯性要强。十组双菌混合生物膜细菌灭活率中基本上都是随着余氯的浓度的升高而升高。与结晶紫法测定的结果不-101- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文同的是，平板计数法在高浓度余氯（≥2mg/L）下的生物膜细菌灭活率差异均较为显著（p<0.05）。与结晶紫法测得的结果相似，这10组双菌混合生物膜细菌的耐氯性由强至弱分别为：Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Bacillus>Sphingomonas+Acidovorax>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Acidovorax+Microbacterium>Acidovorax+Acinetobacter>Acinetobacter+Microbacterium。4.0Acd+AcnAcd+BacAcd+MicAcn+Mic)3.5Bac+AcnBac+MicSph+AcdSph+Acn/N0Sph+BacSph+Mic(N103.0log2.52.0灭活率1.5细菌1.0生物膜0.50.00.30.612410余氯浓度(mg/L)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图6-5不同余氯浓度对双菌生物膜细菌灭活率Fig.6-5Log10reductionofbacteriafordual-speciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment6.2.3多菌混合生物膜细菌的耐氯性由Acinetobactersp.、Acidovoraxdefluvii、Bacilluscereus、Microbacteriumlaevaniformans和Sphingomonassp.中的全部5种菌或其中4种菌混合共6组混合形成的生物膜经过不同浓度余氯消毒60min后生物膜生物量去除率见图6-6，消毒前的6组混合生物膜的生物量和细菌总数见表6-3。不同浓度的余氯对这6组多菌混合生物膜生物量去除率差异均显著（p<0.05）。除10mg/L余氯对全部5种菌混合生物膜生物量去除率最小外，其余5种余氯浓度均对4种菌缺Microbacteriumlaevaniformans混合生物膜生物量去除率最小。在0.3mg/L、4mg/L和10mg/L的余氯浓度时对4种菌缺Bacilluscereus混合生物膜生物量去-102- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究除率最大，而在0.6mg/L、1mg/L和2mg/L的余氯浓度时对4种菌缺Acinetobactersp.混合生物膜生物量去除率最大。六组多菌混合生物膜生物量去除率基本上都是随着余氯的浓度的升高而升高，在>1mg/L余氯浓度时，6组多菌混合生物膜细菌灭活率均显著性增大（p<0.05）。一般来说，这6组多菌混合生物膜细菌的耐氯性由强至弱分别为：4种菌缺Microbacteriumlaevaniformans混合>全部5种菌混合>4种菌缺Acidovoraxdefluvii混合>4种菌缺Sphingomonassp.混合>4种菌缺Acinetobactersp.混合>4种菌缺Bacilluscereus.混合。100全部5种菌缺Acd缺Acn缺Bac缺Mic缺Sph(%)80去除率60生物量40生物膜200.30.612410余氯浓度(mg/L)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图6-6不同余氯浓度对多菌生物膜生物量去除率Fig.6-6Percentageofbiofilmmassremovalformultispeciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment不同浓度余氯对6组多菌混合形成的生物膜消毒60min后生物膜细菌灭活率见图6-7，消毒前的6组多菌混合生物膜的细菌总数见表6-3。六组多菌混合生物膜细菌灭活率只在4mg/L和10mg/L余氯下差异显著（p<0.05），其它余氯浓度（≤2mg/L）差异均不显著（p>0.05）。全部5种菌混合生物膜细菌的耐氯性最强，10mg/L的余氯对全部5种菌混合生物膜细菌灭活率为1.74-log，4种菌缺Bacilluscereus.混合生物膜细菌的耐氯性最差，10mg/L的余氯对4种菌缺Bacilluscereus.混合生物膜细菌灭活率为2.43-log。六组多菌混合生物-103- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文膜细菌灭活率基本上都是随着余氯的浓度的升高而升高，在4mg/L和10mg/L余氯浓度时对这6组多菌混合生物膜细菌灭活率差异均显著（p<0.05）。其它结果同运用结晶紫法测定的结果相似，这6组多菌混合生物膜细菌的耐氯性由强至弱分别为：全部5种菌混合>4种菌缺Microbacteriumlaevaniformans混合>4种菌缺Acidovoraxdefluvii混合≈4种菌缺Acinetobactersp.混合>4种菌缺Sphingomonassp.混合>4种菌缺Bacilluscereus.混合。