供水管网中耐氯菌种群多样性及耐氯机制研究 78页

'硕士学位论文供水管网中耐氯菌种群多样性及耐氯机制研究COMMUNITYDIVERSITYANDRESISTENCEMECHANISMOFTHECHLORINE-RESISTANTBACTERIAINDRINKINGWATERDISTRIBUTIONSYSTEM李百玲哈尔滨工业大学2015年6月 国内图书分类号：TU991.2学校代码：10213国际图书分类号：628.1密级：公开工程硕士学位论文供水管网中耐氯菌种群多样性及耐氯机制研究硕士研究生：李百玲导师：钟丹副教授申请学位：工程硕士学科：市政工程所在单位：市政环境工程学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学 ClassifiedIndex:TU991.2U.D.C:628.1DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringCOMMUNITYDIVERSITYANDRESISTENCEMECHANISMOFTHECHLORINE-RESISTANTBACTERIAINDRINKINGWATERDISTRIBUTIONSYSTEMCandidate：LIBailingSupervisor：Prof.ZHONGdanAcademicDegreeAppliedfor：MasterofEngineeringSpeciality：MunicipalEngineeringAffiliation：SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineeringDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文摘要饮用水的微生物安全是饮用水水质安全的重要内容之一，但是在供水管网中存活着对氯消毒剂有较高耐受性的“耐氯菌”（chlorine-resistantbacterium），给饮用水水质安全带来威胁。本文从分子生物学角度出发，对供水管网中的主体水与生物膜进行研究，分析供水管网中耐氯菌种群分布及种群多样性，并对筛选出的耐氯菌的耐氯特性及耐氯机制作进一步研究与分析。加氯前后微生物种群结构发生很大变化。加氯前微生物γ-变形菌纲占优势，加氯后（清水池）β-变形菌纲占优势；加氯前后的优势菌属分别为假单胞菌属与食酸菌属（清水池）。管网始端（清水池）β-变形菌纲食酸菌属（Acidovorax）为优势菌属，管网中段α-变形菌纲鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）为优势菌属，管网末梢β-变形菌纲占优势，假单胞菌属（Pseudomonas）为优势菌属。整个实际管网中变形菌门占优势，其中属于α-变形菌纲、β-变形菌纲与γ-变形菌纲的耐氯菌比重分别为52.6%，36.8%，10.6%。主体水中α-变形菌纲鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）为优势菌属，管壁生物膜中鞘脂单胞菌属（Sphingomonas、Sphingopyxis）、短波单胞菌属（Brevundimonas）与食酸菌属（Acidovorax）为优势菌属。对供水管网而言，管网始端与中段耐氯菌的细菌群落结构组成相差不大，管网始端、中段与末梢处耐氯菌的细菌群落结构组成存在较大差异。供水管网中耐氯菌生物多样性依次为管网始端<管网中途<管网末梢。针对筛选出的耐氯菌研究其耐氯特性，发现鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）耐氯性较好，假单胞菌（Pseudomonas）耐氯性较差。耐氯菌存在的情况下，氯消毒过程中pH基本不变，氯衰减与细菌的菌液浓度有关，与温度的关系不大。最后，本文研究了细菌自身特点对耐氯特性的影响。研究发现：三株耐氯菌都具有疏水性，可以阻止亲水的氯消毒剂进入细胞内；三株耐氯菌都具有一定的吸附特性，可以吸附在管道内壁形成生物膜从而降低消毒效果；食酸菌属的饱和脂肪酸含量相对含量较高，屏障功能较强，从而具有较好的耐氯性。关键词：供水管网；生物多样性；耐氯菌；耐氯机制-I- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文AbstractThemicrobialsafetyisoneoftheimportantcontentsofdrinkingwaterqualityandsafety.However,bacteriumchlorine-resistant,whichhasahightolerancetochlorineindrinkingwaterdistributionsystem，isathreattothedrinkingwaterquality.FromtheperspectiveofMicrobiology,westudyonthewaterandbiofilminwatersupplypipeline.Thepopulationdiversityofchlorine-resistantbacteriuminwatersupplynetworkwereanalyzed.Andthenwestudiedthedisinfectioncharacteristicsofseveralstrainsofchlorine-resistantbacteriaisolatedfromrealdistributionsystems,exploredthemechanismofdisinfectionofthebacteria.Greatchangesinmicrobialcommunitystructurebeforeandafterchlorinationofwater.Beforeaddingchlorinedisinfectant,microbialmainlybelongtogammaproteobacteriamicroorganismsandafteraddingchlorinedisinfectant,microbialmainlybelongtoBetaProteobacteria.Beforeandafteraddingchlorinedisinfectant,thedominantbacteriawerePseudomonassp.andAcidovoraxsp.respectively.ThedominantbacteriainthebeginningofthewatersupplynetworkareAcidovoraxsp.whichbelongtoBetaProteobacteria.ThedominantbacteriainthemiddleofthewatersupplynetworkareSphingomonassp.whichbelongtoAlphaProteobacteria.ThedominantbacteriaintheterminaofthewatersupplynetworkarePseudomonassp.whichbelongtoBetaProteobacteria.TheProteobacteriaisthedominantbacteriainwholewatersupply,andtheproportionofchlorine-resistantbacteriawhichbelongtoAlphaProteobacteria,BetaProteobacteriaandgammaproteobacteriais52.6%,36.8%and10.6%.Sphingomonassp.whichbelongstoAlphaProteobacteriaisdominantbacteriainthewaterandSphingomonassp.,Sphingopyxissp.,Brevundimonassp.,Acidovoraxsp.aredominantbacteriainthebiofilm.Forthewatersupplypipenetwork,thedifferenceofthebacterialcommunitystructurebetweenthebeginningandthemiddleofthepipenetworkwaslittle,buttherewasabigdifferenceinthestructureofbacteriacommunityinthemiddleanddistalpartoftheterminal.Thebiologicaldiversityofresistancetochlorideinwatersupplynetworkare:thebeginning管网中途>管网始端，即微生物多样性大小依次为管网末梢>管网中途>管网始端。Pielou均匀度指数是衡量群落物种分布的均匀度的指数，管网始端与末梢物种分布均匀度相当，管网中途Pielou均匀度指数最小。4.5本章小结1.以二氧化氯为消毒剂的实际供水管网中，能够确定菌属的微生物分为9属17种，其中食酸菌属（Acidovorax）最多有4种，其次是鞘脂单胞菌属（Sphingomonas，Sphingopyxis）有3种。2.整个实际管网中变形菌门占绝对优势，其中属于α-变形菌纲、β-变形菌纲与γ-变形菌纲的耐氯菌比重分别为52.6%，36.8%，10.6%，α-变形菌纲占优势。α-变形菌纲中，鞘脂单胞菌科鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)与柄杆菌科短波单胞菌属(Brevundimonas)比重分别为50%与30%。3.主体水中耐氯菌均属于变形菌门，其中属于α-变形菌纲、β-变形菌纲与γ-变形菌纲的耐氯菌比重分别为54.5%、36.4%与9.1%，α-变形菌纲占优势。鞘脂单胞菌属（Sphingomonas、Sphingopyxis）与食酸菌属（Acidovorax）为优势菌属，相对分度分别为27.3%与18.2%。4.管壁生物膜中耐氯菌分为变形菌门与放线菌门，变形菌门占绝对优势。α-变形菌纲、β-变形菌纲与γ-变形菌纲的耐氯菌比重分别为44.4%、33.3%与11.1%，α-变形菌纲占优势。鞘脂单胞菌属（Sphingomonas、Sphingopyxis）、短波单胞菌属（Brevundimonas）与食酸菌属（Acidovorax）为优势菌属，相对丰度均为22.2%。5.利用SPSS19.0软件以WORD法进行系统聚类分析，结果表明，管网始端与中途耐氯菌的细菌群落结构组成相差不大，管网始端与中途与末梢处耐氯菌的细菌群落结构组成存在较大差异。6.通过生态学多样性指数计算与分析，供水管网中耐氯菌生物多样性依次为管网始端<管网中途<管网末梢。-39- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文第5章耐氯菌生长特性与抵抗机制研究5.1耐氯菌的生长特性研究对分离到的细菌选定典型菌株测定生长曲线，典型菌株生长曲线结果如下图5-1所示。2.01.8AcidovoraxAcidovorax1.61.51.41.21.01.00.8OD/AbsOD/Abs0.60.50.40.20.00.001020304050600102030405060time/htime/hAcidovorax（KF999729）Acidovorax（HQ222268）2.0BlastomonasAgrobacterium1.82.01.61.41.51.21.0OD/Abs0.8OD/Abs1.00.60.40.50.20.00.001020304050600102030405060time/htime/hBlastomonasnatatoria(NR_113794)Agrobacterium(KM252932)Sphingomonas1.2Pseudomonas2.51.02.00.81.50.6OD/AbsOD/Abs1.00.40.50.20.00.001020304050600102030405060time/htime/hSphingomonas(KF501484)Pseudomonas(FJ392835)-40- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文2.0Hydrogenophaga0.8Microbacterium0.71.50.60.51.00.4OD/AbsOD/Abs0.30.50.20.10.00.001020304050600102030405060time/htime/hHydrogenophaga(KM035950)Microbacterium(JX997908)1.61.4BrevundimonasJanthinobacterium1.41.21.21.01.00.80.8OD/Abs0.60.6OD/Abs0.40.40.20.20.00.0010203040506070010203040506070time/htime/hBrevundimonas(HM352338)Janthinobacterium(JX196629)1.20.6CaulobacterAcidovorax1.00.50.80.40.60.3OD/AbsOD/Abs0.40.20.20.10.00.001020304050607001020304050time/htime/hCaulobacter(KF536026)Acidovorax(GQ284421)图5-1各细菌生长曲线单细胞微生物典型生长曲线分为延滞期（适应期）、指数期、稳定期和衰亡期4个时期。