表6-3消毒前多种细菌混合生物膜生物量和细菌总数Table6-3Initial(beforedisinfection)biofilmmassandHPCofmultispecies2多种细菌混合生物量（OD570±SD）细菌总数（log10CFU/cm±SD）全部5种菌1.461±0.3886.80±0.31缺Acidovorax0.917±0.2016.85±0.35缺Acinetobacter0.982±0.2186.75±0.29缺Bacillus0.993±0.3476.93±0.24缺Microbacterium1.844±0.5087.15±0.43缺Sphingomonas1.560±0.4476.50±0.313.0全部5种菌缺Acd)缺Acn缺Bac/N02.5缺Mic缺Sph(N10log2.01.5灭活率细菌1.00.5生物膜0.00.30.612410余氯浓度(mg/L)(Acd：Acidovoraxdefluvii；Acn：Acinetobactersp.；Bac：Bacilluscereus；Mic：Microbacteriumlaevaniformans；Sph：Sphingomonassp.)图6-7不同余氯浓度对多菌生物膜细菌灭活率Fig.6-7Log10reductionofbacteriaformultispeciesbiofilmsafterdifferentchlorinetreatment-104- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究6.3生物膜细菌的耐氯机制分析6.3.1单一菌种的耐氯机制由上述分析可知，结晶紫（CV）测定法和平板计数法（HPC）测得的5种菌的耐氯性基本一致。除0.3mg/L的余氯浓度外，其它5种余氯浓度时均是—Bacilluscereus的耐氯性最强。有研究表明，革兰氏阴性（G）细菌的耐氯性++要强于革兰氏阳性（G）细菌，G细菌细胞壁虽厚但组成简单，主要由肽聚糖组成，还有一定数量的磷壁酸，没有外膜，细胞壁上具有对消毒剂的敏感的—+多目标作用位点，而G细菌的胞壁虽然厚度较G细菌薄，但其层次较多，组成相对复杂,胞壁外膜为此类细菌所独有，该膜的化学成分为磷脂、脂多糖和[5,38,39]蛋白质，并提供了对消毒剂的额外屏障。但也有研究认为，革兰氏阳性+—（G）细菌比革兰氏阴性（G）细菌耐氯性强，也与其细胞壁和细胞膜的结构+—+有关，因为G细菌的细胞壁较G细菌厚很多。对于G细菌，有效氯浓度在—0.3-0.5mg/L的消毒剂才有灭菌效果；而对于G细菌，阈值就低了很多，大约[41]+为0.05mg/L。在本研究中并未发现类似的规律，属于G细菌的Bacillus—cereus耐氯性最强，但属于G细菌的Sphingomonassp.耐氯性也很强。鉴于+—各研究者的并未统一，且在本研究中的研究结果G细菌和G细菌均有耐氯性—+强的细菌，因此本文认为在一定程度上G细菌的耐氯性可能会强于G细菌，但这不是细菌耐氯性的主要原因，单一细菌细胞耐氯性的主要原因可能还是某些细菌具有一些特殊的构造，比如说糖被（包括荚膜和黏液层）、芽孢等。研究表明，Sphingomonassp.会向细胞壁外（亦即细胞外）分泌出一层黏性多糖类物[181][39,182]质，这层物质可以称为糖被，当黏性多糖类物质再混杂一些蛋白质、[182,183]核酸类物质和外来的吸附物质，就形成了胞外聚合物（EPS）。以糖被为主要成分的胞外聚合物，它能使细胞更易吸附在材料表面，并可保护细胞免[182,183]受不利环境的干扰。Xue等人利用生物技术的方法构建了Pseudomonas+—aeruginosa细菌的两种突变株（EPS、EPS），研究了EPS的存在对耐氯性的影响，结果表明：EPS的存在显著增加了生物膜细菌对氯的抵抗力，并且认为EPS能增强细菌耐氯性的原因是EPS可以使生物膜的比表面积降低，扩散距离[122]缩短，进而缩减物质的传输效率，使细胞免受氯的伤害。Chen等人研究了从饮用水输送系统中分离出来的Mycobacteriamucogenicum的耐氯性发现，大量地消耗氯并不是细菌耐氯的直接原因，细菌耐氯的主要原因是：菌体及其胞[180]外聚合物（EPS）的结构导致氯很难进入细胞表面和内部层与细胞反应。Sun-105- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文[11,32]和Zhang等人就发现Sphingomonassp.能够在很高浓度的氯下存活，甚至有些Sphingomonassp.的菌株能在4mg/L的余氯消毒240min后的灭活率才为[11]0.03-log。Bacillus属的细菌在其生长发育后期或不利环境条件下会形成芽孢[39,184]，芽孢是生命世界中抗逆性最强的一种构造，在抗热、抗化学消毒剂和[39,185]抗辐射等方面，均十分突出。例如Bacillusatrophaeussubsp.Globigii芽孢[178]在加入70mg/L的余氯10d后，灭活率最多也只能达到3-log。芽孢对消毒剂具较强的抵抗性显然是由于芽孢在结构、化学和生物化学上的特性累积效应[185]造成的。芽孢壁厚而密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质。中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量DPA。内层为芽孢壁，由肽聚糖构成，包裹细胞质和核2+质。芽孢原生质体含有极高的DPA-Ca，在新合成、具有特殊化学构造的外层（皮层和芽孢衣，芽孢外壁）中也有这种物质。芽孢皮层含有一种与营养细胞壁组成不同的特殊肽聚糖，即使是初看起来对芽孢抗性发挥不了职能作用的芽孢皮层也对芽孢抗性发挥着重要作用。例如，芽孢皮层直接影响芽孢内层渗透压和离子强度，使皮层充分的膨胀和芽孢内层高度失水，从而赋予了芽孢极强[185]的抗性。[130]借鉴Szabo等人的研究方法，测定了消毒前后的Bacilluscereus芽孢数目和Bacilluscereus营养细胞+芽孢的数目，并分析了芽孢的比例，其研究结果见图6-8。