各个时期的特点分别为：（1）延滞期：细胞物质开始增加；有的细胞开始不适应环境而死亡；细菌总数下降；延滞期末期，细胞代谢活动能力强，细胞中RNA含量高，嗜碱性-41- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文强。对不良环境条件较敏感，呼吸速度、核酸及蛋白质的合成速度接近对数细胞，并开始细胞分裂。（2）对数期：菌体以几何数增加，增长速度快；细胞代谢能力最强；细菌很少死亡或不死亡。（3）稳定期：生长速率下降，死亡率上升；细胞数达到最大值，新生的细菌数和死亡的细菌数相当。（4）衰亡期：死亡率增加，细菌少繁殖或不繁殖；细菌常出现多形态、畸形或衰退型，有的会产生芽孢。根据以上细菌生长曲线图与各生长期特点，可大致估算出各细菌的延滞期（适应期）、指数期、稳定期和衰亡期4个时期，结果如表5-1所示。表5-1各细菌延滞期、对数期、稳定期和衰亡期时间长度细菌编号菌属名称延滞期/h对数期/h稳定期和衰亡期/h3-1Blastomonasnatatoria18-2430-361-33-2Flavobacteriumcheonhonense6-910-1238-423-5Acidovoraxdelafieldii6-918-2028-325-2Acidovoraxsp.6-910-1238-426-1Agrobacteriumtumefaciens6-918-2028-326-3Janthinobacteriumsp.15-188-1028-326-4Pseudomonassp.1-313-1538-427-2Brevundimonassp.6-928-3018-227-3Janthinobacteriumsp.9-1138-428-127-4Caulobactersp.9-1133-3513-177-5Acidovoraxdelafieldii6-923-2523-27由表5-1，我们可以得到不同种属的细菌延滞期和对数期估计值对比图，如图5-2所示。由图5-2可以看出，芽单胞菌属（Blastomonasnatatoria）的延滞期最长，假单胞菌属（Pseudomonas）的延滞期较长，其它菌属的延滞期长度相差不多；柄杆菌属（Caulobacter）的对数期最长，芽单胞菌属（Blastomonasnatatoria）的对数期较长，其他菌属的对数期长度相差不多。-42- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文lagphaselogphaseCaulobactersp.Brevundimonassp.Pseudomonassp.Janthinobacteriumsp.AgrobacteriumtumefaciensAcidovoraxsp.FlavobacteriumcheonhonenseBlastomonasnatatoria0510152025303540time/h图5-2不同菌属细菌延滞期与停滞期对比图5.2耐氯菌对消毒剂衰减的影响研究1.实验菌株的选定由于对供水管网而言，管网始端（清水池）β-变形菌纲食酸菌属（Acidovorax）为优势菌属，管网中段α-变形菌纲鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）为优势菌属，管网末梢假单胞菌属（Pseudomonas）为优势菌属。所以，实验室研究耐氯机制的实验菌株选定为鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、食酸菌属（Acidovoraxdelafieldii）与假单胞菌属（Pseudomonas），实验菌株如表5-2所示。表5-2实验菌株菌属名称菌株号采样点Sphingomonassp.MEB2JX026010清水池AcidovoraxdelafieldiiJQ689177清水池Pseudomonassp.EM0469FJ392835管网末梢管壁生物膜2.液氯与二氧化氯消毒剂的衰减液氯与二氧化氯消毒剂会发生衰减，需对消毒剂未加细菌的空白状态下进行测定，确定消毒剂衰减曲线，液氯与二氧化氯的配制与测定按照2.5.2所示进行，结果如图5-3所示。-43- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文1.0氯0.9二氧化氯0.8L0.70.6余氯量mg/0.50.40.30102030405060min图5-3氯与二氧化氯消毒剂衰减曲线由图5-3可知，初始氯浓度约为0.95mg/L，10min时氯浓度衰减为0.86mg/L，氯浓度衰减速率基本不变，30min时氯浓度衰减为0.79mg/L，60min时氯浓度衰减为0.67mg/L，氯消毒剂衰减幅度较大，总衰减率为29.47%；初始二氧化氯浓度为0.44mg/L，15min时二氧化氯浓度为0.39mg/L，30min时二氧化氯浓度为0.34mg/L，60min时二氧化氯浓度为0.3mg/L，二氧化氯衰减曲线平缓，总体衰减幅度较小，总衰减率为23.07%。3.实验细菌的生长7.0logN6.86.66.46.2logN6.05.85.65.40102030405060time(min)注：N为鞘脂单胞菌（Sphingomonas）采用平板计数法（HPC）所得活菌数量图5-4未投加消毒剂鞘脂单胞菌（Sphingomonas）HPC变化-44- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文本实验采用菌浓度为105cfu/mL鞘脂单胞菌（Sphingomonas）的菌悬液作为研究对象，在未投加消毒剂的情况下，以无菌标准硬度水代替消毒剂按照2.5.3.3所述步骤进行，实验用菌悬液按照2.5.3.2所述步骤进行制备，具体结果如图5-4所示。由图5-4可知，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）数量在0-10min内缓慢增加，在10-15min内突然增高，15-30min内骤减，在30min后趋于平缓。分析认为增高的原因可能是鞘脂单胞菌（Sphingomonas）能够在高度贫营养环境和恶劣环境生存，实验菌株为对数期的鞘脂单胞菌（Sphingomonas），生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃，在实验条件下，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）经过开始的迟缓期适应环境后，可以大量繁殖，使细菌数量突然增高。随着细菌数量的增加，溶液中的营养物质逐渐减少，细菌的数量又急剧减少直至细菌数量稳定。综上所述，细菌在加入中止剂后10-20min会爆发式增长，为了消毒实验效果的准确性，在投加中止剂后应在0-10min内及时进行计数。5.2.1不同菌液浓度对氯衰减的影响1.不同菌液浓度对氯消毒剂衰减的影响研究[52,53]表明，菌液的浓度不同，其对消毒剂衰减的影响也有所不同。将菌液浓度为1.7×107的鞘脂单胞菌（Sphingomonas）菌液稀释，按照2.5.3.3所述步骤，向1.0mg/L氯消毒剂中分别投加浓度为105cfu/mL、106cfu/mL与107cfu/mL细菌菌液，氯消毒剂衰减特性如图5-5所示。1.2空白1.1510cfu/mL1.0610cfu/mL70.910cfu/mL0.80.70.60.5游离氯mg/L0.40.30.20.10.00102030405060时间/min(a)游离氯衰减曲线-45- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文1.2空白1.1510cfu/mL1.0610cfu/mL0.9710cfu/mL0.80.70.60.5总氯mg/L0.40.30.20.10.00102030405060时间/min(b)总氯衰减曲线图5-5氯消毒时，鞘脂单胞菌不同菌液浓度对氯衰减的影响0.60510cfu/mL0.55610cfu/mL0.50710cfu/mL0.450.400.350.300.250.20化合性余氯mg/L0.150.100.050.000102030405060时间/min图5-6氯消毒时，鞘脂单胞菌不同菌液浓度下化合性余氯变化曲线由图5-5(a)可知，游离氯的衰减幅度随着菌液浓度的增加而增加，菌液浓度为105cfu/mL时游离氯消耗最少，衰减幅度最小，30min时游离氯衰减为0.56mg/L，衰减率为44%，在30-60min内游离氯衰减平缓，60min时游离氯衰减为0.52mg/L，总衰减率为48%。菌液浓度为106cfu/mL时，30min后游离氯衰减为0.31mg/L，衰减率为69%，在30-60min内游离氯衰减变慢，60min时游离氯衰减为0.22mg/L，总衰减率为78%。菌液浓度为107cfu/mL时游离氯消耗最多，衰减幅度最大，30min时游离氯衰减为0.24mg/L，衰减率0.76%，60min时游离氯衰减为0.09，总衰减率91%。由图5-5(b)可知，菌-46- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文液浓度为105cfu/mL时总氯消耗最少，由1.0mg/L衰减为0.67mg/L，总衰减率为33%；菌液浓度为106cfu/mL时总氯由1.0mg/L衰减为0.54mg/L，总衰减率为46%；菌液浓度为107cfu/mL时总氯由1.0mg/L衰减为0.46mg/L，总衰减率为54%。由图5-6可知，在0-5min内化合性氯浓度快速增加，菌液浓度为105cfu/mL时，化合性氯浓度在0.15mg/L左右；菌液浓度为106cfu/mL时，化合性氯浓度在0.3mg/L左右；菌液浓度为107cfu/mL时，化合性氯浓度在0.4mg/L左右，化合性氯的浓度随细菌浓度的增加而增加。1.0organicchloramineLinearfitoforganicchloramine0.8Y=0.1721X-0.02932R=0.95620.60.4化合性余氯mg/L0.20.001234567logN注：N-细菌菌液浓度，单位cfu/mL图5-7菌液浓度与化合性氯线性拟合曲线将细菌菌液浓度对数值与化合性氯浓度用Origin软件线性拟合后，线性拟合曲线如图5-7所示。由图5-7可知，细菌菌液浓度对数值与化合性氯浓度的线性相关系数为0.9562，两者呈线性相关。2.不同菌液浓度对二氧化氯消毒剂衰减的影响将菌液用PBS溶液稀释至菌液浓度为105cfu/mL与106cfu/mL，按照2.5.3.3所述步骤分别投加0.35mg/L二氧化氯消毒剂，二氧化氯消毒剂衰减情况如图5-8所示。由图5-8可知，细菌的菌液浓度为105cfu/mL时，二氧化氯消耗很小，与未投加细菌时二氧化氯衰减幅度相差不大。当细菌的菌液浓度为106cfu/mL时，二氧化氯明显衰减，30min时二氧化氯浓度衰减为0.21mg/L，衰减率为40%。在30-60min内，二氧化氯变化缓慢，衰减幅度很小，60min时二氧化氯浓度衰减为0.20mg/L。当菌液浓度为106cfu/mL时，游离氯与二氧化氯消毒剂均有明显衰减，且衰减范围合适，106cfu/mL是较为合适的实验菌浓度。-47- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文0.45610cfu/mL0.40510cfu/mL0.35空白0.300.250.20二氧化氯mg/L0.150.100.050.000102030405060时间/min图5-8不同菌液浓度下二氧化氯变化曲线5.2.2温度对氯衰减的影响1.01.0总氯总氯0.90.9自由氯游离氯0.8有机氯胺0.8有机氯胺0.70.70.60.60.50.50.40.4余氯量mg/L余氯量mg/L0.30.30.20.20.10.10.00.001020304050600102030405060时间/min时间/min(a)5℃条件下氯消毒剂的衰减(b)15℃条件下氯消毒剂的衰减1.01.05℃总氯0.9总氯5℃游离氯游离氯0.80.815℃总氯有机氯胺15℃游离氯0.725℃总氯25℃游离氯0.60.60.50.40.4余氯量mg/L余氯量mg/L0.30.20.20.10.00.001020304050600102030405060时间/min时间/min(c)25℃条件下氯消毒剂的衰减(d)三种温度下氯消毒剂的衰减比较-48- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文0.355℃15℃0.3025℃0.250.200.15有机氯胺0.10mg/L0.050.000102030405060时间/min(e)三种温度下化合性余氯对比图5-6不同温度下氯消毒剂灭活鞘脂单胞菌的衰减曲线在5℃、15℃与25℃条件下，向初始菌液浓度为3.4×106cfu/mL的鞘脂单胞菌（Sphingomonas）中投加1.0mg/L的氯消毒剂，按照2.5.3.3所述步骤进行氯消毒特性实验，实验结果如图5-6所示。图5-6为不同温度下游离氯灭活鞘脂单胞菌的衰减曲线，由图可知，在5℃、15℃与25℃三种温度下，氯浓度为1.0mg/L时，投加初始菌液浓度为3.5×106cfu/mL的鞘脂单胞菌，总氯、游离氯与化合性余氯的数值变化相差不大，由于投加的菌量与消毒剂量一致，生成的化合性余氯也大致相当。由5-6(d)可知，虽然总氯与游离氯的数值变化相差不大，但也可以看出随着温度的增高氯衰减幅度增加。总氯与游离氯的衰减规律变化为25℃>15℃>5℃。由5-6(e)可知，0-20min内化合性余氯为25℃>5℃>15℃，20min后，化合性余氯逐渐变化为5℃>15℃>25℃。