当加入0.3mg/L的余氯时，芽孢的数目和比例并没有显著地增加（p>0.05）；加入0.6mg/L的余氯时，芽孢数开始显著增加（p<0.05）；加入1mg/L的余氯时，芽孢的数目和比例均显著增加（p<0.05）；2mg/L的余氯以后，芽孢的数目逐渐下降，而芽孢的比例却逐渐增加；至10mg/L的余氯，芽孢的数42目逐渐下降至3.1×10CFU/cm（仍显著大于消毒前和0.3mg/L余氯的芽孢数），而芽孢的比例基本上是100%（105%，由测量误差造成）。在0.3mg/L的余氯浓度时，Bacilluscereus生物膜对氯也较为敏感。这是因为消毒前在R2A液体培养基培养形成的Bacilluscereus生物膜多数为营养细胞，Bacilluscereus营养细胞对氯较为敏感造成的，之后随着余氯浓度的升高，Bacilluscereus的营养细胞渐渐转化为芽孢，耐氯性增大。研究表明，Bacillus耐氯性很强，是因为Bacillus生物膜中大多数细胞为芽[179][178]孢，即使加入75mg/L的余氯10d后，灭活率最多也只能达到3-log；而Bacillus芽孢通过100%胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB），25ºCpH7.3条件下诱导培养后（至少99.3%的芽孢变为营养细胞），加入5mg/L的余氯4d后就可以基本去除Bacillus，灭活率至少可达3-log，而不经TSB培养基诱导的[130]Bacillus芽孢加入5mg/L的余氯20d的灭活率也不到0.1-log。在本研究中，-106- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究Bacilluscereus在消毒前芽孢的比例只有0.02%，绝大部分为营养细胞，随着氯浓度的增加芽孢的数目和比例都呈增加趋势，大部分的营养细胞都被氯杀灭，部分营养细胞变为芽孢，但由于每一营养细胞内仅形成一个芽孢，芽孢也没有繁殖功能，随着氯浓度的升高，Bacilluscereus营养细胞的杀灭率大大增加，变为芽孢的细菌也就会减少，因此芽孢数目增加到一定程度呈下降趋势。由图6-4可知，0.6mg/L和1mg/L的余氯是产生芽孢的最佳浓度，而此时正是大多数水厂的出厂水余氯浓度。因此，Bacillussp.在水厂消毒时基本不受控制，相反在很大程度上提高了芽孢数目和比例，也给供水管网中的Bacillussp.的控制带来了更为严峻的形势。6芽孢数120芽孢比率)52904(CFU/cm(%)1060例Log3比数芽孢30芽孢2100246810余氯浓度(mg/L)图6-8Bacilluscereus生物膜在不同余氯浓度的芽孢数和芽孢比例Fig.6-8SporecountsandProportionsinBacilluscereusbiofilmafterdifferentchlorinetreatment6.3.2细菌种群的协作与竞争在本研究中，由于Microbacteriumlaevaniformans与其它4种细菌多为中性或竞争关系，因此与Microbacteriumlaevaniformans混合的生物膜细菌的耐氯性也会受到一定程度的抑制。由于Bacilluscereus和Sphingomonassp.单一菌种生物膜细菌的耐氯性本身就很强，因此在加氯受到环境胁迫后，Bacilluscereus和Sphingomonassp.这两种菌仍然保持着巨大的竞争优势，有很多由这两种菌之一与其它3种菌之一混合的生物膜细菌的耐氯性就很难再超越这两种单一菌种。-107- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文Leriche等人发现由Kocuriasp.、Brevibacteriumlinens和Staphylococcussciuri三种菌两两混合的混合生物膜均比单一菌种生物膜具更高的耐氯性，并认为这可能是由在混合生物膜中种间协作，使附着在基质上的种群密度和胞外[186]蛋白的分泌的增加造成的。Kara等人也发现Streptococcusmutans和[187]Veillonellaparvula混合生物膜比单一菌种生物膜对消毒剂更不敏感。然而，这并不是普遍现象。Behnke等人在发现Burkholderiacepacia和Pseudomonasaeruginosa在恒化器（chemostat）中共培养后加氯后明显比单一菌种的存活率要低，并发现这两种菌混合培养时Pseudomonasaeruginosa的生长明显受到抑[136]制。Lindsay等人也发现在Pseudomonasfluorescens和Bacilluscereus混合[188]生物膜中，Bacilluscereus对二氧化氯等消毒剂敏感性增加。这表明不同细菌种群的相互作用不同，也会影响对消毒剂的抵抗力。当两种细菌相互协作，混合生物膜的生物量和细菌总数就增加，相应地也会通过提高负责氧化应激的活性基因的转录使细胞与细胞的信号转导，改变EPS的组成和粘度，影响生物[189]膜结构和不同菌株的空间分布来提高混合生物膜细菌的耐氯性；而当两种细菌处于竞争关系，这就会导致混合生物膜的生物量和细菌总数减少，两种细菌细胞相互竞争，使不同的物种争相“堕落”，两败俱伤，从而使两种生物的自[95]身适合度下降，使更适合环境的物种存活下来。6.3.3多物种生物膜细菌的群体效应在本研究中，绝大数混合生物膜细菌的耐氯性比单一菌种生物膜细菌的耐氯性大5~250倍。而由第5章分析可知，多物种生物膜的生物量或细菌总数一般比对应的单物种的生物量和细菌总数之和大1~4倍。研究表明，在大多数情况下，与单物种的生物膜相比，多物种的混合生物膜显著提高了对消毒剂的抵[5,68,128,186]抗力。Schwering等人发现在多物种的混合生物膜中的细菌耐氯性大[128]量增加，比相对应的单一菌种生物膜细菌的耐氯性增加50~300倍。有研究者认为，多物种生物膜的抗性增加有部分原因是因为相对于单物种生物膜的更多的生物膜细胞群体密度。