经分析认为，这可能是由于即使在加氯条件下，鞘脂单胞菌仍在生长繁殖，而低温环境可以抑制鞘脂单胞菌的繁殖，从而导致一段时间后，溶液中细菌含量5℃<15℃<25℃，也有可能是因为低温环境恶劣，使鞘脂单胞菌在加氯消毒剂与低温的双重作用下较25℃与15℃死亡的更快，从而使氯衰减随着温度的增高而加快。5.2.3氯消毒过程中pH的变化将菌液浓度为1.7×106的鞘脂单胞菌（Sphingomonas）菌液中加入约1.0mg/L氯消毒剂（调至pH7.0），测定氯消毒过程中溶液的pH值，pH变化如图5-7所示。由图5-7可知，氯消毒剂浓度为0.92mg/L、pH为6.93时，加入鞘脂单胞菌（Sphingomonas）菌液后，5min时测定，溶液pH由6.93上升至7.17，-49- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文消毒过程中pH值基本不变，pH值在7.18处上下浮动。氯消毒剂浓度为1.06mg/L、pH为6.97时，加入鞘脂单胞菌（Sphingomonas）菌液后，5min时测定，溶液pH由6.97上升至7.15，消毒过程中pH值在7.17处上下浮动。经分析认为，pH上升是因为在实验前已将氯消毒剂pH调至7.0左右，细菌菌液用pH7.2的PBS缓冲溶液淋洗并稀释至所需浓度，向氯消毒剂（pH7.0）中投加菌液后，在PBS缓冲溶液的作用下，溶液pH会上升至7.2左右并上下浮动。7.5游离氯0.92mg/L游离氯1.06mg/L7.0pH6.56.0020406080100120时间/min图5-7游离氯消毒过程中pH变化曲线5.2.4不同菌株的耐氯性研究将鞘脂单胞菌（Sphingomonas）、食酸菌属（Acidovoraxdelafieldii）与假单胞菌属（Pseudomonas）分别投加到不同浓度的氯消毒剂（0.5mg/L,1mg/L,3mg/L,4mg/L）与二氧化氯消毒剂（0.1mg/L,0.2mg/L,0.3mg/L）中，60min后培养观察是否存活，具体存活情况如表5-3与表5-4所示。由表5-3可知，在氯浓度较高（3mg/L，4mg/L）时，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）仍可以存活，而假单胞菌（Pseudomonas）在氯浓度较低（0.5mg/L）时才可以存活。由表5-4可知，在二氧化氯浓度较高（0.2mg/L，0.3mg/L）时，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）仍可以存活，而假单胞菌（Pseudomonas）在二氧化氯浓度较低（0.1mg/L）时才可以存活。综上所述，3种菌株中鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovorax-50- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文delafieldii）耐氯性较好，假单胞菌（Pseudomonas）耐氯性较差。表5-3细菌在氯消毒剂中的存活情况游离氯浓度mg/L0.5134鞘脂单胞菌（Sphingomonas）++++食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）++++假单胞菌（Pseudomonas）+---注：“+”细菌存活；“—”细菌不存活表5-4细菌在二氧化氯消毒剂中的存活情况二氧化氯浓度mg/L0.10.20.3鞘脂单胞菌（Sphingomonas）+++食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）+++假单胞菌（Pseudomonas）+--注：“+”细菌存活；“-”细菌不存活5.3细菌自身特点对耐氯特性的影响5.3.1细菌的细胞表面疏水性对耐氯特性的影响实验采用碳氢化合物粘着法（MATH）测定细胞表面疏水率（CellSurfaceHydrophobicity，CSH），计算公式如下所示：A-A600nm空白600nmCSH100%（5-1）A600nm空白正乙烷的用量可以影响测定的细胞表面疏水率值，因而首先确定最佳的正乙烷用量。取5支螺口玻璃管，加入4ml波长在600nm处吸光度值约为0.5的鞘脂单胞菌液（Sphingomonas），分别加入1ml、1.5ml、2ml、3ml、4ml正乙烷，按照2.5.3.5所述试验方法测定，测定不同体积的正乙烷对应的吸光度值如图5-8所示，不同体积正乙烷对应的细胞表面疏水率如图5-9所示。-51- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文0.510Abs8CSH/%0.50570.50060.4955Abs0.490疏水率CSH/%40.48530.48021.01.52.02.53.03.54.01.01.52.02.53.03.54.0正乙烷/ml正乙烷/ml图5-8不同正乙烷对应的吸光度值图5-9不同正乙烷对应的细胞表面疏水率由图5-3可知，当正乙烷用量低于1.5ml时，细胞表面疏水率随着正乙烷的用量增加而增加，当正乙烷用量高于1.5ml时，细胞表面疏水率随着正乙烷的用量增加而减少，当正乙烷用量大于3ml时，细胞表面疏水率测定值趋于稳定，因此确定正乙烷的用量为3ml。当正乙烷用量为3ml时，按照2.5.3.6所述试验方法分别测定实验菌种鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、食酸菌属（Acidovoraxdelafieldii）与假单胞菌属（Pseudomonas）的细胞表面疏水率，结果如表5-5所示。表5-5细胞表面疏水率菌株名称A600CSH/%对照组实验组Sphingomonassp.MEB20.520.4910.4930.4945.2Acidovoraxdelafieldii0.530.5240.5190.5261.32Pseudomonassp.EM04690.5130.4860.4880.4915.26通过测定可知，鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、食酸菌属（Acidovoraxdelafieldii）与假单胞菌属（Pseudomonas）的细胞表面疏水率分别为5.2%，1.32%，5.26%。鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）细胞表面呈疏水性，疏水性较好；食酸菌属（Acidovoraxdelafieldii）细胞表面疏水率较小，疏水性较差。细菌细胞表面疏水性阻止了亲水消毒剂分子进入细胞，从而抵抗消毒剂的消毒作用。