生物膜细胞数目的增多可以增加消毒剂渗入生物膜基质的阻力，改变细胞的微环境，同时可以减缓微生物的生长，并获得细胞表[5,190]型抗性，具持续性抗性细胞的存在。另外，在多物种生物膜的相互作用也[68,188,191]会影响微生物附着的能力和对消毒剂的敏感性或抗性。多物种生物膜可通过提高负责氧化应激的活性基因的转录使细胞与细胞的信号转导，改变EPS的组成和粘度，影响生物膜结构和不同菌株的空间分布来提高了多物种生物膜细菌的耐氯性。这些群体感应诱导机制使细菌以合作的方式对一些诸如氧-108- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究[189]化胁迫（消毒剂或杀菌剂）的不利环境。在本研究中，Bacilluscereus.和Microbacteriumlaevaniformans对整个混合生物膜的抗性贡献最大，Bacilluscereus.存在时，混合生物膜细菌的耐氯性提高程度大，而Microbacteriumlaevaniformans存在时，混合生物膜细菌的耐氯性显著减小，显著抑制了混合生物膜细菌的耐氯性。另外，Acinetobactersp.和Sphingomonassp.存在时，混合生物膜细菌的耐氯性也有一定程度的提高。Shakeri等人认为多物种生物膜比单一物种的生物膜的具较高的抗性，抗性提高的程度要取决于该混合生物膜中的细菌种类和每种细菌在混合生物膜的作用，[190]往往可能由于其中一个或两个关键的菌株决定整个生物膜的抗性。在整个多物种的混合生物膜中，因某些细菌的抗性酶分泌增强，因而会产生协同耐氯作[12]用，这时那些不产生抗性酶的细菌也会从中受益，从而整个混合生物膜细菌的耐氯性就会增加。6.4供水管网中耐氯菌的控制策略在供水管网中最为关心的微生物问题便是减少病原微生物的污染。如前面几章分析，耐氯菌的生长由于供水管网中的物理、化学、运行条件以及微生物[2]生态学等复杂的交互作用，使得在供水管网中控制耐氯菌的生长是很困难的[2,42]。一方面，自来水流经的管线长度可达数十公里乃至数百公里，滞留时间[78]可达数小时至数天，管材和水力条件会随着供水管网的延伸发生明显的变化。[14]无论管道材质如何，管道内壁都会生长生物膜。另一方面，耐氯菌的生长是一个复杂的过程，受许多可变的因素交互影响，如温度、季节营养、水质条件、[1,42]水龄、消毒剂类型及浓度等。[192,193]在水厂有三种方法可以用于控制供水管网中耐氯菌的生长：（1）使出厂水的微生物营养物更少，生物稳定性更好；（2）加更多的消毒剂使管网中维持更高浓度的消毒剂；（3）更换消毒剂。在水厂通过生产和供应生物稳定的[194]水可以限制营养控制任何种类的细菌的生长。这种方法的优点是不会形成消[42]毒副产物，对饮用水的口感和气味也没有影响。当然，这种方法对源水和水处理工艺要求很高，也势必会增加净水厂的投资和生产成本。由于条件致病菌均为异养菌，因此可以推测可同化有机碳（AOC）是耐氯菌的增殖的限制因子[1]之一，AOC是指能够被量化的特定菌株或混合菌群利用成为生物量的有机碳[195]部分。一般来说，在供水管网中，当AOC<50μg/L，才会有效地限制异养[196]菌和总大肠杆菌的再生长。然而有研究表明，在极低的AOC碳（＜5μg/L的乙酸碳）水平下仍然发现了较高浓度的细菌总数（HPC或者16SrRNA基因-109- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文[1]拷贝）。充分的证据表明，单独控制AOC的水平并不能控制条件致病菌的生[1]长。在大多数供水管网中，保持一定消毒剂是抑制管网微生物生长的最普遍的策略。细菌的耐氯性是一个复杂的渐进性过程，为防止生物膜中的细菌对消毒剂亚致死浓度的渐进性的适应，可以大幅地提高消毒剂的浓度直接将细菌杀死。然而这种方法并不能保证全部杀死生物膜中的细菌，而且代价也是昂贵的，并[12]且也不环保。在供水管网中维持较高浓度的消毒剂，会导致消毒副产物的问[42]题以及口感和气味不适等问题。另一个更重要的限制是会在供水管网中由于生物膜或颗粒物的保护会产生大量的耐氯菌，这意味着，在供水管网中，这些耐氯菌可能不会受到氯消毒剂的杀灭作用，当有可利用的营养物时，这些耐氯[10,121]菌将会繁殖和再生长。在本文研究中，添加较高浓度的余氯（1~4.2mg/L）也并不足以控制耐氯菌特别是耐氯致病菌的生长。[193]更换消毒剂已经被用作一种策略来控制供水系统中机会致病菌。在两个实际的供水管网中从氯消毒剂更换为氯胺消毒剂被证明是控制军团菌[193,197]（Legionella）的有效方法。然而，有证据表明氯胺能增加结核分枝杆菌[193,198]（mycobacteria）的发病率。在实验室培养的嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）、鸟分支杆菌（Mycobacteriaavium）等细胞，氯和氯胺的消毒动[199,200]力学、有效剂量、细胞的响应机制，都有所不同，这表明在选择氯和氯胺消毒剂时需要认真权衡。因此，在供水管网中的消毒干预措施应该考虑更广泛的微生物菌群。二氧化氯是一种替代消毒剂已被证明有效减少军团菌[201,202]（Legionella）和芽孢杆菌（Bacillusglobigii）的污染。然而，二氧化氯[203]消毒剂在腐蚀的管道中会发生快速的衰减，同时也可能会导致管道破裂泄露。在供水管网中，细菌在生物膜中保护作用（扩散/反应限制）是耐氯菌的最主要的耐氯机制。对生物膜基质去除或破坏可以有效地改善细菌的消毒效果。水力剪切作用能够去除生物膜通过破坏胞外聚合物，从而使消毒剂更容易地进[12]入到微生物细胞的表面。针对这种污染，可以对有问题的供水管网进行定期冲洗，为了提高冲洗效果，可以先添加一定浓度的消毒剂再进行冲洗，这也是[12,204,205]一种减少微生物的生长和改善水质的有效方法。针对一些供水区域经常发生微生物严重超标的情况，则有可能是该处管道发生泄漏，供水管网之外的污染源进入到管网造成的，这个时候就得考虑更换管道。在本研究中，将管材与可能的耐氯菌的潜在联系作了一个详细的探讨，供水管网中，管材会影响生物膜的附着和生长，PE等塑料管材会释放大量的可溶性有机碳（DOC）和磷到水里，易腐蚀的铁基管材则会释放铁元素，这些均是-110- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究微生物可利用的营养，同时有些管材可以通过中和消毒剂的浓度来促进微生物[79,149]的生长。在管壁上的松散沉积物和生物膜也是微生物可利用营养的主要[204]来源，去除这些沉积物也可以有效地减少微生物的生长。另外必须指出的是，管材某些物质的释放，如铜管中的铜离子释放，在一定程度上可以降低生物膜[79]的生长，这是因为铜离子对微生物的生长有抑制作用，但在本研究中发现，这种抑制作用会因为铜管的腐蚀而减弱，并且附着到铜管的表面上的耐氯菌也加速了铜的腐蚀，使生物膜中的耐氯菌水平高于不锈钢（STS）管材。这是因为铜和消毒剂反应消耗大量的氯，耐氯菌种群已适应或已经选择生存在铜表面[149]上。不锈钢是一种耐腐蚀的金属材料，当暴露在空气和水界面时能够瞬间形[151]成一个薄的、耐腐蚀的铬氧化物膜。在本研究中，304不锈钢管材生物膜附着的耐氯菌数目和种群均较少，在保障水质安全方面，比其它4种管材（铸铁、水泥砂浆、铜、PE）具有优势。因此，在供水管网中采用生物稳定的管材在一定程度上可以减少主体水和生物膜中微生物的生长。在第5章和第6章探讨了耐氯菌菌群的种间作用对供水管网生物膜的形成及其细菌耐氯性的影响，由于Bacilluscereus和Microbacteriumlaevaniformans对整个混合生物膜细菌的耐氯性贡献最大。因此在实际供水中可以通过控制Bacilluscereus和Microbacteriumlaevaniformans这两种菌的生长来改变供水管网生物膜细菌的耐氯性，进而使供水管网生物膜的种群密度减少。有研究表明，由于生物膜的种间协作关系，Acinetobactersp.和Pseudomonasputida混合的[166]双菌生物膜比原先的单一细菌生物膜更稳定、生物量更多。从饮用水生物膜中分离出来的Acidovoraxspp.和Sphingomonasspp.对Legionellapneumophila菌[168]有竞争作用，使得Legionellapneumophila的可培养性显著下降。在本文接下来的研究中应该探讨由于非致病性的耐氯菌菌群的竞争作用而导致耐氯致病菌群数量的下降的控制作用；并且必须了解供水管网的环境因素（管材、温度、水龄、化学水质）等相关的参数，以及由环境因素相互作用形成的微生物群落结构，并鉴定区分出致病菌和非致病菌，对致病菌加以控制，必要时可以考虑接种非致病菌以抑制致病菌的生长，但这必须考虑公众接受的接种剂量，以促[1]进良性的、健康的供水管网微生物生物膜的形成。在本研究中，Bacillussp.属的细菌并未在水泥砂浆管材上发现。其它研究者也有类似的发现，Bacillussp.属的细菌的芽孢数目很低，比铸铁管上的Bacillussp.属的细菌数目要少，更容易被灭活，并且余氯的存在能降低水泥砂[130,157,178]浆管上之前附着的Bacillussp.属的细菌的存活率。而对于Microbacteriumsp.属的细菌，特别是对于非致病性的Microbacteriumsp.属的-111- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文细菌，可以不加以控制。Lee等人在韩国的“N”市的供水管网中B3采样点也[50]发现了大量的Microbacteriumsp.属的细菌，针对这种现象，Lee等人并没有解释具体的原因，还有待于进一步的研究。此外，Sun等人在研究耐氯菌SphingomonasTS001对UV非常敏感，402[11]mJ/cm的UV就能达3-log的杀灭率。因此，可以通过在用户终端增加膜过滤或者是终端消毒（紫外）装置，这种处理方法可以有效地减少主体水中的微[9,14]生物，并且比起在水厂进行膜处理的净水工艺或其它深度处理工艺，也更[14]加有效，因此有很大的应用前景。综上所述，更深层次地了解出厂水水处理过程，供水管网中主体水、生物膜的微生物的数量和种群多样性等的影响因素，供水管网中的生物膜形成过程、菌群的相互作用和耐氯机制等问题，将会使供水管网中微生物水质的管理与控制更加有效。6.5本章小结本章在第5章的基础上针对上述不同供水管网生物膜细菌加入不同浓度的余氯进行消毒，研究了不同生物膜细菌的耐氯性，并从耐氯菌个体、种间作用和群体效应方面分析了不同生物膜细菌的耐氯机制，得出如下结论：（1）从供水管网分离出的5种耐氯菌及不同双菌混合的生物膜细菌的耐氯性差异较大。其中，5种耐氯菌的耐氯性由强至弱分别为：Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii>Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp.。双菌混合生物膜细菌的耐氯性由强至弱分别为：Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Bacillus>Sphingomonas+Acidovorax>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Acidovorax+Microbacterium>Acidovorax+Acinetobacter>Acinetobacter+Microbacterium。与单一菌种和双菌的生物膜相比，多菌的混合生物膜显著提高了耐氯性，差异性也进一步减小。—+（2）在一定程度上G细菌的耐氯性可能会强于G细菌，但这不是细菌耐氯性的主要原因，单一细菌细胞耐氯性的主要原因可能还是某些细菌具有一些特殊的构造，比如说糖被（包括荚膜和黏液层）、芽孢等。