-52- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文5.3.2细胞的吸附性能对耐氯特性的影响按照2.5.3.6所述方法分别测定实验菌株鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、食酸菌属（Acidovoraxdelafieldii）与假单胞菌属（Pseudomonas）的吸附特性，结果如表5-6、表5-7与表5-8所示。表5-6悬浮菌吸光度值菌株编号123平均值Sphingomonassp.MEB20.3790.3730.3670.373Acidovoraxdelafieldii0.5270.5280.5290.528Pseudomonassp.EM04690.7610.7680.7720.767表5-7生物膜染色后吸光度值菌株编号123平均值Sphingomonassp.MEB20.4010.3970.390.396Acidovoraxdelafieldii0.2310.2310.2370.233Pseudomonassp.EM04690.4330.4360.4330.434表5-8细菌吸附特性菌株编号悬浮菌吸光度值生物膜吸光度值细菌吸附特性Sphingomonassp.MEB20.3730.3960.769Acidovoraxdelafieldii0.5280.2330.761Pseudomonassp.EM04690.7670.4341.201由表5-6可知，悬浮菌吸光度值假单胞菌>食酸菌>鞘脂单胞菌。由表5-7可知，生物膜染色后吸光度值假单胞菌>鞘脂单胞菌>食酸菌。细菌吸附特性由悬浮菌吸光度值与生物膜染色后吸光度值的总和表示，由5-8可知，细菌吸附特性假单胞菌>鞘脂单胞菌>食酸菌。由图5-10可知，吸附能力相差不大，吸附性能指数分别为0.769与0.761，假单胞菌属（Pseudomonas）的吸附能力最强，吸附性能指数为1.201，约为其余两株细菌的1.58倍。细菌的吸附特性强，有利于细胞吸附在管道内壁上形成生物膜，从而抵抗消毒剂的消毒作用。-53- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文1.2生物膜染色后吸光度值1.1悬浮菌吸光度值1.00.90.80.70.60.5吸光度值/Abs0.40.30.20.10.0AcidovoraxdelafieldiiSphingomonassp.MEB2Pseudomonassp.EM0469图5-10各细菌吸附性能5.3.3细菌的脂肪酸含量对耐氯特性的影响对实验菌株鞘脂单胞菌（Sphingomonas）、假单胞菌（Pseudomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）测定脂肪酸组成，各菌株气象色谱图如图5-11、5-12、5-13所示，脂肪酸各成分含量结果如表5-7所示。FID1A,前部信号(E15619.674A0031107.D)pA1.51312.7934035309.38125209.6828.388151.9972.0742.4106.6039.52711.13011.59911.76312.95313.10513.24216.3232.557.51012.51517.520min图5-11鞘脂单胞菌（Sphingomonas）气相色谱图-54- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文FID1A,前部信号(E15619.674A0041108.D)pA1.5129.3849.68412.79122203.7805.8965.542184.266161411.1742.0046.60713.1052.3512.4072.8183.1084.7745.6836.3618.0749.52811.37613.2432.557.51012.51517.520min图5-12假单胞菌（Pseudomonas）气相色谱图FID1A,前部信号(E15619.674A0051109.D)pA1.5137.52140353010.3792513.3709.421209.894156.0437.6519.68210.66210.74712.2561.9982.8583.8814.9146.6098.0748.2649.08410.04410.49811.63512.75412.94313.5412.557.51012.51517.520min图5-13食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）气相色谱图-55- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文表5-9各细菌脂肪酸组成脂肪酸种类鞘脂单胞菌属假单胞菌属食酸菌属饱和脂肪酸10----0.1612:0----3.7514:00.190.180.3816:0--1.34--17:0----0.0818:00.34--0.42SUM0.531.524.79支链脂肪酸13:0iso--0.57--15:0iso--41.23--15:0anteiso--1.32--17:0iso--0.87--SUM043.990不饱和脂肪酸16:1w5c1.30--0.1016:1w7c/16:1w6c23.84--38.1817:1isow9c--17.91--17:1isoI/anteisoB--0.46--18:1w5c1.03----18:1w7c56.5911.9812.6818:1w7c11-methyl1.07--0.13SUM83.8330.3551.09-56- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文表5-9（续表）脂肪酸种类鞘脂单胞菌属假单胞菌属食酸菌属10:03OH----5.4112:02OH----5.0112:13OH----0.0612:03OH----5.3914:02OH5.13----14:0iso3OH--0.10--15:0iso3OH--3.94--15:02OH--0.16--16:02OH0.71----16:03OH--1.52--16:0iso3OH--0.33--17:02OH--0.33--SUM5.8412.7615.87根据表5-9计算饱和脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸总量作图5-14。