Bacillus耐氯性最强，是因为产生了芽孢，0.6mg/L和1mg/L的余氯是产生芽孢的最佳浓度。Sphingomonassp.耐氯性也比较强，是因为该细菌会向细胞壁外（亦即细胞外）分泌出一层黏性多糖类物质。由于Microbacteriumlaevaniformans与其它4种细菌多为中性或竞争关系，因此与Microbacteriumlaevaniformans混合的生物膜细-112- 第6章供水管网生物膜细菌的耐氯性和耐氯机制研究菌的耐氯性也会受到一定程度的抑制。由于Bacilluscereus和Sphingomonassp.单一菌种生物膜细菌的耐氯性本身就很强，因此在加氯受到环境胁迫后，Bacilluscereus和Sphingomonassp.这两种菌仍然保持着巨大的竞争优势，有很多由这两种菌之一与其它3种菌之一混合的生物膜细菌的耐氯性就很难再超越这两种单一菌种。多菌混合生物膜细菌的耐氯性显著提高，Bacilluscereus.和Microbacteriumlaevaniformans对整个多菌混合生物膜的耐受性贡献最大，Bacilluscereus.存在时，混合生物膜细菌的耐氯性提高程度大，而Microbacteriumlaevaniformans存在时，混合生物膜细菌的耐氯性显著减小，显著抑制了混合生物膜细菌的耐氯性。（3）对供水管网中耐氯菌的控制，应建立在深层次地了解出厂水水处理过程，供水管网中主体水、生物膜的微生物的数量和种群多样性等的影响因素，供水管网中的生物膜形成过程、菌群的相互作用和耐氯机制等问题的基础上再制定相应的措施。-113- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文结论本文对供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制进行研究，研究了实际供水管网的耐氯菌群的数量和种群多样性分布，研究了管材及流速对供水管网中的耐氯菌的生长的影响，并分析了不同生物膜的形成及菌群作用关系，最后比较了不同生物膜细菌的耐氯性及机制。本论文具体结论如下：（1）耐氯菌在该市供水管网中普遍存在。生物膜中耐氯菌数目至少高于主体水的耐氯菌数目1个数量级。在水厂清水池池壁的生物膜细菌多样性较低，但在供水管网生物膜中多样性会逐渐增加，在树状管网末端细菌多样性也会显著增加。在供水管网中变形菌门的α变形菌纲和γ变形菌纲为优势菌纲。在供水管网中前端耐氯菌为优势菌属，包括Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Sphingobium、Sphingomonas、Acidovorax和Rhodopseudomonas等。在供水管网末端非耐氯性菌占据优势地位，细菌种群多样性也更为丰富，还发现一定比例的硝化细菌（Nitrosomonadaceae和Nitrospira）。（2）在大于>0.97mg/L的余氯浓度下，管材对耐氯菌生长的影响要大于余氯和流速。稳定余氯浓度下，五种管材稳定生长的生物膜中耐氯菌细胞总数大小顺序为：铸铁>水泥砂浆>铜>PE>不锈钢。α变形菌纲和γ变形菌纲在所有管材生物膜中均存在且为优势菌群，Sphingomonassp.和Pseudomonadaceae细菌在所有5种管材中均大量存在；Bacillussp.和Methylobacteriaceae细菌也经常见于铜、PE、不锈钢和铸铁管道生物膜中。余氯的升高，耐氯菌的生长并没有完全受到抑制。不同流速中，生物膜细菌总数先随着流速的增大而略微增大，进一步加大流速时生物膜细菌总数则显著减少。（3）五种耐氯菌及其双菌混合在培养初期，生物膜形成能力均较弱，但如果延长培养时间或者多菌混合（4种以上细菌混合），生物膜形成能力均较强。在双菌混合生物膜形成过程中，Acidovorax+Acinetobacter，Sphingomonas+Bacillus，Sphingomonas+Acidovorax和Acidovorax+Microbacterium表现为协作关系；Acinetobacter+Microbacterium，Sphingomonas+Microbacterium和Sphingomonas+Acinetobacter表现为竞争关系，Acidovorax+Bacillus，Bacillus+Acinetobacter和Bacillus+Microbacterium表现为中性关系。在多菌混合生物膜形成过程中，Microbacteriumlaevaniformans对5种菌混合生物膜具有弱的抑制作用；Acinetobactersp.，Acidovoraxdefluvii和Bacilluscereus对5种菌混合生物膜具有弱的促进作用；Sphingomonassp.对5种菌混合生物膜先表现出弱的促-114- 结论进作用，后表现出为弱的抑制作用。（4）五种耐氯菌及不同双菌混合的生物膜细菌的耐氯性差异较大。其中，5种耐氯菌的耐氯性由强至弱分别为：Bacilluscereus>Sphingomonassp.>Acidovoraxdefluvii>Microbacteriumlaevaniformans>Acinetobactersp.。双菌混合生物膜细菌的耐氯性由强至弱分别为：Sphingomonas+Bacillus>Acidovorax+Bacillus>Sphingomonas+Acidovorax>Sphingomonas+Microbacterium>Sphingomonas+Acinetobacter>Bacillus+Microbacterium>Bacillus+Acinetobacter>Acidovorax+Microbacterium>Acidovorax+Acinetobacter>Acinetobacter+Microbacterium。