由图5-14可知，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）中不饱和脂肪酸含量最多，相对含量为92.94%，其他三类脂肪酸含量较少；假单胞菌（Pseudomonas）中支链脂肪酸含量最多，其相对含量为49.64%，其次为不饱和脂肪酸，相对含量为34.25%；食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）中不饱和脂肪酸含量最多，相对含量为71.21%，其次为羟基脂肪酸，相对含量为22.12%。三种实验菌株的饱和脂肪酸含量依次为食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）>假单胞菌（Pseudomonas）>鞘脂单胞菌（Sphingomonas）。三种实验菌株的不饱和脂肪酸含量依次为鞘脂单胞菌（Sphingomonas）<食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）<假单胞菌（Pseudomonas）。随着细胞膜中不饱和脂肪酸含量增加，膜脂质的流动性也相应增加，这一现象十分重要。细胞进行物质运输、离子交换、能量转换、信息传递、酶活动大小等都与膜脂质的流动性密切相关，细菌细胞膜的屏障功能与膜脂质流动性呈负相关[54]。窦京娇等[60]细菌均通过调节细胞膜脂肪酸不饱和度和支-57- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文链化程度来降低熔点，进而增强菌株对冷的耐受力。此外，膜脂质的流动性与细菌微粘性呈负相关，膜脂质的流动性越大时细菌的微粘度越大。相反地，膜脂质的流动性越小时细菌的微粘度越大[55]。而支链饱和脂肪酸的特性与直链不饱和脂肪酸的特性在许多方面极为相似[56]。所以，按照菌株中不饱和脂肪酸与支链脂肪酸含量判断细菌的膜脂质流动性。160150羟基脂肪酸不饱和脂肪酸140支链脂肪酸130饱和脂肪酸12011010090807060脂肪酸含量50403020100AcidovoraxdelafieldiiSphingomonassp.MEB2Pseudomonassp.EM0469A图5-14三种实验菌株各类脂肪酸含量三种实验菌株膜脂质的流动性大小为：鞘脂单胞菌（Sphingomonas）<假单胞菌（Pseudomonas）<食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）。食酸菌的脂质流动性最小，相应的细菌细胞膜对消毒剂的屏障作用最强。三种实验菌株细菌的微粘度大小为：鞘脂单胞菌（Sphingomonas）>假单胞菌（Pseudomonas）>食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）。而5.3.2中吸附特性实验中三种菌株的吸附特性依次为假单胞菌（Pseudomonas）>鞘脂单胞菌(Sphingomonas）>食酸菌（Acidovoraxdelafieldii），这可能是由于细菌结构不同，假单胞菌具有鞭毛，更容易相互交错形成网状，从而使菌体聚集粘附管壁。饱和脂肪酸含量高，细菌的耐氯性强，可能是由于饱和脂肪酸的结构稳定。不饱和脂肪酸的含量低，细菌的膜脂质流动性小，细菌的屏障功能强，从而耐氯性强。-58- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文5.3.4细菌的超微结构观察实验用样品溶液为实验菌株鞘脂单胞菌（Sphingomonas）、假单胞菌（Pseudomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）分别投加0.35mg/L二氧化氯溶液作用30min，加入硫代硫酸钠（1.5%）中止剂，按照2.3所述步骤对样品溶液通过透射电镜进行观察与拍照。(a)(b)图5-15鞘脂单胞菌（Sphingomonas）消毒后透射电镜照片（a）（b）图5-16假单胞菌（Pseudomonas）消毒后透射电镜照片-59- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文经二氧化氯消毒后，对实验菌株通过透射电镜进行观察发现，鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）部分菌体出现肿胀膨大与变形，细胞壁厚薄不均匀，[57]细胞膜轮廓不清晰，如图5-15所示。从图5-16可以看出，假单胞菌（Pseudomonas）之间均存在着大量的“丝状物质”,呈网状分布，细菌被保护在网中，菌体密集，许多单根的“丝状物质”可聚合，粗细不同，长短不同，如图5-16（a）所示。经分析认为，假单孢菌（Pseudomonas）菌体呈杆状，具有1-5根鞭毛，“丝状物质”可能为菌体鞭毛，彼此相互交错形成网状保护菌体。谢念铭等[58]在对某种假单胞菌进行电镜观察时，也发现细菌胞外丝状体的存在，并提出丝状体可能是由于细胞壁缺陷导致的畸形细胞，也可能是细菌合成的细胞外纤维素。细菌个数少时，假单胞菌属（Pseudomonas）被保护在粘膜下，从而减少二氧化氯消毒作用，如图5-16（b）所示。(a)(b)图5-17食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）消毒后透射电镜照片由图5-17所示，食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）经二氧化氯消毒后，细[59]菌菌体肿胀膨大与变形，层次不清晰，细胞膜轮廓不清晰，核心肿胀溶解。5.5本章小结1.对耐氯菌的生长特性进行研究，发现芽单胞菌属（Blastomonasnatatoria）的延滞期最长，假单胞菌属（Pseudomonassp.）的延滞期较长，其它菌属的延滞期长度相差不多；柄杆菌属（Caulobactersp.）的对数期最长，芽单胞菌-60- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文属（Blastomonasnatatoria）的对数期较长，其他菌属的对数期长度相差不多。2.鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）耐氯性较好，假单胞菌（Pseudomonas）耐氯性较差。氯消毒过程中，氯衰减与细菌的菌液浓度有关，与温度的关系不大。氯消毒过程中，pH基本不变。3.鞘脂单胞菌、假单胞菌表面均呈疏水性，疏水性较好；食酸菌细胞表面疏水率较小，疏水性较差。鞘脂单胞菌与食酸菌吸附能力相差不大，假单胞菌属的吸附能力最强，约为其余两株细菌的1.58倍。4.三种实验菌株的饱和脂肪酸含量依次为食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）>假单胞菌（Pseudomonas）>鞘脂单胞菌（Sphingomonas）。三种实验菌株的不饱和脂肪酸含量依次为鞘脂单胞菌(Sphingomonas）<食酸菌(Acidovoraxdelafieldii）<假单胞菌（Pseudomonas）。三种实验菌株膜脂质的流动性大小为：鞘脂单胞菌（Sphingomonas）<假单胞菌(Pseudomonas）<食酸菌(Acidovoraxdelafieldii）。5.经二氧化氯消毒后，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）细菌菌体明显肿胀膨大与变形；假单胞菌（Pseudomonas）之间均存在着大量的“丝状物质”与粘膜可以保护细菌。-61- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文结论本文从分子生物学角度出发，对以二氧化氯为消毒剂的供水管网初始、中段和末梢的主体水与生物膜进行研究，分析供水管网中耐氯菌种群分布及耐氯菌种群多样性，并针对筛选出的耐氯菌的耐氯特性与耐氯机制作进一步研究和分析，揭示耐氯菌与二氧化氯氯消毒过程的关系，得出的结论如下：采用传统的微生物学方法，对以二氧化氯为消毒剂的实际供水管网所有样品进行了分离、纯化，初步确定分离得到40株细菌。运用分子生物学方法16srDNAPCR技术对分离到的40株细菌进行鉴定，能够确定菌属的微生物分为11属23种27株，其中加氯前（滤后水与反冲洗污泥）为3属6株，管网始端（清水池）为4属5株，管网中段为3属7株，管网末梢为6属8株。加氯前后微生物种群结构发生很大变化。加氯前微生物γ-变形菌纲占优势，相对丰度为86%；加氯后（清水池）β-变形菌纲占优势，相对丰度为60%；加氯前后的优势菌属分别为假单胞菌属与食酸菌属（清水池），相对丰度分别为42.86%与40%。。整个实际管网中变形菌门占优势，其中属于α-变形菌纲、β-变形菌纲与γ-变形菌纲的耐氯菌比重分别为52.6%，36.8%，10.6%。主体水中耐氯菌均属于变形菌门，优势菌属为属于α-变形菌纲的鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）；管壁生物膜中耐氯菌分为变形菌门与放线菌门优势菌属为鞘脂单胞菌属（Sphingomonas、Sphingopyxis）、短波单胞菌属（Brevundimonas）与食酸菌属（Acidovorax）。管网始端（清水池）优势菌属为属于β-变形菌纲的食酸菌属（Acidovorax），管网中段α-变形菌纲优势菌属为属于α-变形菌纲的鞘脂单胞菌属（Sphingomonas），管网末梢中β-变形菌纲占优势，优势菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）。利用SPSS19.0软件以WORD法进行系统聚类分析，结果表明，管网始端与中段耐氯菌的细菌群落结构组成相差不大，管网始端与中段与末梢处耐氯菌的细菌群落结构组成存在较大差异。通过生态学多样性指数计算与分析，供水管网中耐氯菌生物多样性依次为管网始端<管网中途<管网末梢。对耐氯菌的生长特性进行研究，发现芽单胞菌属（Blastomonasnatatoria）的延滞期最长，假单胞菌属（Pseudomonassp.）的延滞期较长，其它菌属的延滞期长度相差不多；柄杆菌属（Caulobactersp.）的对数期最长，芽单胞菌属（Blastomonasnatatoria）的对数期较长，其他菌属的对数期长度相差不多。对耐氯菌的耐氯性进行研究发现，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸-62- 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文菌（Acidovoraxdelafieldii）耐氯性较好，假单胞菌（Pseudomonas）耐氯性较差。氯消毒过程中，氯衰减与细菌的菌液浓度有关，与温度的关系不大。氯消毒过程中，pH基本不变。对细菌的自身特点进行研究，发现鞘脂单胞菌（Sphingomonas）、假单胞菌（Pseudomonas）表面均呈疏水性，疏水性较好；食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）细胞表面疏水率较小，疏水性较差。鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）吸附能力相差不大，假单胞菌（Pseudomonas）的吸附能力最强，约为其余两株细菌的1.58倍。三种实验菌株的饱和脂肪酸含量依次为食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）>假单胞菌（Pseudomonas）>鞘脂单胞菌（Sphingomonas）。三种实验菌株的不饱和脂肪酸含量依次为鞘脂单胞菌(Sphingomonas）<食酸菌(Acidovoraxdelafieldii）<假单胞菌（Pseudomonas）。经二氧化氯消毒后，鞘脂单胞菌（Sphingomonas）与食酸菌（Acidovoraxdelafieldii）细菌菌体明显肿胀膨大与变形；假单胞菌（Pseudomonas）之间均存在着大量的“丝状物质”与粘膜可以保护细菌。由于时间及实验条件等原因，本研究中仍有地方需要改进，因此提出以下建议与展望：1.对于管网中耐氯菌的生长进行长时间模拟，观察生物膜的群落结构的变化；2.采用更先进的技术对供水管网中的生物多样性进行研究。-63- 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哈尔滨工业大学工学硕士学位论文致谢转眼之间，硕士生活接近尾声了，回首精彩而充实硕士生活，心中充满了眷恋与不舍。在此论文工作完成之际，我特向曾经帮助、鼓励过我的所有老师、同学、亲人和朋友表达我最衷心的感谢！首先，我要衷心的感谢导师钟丹副教授，感谢她对本人的精心指导。她实事求是的科研态度，严谨的工作作风，敏锐的思维让我受益匪浅，她的言传身教将使我终生受益。在学习和生活中，钟丹老师对我的关怀，给予的温暖是我前行的动力。其次，我要感谢袁一星教授与吴晨光副教授对我的课题的指导与支持，为研究提供了宝贵的思路与建议。感谢所有教育过我的老师，你们传授给我的专业知识是我不断成长的源泉，也是完成本论文的基础。感谢余华荣师兄，孟令薇师姐对我实验上的帮助与指导，感谢刘海星师兄与刘健师兄，感谢王自强师弟与辛红梅师妹，感谢课题组全体老师和同学们的热情帮助，感谢各位师兄师姐师弟师妹让我度过了一个充实快乐的硕士生活。感谢我的舍友与好友董林沛、赵戈和刘芳芳，你们的开怀大笑、你们的精神鼓励、你们给了我快乐和温馨的感觉，给了我永远无法忘记的研究生生活。最后，我要感谢我的父母在我硕士期间给予我关爱与温暖，以及经济上的支持，感谢姐姐对我的开导与支持，在最落魄的日子里，正是你们的亲切鼓励，让我能够坚强前行，你们是我的精神支柱。感谢卢志鹏一路相伴，给了我莫大的支持和鼓励。特此致谢。-70-'