与单一菌种和双菌的生物膜相比，多菌的混合生物膜显著提高了耐氯性，差异性也进一步减小。（5）单一菌种与混合菌种的生物膜的耐氯机制有所不同。Bacillus耐氯性最强，是因为产生了芽孢，0.6mg/L和1mg/L的余氯是产生芽孢的最佳浓度。在双菌混合生物膜中，由于Microbacteriumlaevaniformans与其它4种细菌多为中性或竞争关系，因此与Microbacteriumlaevaniformans混合的生物膜细菌的耐氯性也会受到一定程度的抑制。在多菌混合生物膜中，Bacilluscereus和Microbacteriumlaevaniformans对整个混合生物膜的耐受性贡献最大；Bacilluscereus存在时，混合生物膜细菌的耐氯性提高程度大；而Microbacteriumlaevaniformans存在时，混合生物膜细菌的耐氯性显著减小。本文主要创新点如下：（1）揭示了耐氯菌群在供水管网中的分布特征，并对耐氯菌的数量和种群多样性进行了详细的研究；（2）发现了在>1mg/L余氯条件下管材对耐氯菌的数量和种群多样性的显著影响；（3）揭示了供水管网耐氯菌的种群多样性及其相互作用对生物膜形成的影响，进而由实验分析了在供水管网耐氯菌的种群多样性及其相互作用前提下耐氯菌（群）耐氯性差异的机制。对今后研究工作的展望：（1）对实际供水系统，在水厂进行处理工艺的全流程采样，设置更多的管网采样点，并分季节进行采样，更全面广泛地研究“源头到龙头”的供水系统的耐氯菌的分布和种群多样性。（2）在供水管网中，研究物理（紫外线、超声）+化学（消毒剂）组合消毒方式控制供水管网耐氯菌特别是耐氯致病菌的方法，探索利用耐氯菌群的种间关系对耐氯致病菌进行生物控制的方法，提高供水管网的水质安全。-115- 哈尔滨工业大学工学博士学位论文参考文献[1]WangH,EdwardsMA,FalkinhamJO,etal.Probioticapproachtopathogencontrolinpremiseplumbingsystems?Areview[J].EnvironmentalScience&Technology,2013,47(18):10117-10128.[2]BerryD,XiCW,RaskinL.Microbialecologyofdrinkingwaterdistributionsystems[J].CurrentOpinioninBiotechnology,2006,17(3):297-302.[3][日]金之光美,编著.刘云俊译.供水系统病原微生物对策[M].北京:中国建筑工业出版社,2011.[4]曲久辉.饮用水安全保障技术原理[M].北京:科学出版社,2007.[5]SimoesLC,SimoesM,VieiraMJ.InfluenceoftheDiversityofBacterialIsolatesfromDrinkingWateronResistanceofBiofilmstoDisinfection[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2010,76(19):6673-6679.[6]LangsrudS,SidhuMS,HeirE,etal.Bacterialdisinfectantresistance-achallengeforthefoodindustry[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2003,51(4):283-290.[7]ZhuZ,WuC,ZhongD,etal.Effectsofpipematerialsonchlorine-resistantbiofilmformationunderlong-termhighchlorinelevel[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology,2014,173(6):1564-1578.[8]LynchF,TomlinsonS,PalomboEA,etal.Anepifluorescence-basedevaluationoftheeffectsofshort-termparticleassociationonthechlorinationofsurfacewaterbacteria[J].WaterResearch,2014,63:199-208.[9]LehtolaMJ,MiettinenIT,LampolaT,etal.Pipelinematerialsmodifytheeffectivenessofdisinfectantsindrinkingwaterdistributionsystems[J].WaterResearch,2005,39(10):1962-1971.[10]RidgwayH,OlsonB.Chlorineresistancepatternsofbacteriafromtwodrinkingwaterdistributionsystems[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1982,44(4):972-987.[11]SunW,LiuW,CuiL,etal.Characterizationandidentificationofachlorine-resistantbacterium,SphingomonasTS001,fromamodeldrinkingwaterdistributionsystem[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2013,(458-460):169-175.-116- 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哈尔滨工业大学工学博士学位论文biomassrecoveredbyflushinganoperationaldrinkingwaterdistributionsystem[J].WaterResearch,2014,54:100-114.-134- 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果攻读博士学位期间发表的论文及其它成果（一）发表的学术论文[1]ZhuZebing,WuChenguang,ZhongDan,YuanYixing,ShanLili,ZhangJie.Effectsofpipematerialsonchlorine-resistantbiofilmformationunderlong-termhighchlorinelevel.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2014,173(6):1564-1578.(SCI，对应论文4.1~4.2节)[2]祝泽兵，吴晨光，钟丹，袁一星，张杰.管材和流速对供水管道生物膜形成的影响.哈尔滨工业大学学报,2014,46(10):31-36.(EI，对应论文4.1节、4.4节)[3]祝泽兵，吴晨光，钟丹，袁一星，张杰.寒区湖库型水源供水系统的耐氯菌的生长.哈尔滨工业大学学报,2015,47(8).(EI源，已接收，对应论文3.1~3.2节)[4]ZhuZebing,WuChenguang,ZhongDan,YuanYixing,ShanLili,ZhangJie.Theeffectsofflushingonwaterqualityandbiofilmbiomassindifferentdailyflowpatternsofdistributionsystem.CMTEE2014:330-333.(EI和ISTP，对应论文6.4节部分内容)（二）参与的科研项目及获奖情况[1]基于分子生物学的供水管网中耐氯菌的鉴别及其多样性研究,国家自然科学基金项目，课题编号：51108123.[2]供水管网优化维护与更新改造技术研究，国家水体污染控制与治理科技重大专项，课题编号：2012ZX07408-002-004-002.-135- 哈尔滨工业大学学位论文原创性声明及使用授权说明哈尔滨工业大学学位论文原创性声明及使用权限学位论文原创性声明本人郑重声明：此处所提交的学位论文《供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制研究》，是本人在导师指导下，在哈尔滨工业大学攻读学位期间独立进行研究工作所取得的成果，且学位论文中除已标注引用文献的部分外不包含他人完成或已发表的研究成果。对本学位论文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明。作者签名：学位论文使用权限学位论文是研究生在哈尔滨工业大学攻读学位期间完成的成果，知识产权归属哈尔滨工业大学。学位论文的使用权限如下：（1）学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文，并向国家图书馆报送学位论文；（2）学校可以将学位论文部分或全部内容编入有关数据库进行检索和提供相应阅览服务；（3）研究生毕业后发表与此学位论文研究成果相关的学术论文和其他成果时，应征得导师同意，且第一署名单位为哈尔滨工业大学。保密论文在保密期内遵守有关保密规定，解密后适用于此使用权限规定。本人知悉学位论文的使用权限，并将遵守有关规定。作者签名：导师签名：-136- 致谢致谢行文至此，我的毕业论文已接近尾声；岁月如梭，我的学生时代也即将敲响结束的钟声。在我即将离开哈工大的时候，不经意间发现自己已经深深地爱上了这个学校、这座城市。感谢哈工大，感谢哈尔滨，给了我人生中最重要的十年。回望过去，那人，那事，犹如一阵阵涟漪激荡心田。在攻读博士学位期间，有幸师从张杰院士。衷心感谢导师对我的指导与教诲。老师的大家气度、深邃思维、广阔视野是我仰慕且致力学习的楷模！感谢我的导师袁一星教授对我的论文悉心指导。从论文的选题到研究过程中问题的讨论直至论文撰写、修改定稿等，都凝聚了老师无数的心血。在我博士学习期间，老师始终密切关注着我的学习、生活，给我启发，给我动力，给我帮助。导师渊博的知识、敏锐的洞察力、深邃的科学思维、严谨的治学态度、高尚的品格，以及对事业的执着追求、对学生的徐徐善诱都让我永志不忘，深刻影响着我日后的工作与生活。感谢吴晨光副教授和钟丹副教授对我学业、生活、科研和论文写作上无私的指导与帮助。感谢崔福义、李相坤、崔崇威、邱微、赵明、赫俊国、南军、时文歆、杨基先、李建政、王爱杰等教授对我课题的指导。在此向各位恩师致以最诚挚的谢意，衷心地祝愿您们身体健康，家庭幸福！感谢李阳青师弟、李百灵师妹等课题组的同门在实验等方面提供的帮助。感谢博士班的同学们，与他们在科研、生活中的相互交流让我受益良多。特别感谢我的妻子单莉莉博士，她承担了我在博士期间的所有焦躁和烦恼。感谢她对我的理解、支持、耐心和宽容。最后，由衷地感谢我的父母多年来对我学业的理解和支持！因为我的求学之路让父母呕心沥血，父母始终无怨无悔的支持着我的求学之路。多年的历练之旅，虽然痛，但快乐着，因了大家的支持，才会一路走来。当我为博士论文最终划上一个句号时，新的人生之旅即将开始。在未来的路上，我将秉承“规格严格，功夫到家”的工大校训，奋力前行！祝泽兵二零一五年六月于哈尔滨-137- 个人简历个人简历1983年12月20日出生于江西省上饶市。2003年9月考入东北林业大学生命科学学院生物工程专业，2007年7月本科毕业并获得工学学士学位。2007年9月~2010年7月在东北林业大学林学院林木遗传育种学科学习并获得农学硕士学位。2010年9月至今在哈尔滨工业大学市政环境工程学院市政工程学科攻读博士学位。-138-'