供水管网生长环的构成及其微生物特性研究.pdf 92页

'硕士学位论文供水管网生长环的构成及其微生物特性研究RESEARCHONGROWRINGCOMPOSITIONOFWATERSUPPLYNETWORKANDMICROBALCHARACTERISTIC伍先云哈尔滨工业大学2018年6月 国内图书分类号：TU991.2学校代码：10213国际图书分类号：628.162密级：公开工程硕士学位论文供水管网生长环的构成及其微生物特性研究硕士研究生：伍先云导师：邱微副教授申请学位：工程硕士学科：建筑与土木工程所在单位：环境学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学 ClassifiedIndex:TU991.2U.D.C:628.162DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringRESEARCHONGROWRINGCOMPOSITIONOFWATERSUPPLYNETWORKANDMICROBALCHARACTERISTICCandidate：WUXianyunSupervisor：Prof.QiuWeiAcademicDegreeAppliedfor：MasterofEngineeringSpeciality：MunicipalEngineeringAffiliation：SchoolofEnvironmentDateofDefence：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文摘要管道生长环是由沉淀物、锈蚀物、黏垢及生物膜组成的混合体，生长环容易使已达标的出厂水水质恶化，造成了供水系统的“二次污染”问题。因此，研究给水管网金属管材腐蚀现象，对于城市安全供水、保障人们正常生活等具有重大意义。本文对给水管网中的生长环的组成进行了研究，将生长环按剖面纵向分为三层。对生长环中的TOC进行了测量，测得所取生长环样品中TOC为2.31%。对生长环各层的形貌结构以及比表面积和孔径进行了观察，生长环表面层、中间层和腐蚀层孔径的大小在:17.000Ǻ-3000.000Ǻ之间。生长环表面层、中间层222和腐蚀层的BET比表面积分别为：97.2687m/g、63.11173m/g、53.4781m/g。BJH吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分布，按照表面层、中间层、腐蚀层的顺序依次递减。对生长环中的金属污染物进行了测量，生长环中主要金属元素有：铁、铅、锌、铬、镉、锰，其中铁的含量最高达到了642500ug/g。分析了生长环的主要成分，生长环的主要成分是针铁矿和纤铁矿，两者的含量分别是76.93%和23.07%，针铁矿的含量将近是纤铁矿含量的3倍。用X射线荧光光谱分析生长环中的微量元素的种类和含量，生长环中的主要元素是氧和铁，分别占24.032%和29.334%，接近1:1。测得了生长环中胞外聚合物中多糖含量为1.852mg/ml，蛋白质含量为1.274mg/ml。应用分子微生物技术，对生长环各层中的微生物在门、纲、目、科、属,水平下进行了微生物种群结构研究。从生长环中分离得到了异养菌和纯种的铁细菌，为后续实验准备了材料。实验选取饮用水中最常见的三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，以筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物作为研究对象，分析这三类饮用水中最常见的有机污染物在不同浓度下对生长环中筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物EPS的影响。由于给水管网中属于贫营养环境，实验中水中添加的三类有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯浓度很低，所以铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中，无论是多糖含量、蛋白质含量还是胞外聚合物总量都比较低。水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯三类有机物对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物的影响，随着水中有机物浓度的增加，胞外聚合物中的多糖含量、蛋白质含量和胞外聚合物总量呈增长趋势。关键词：生长环；铁细菌；异养菌；胞外聚合物I 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文AbstractThegrowthringofthepipelineisamixtureofprecipitates,corrosivesubstances,stickydirtandbiofilm.Thegrowthringscaneasilydeterioratethewaterqualitythathasreachedthestandards,causingsecondarypollutionofthewatersupplysystem.Therefore,thecorrosionofmetalpipesinwatersupplynetworksisstudied.BasedontheanalysisofthecomponentsofthegrowthringsinthewatersupplypipesandtheresearchonthemechanismofEPSformation,itisofgreatsignificanceforurbansafewatersupplyandensuringpeople"snormallife.Inthispaper,thecompositionofthegrowthringsinthewatersupplynetworkisstudied.Thegrowthringsaredividedintothreelayersinthelongitudinaldirectionofthesection.TheTOCinthegrowthringwasmeasuredandtheTOCinthegrownringsamplewasfoundtobe2.31%.Themorphology,specificsurfaceareaandporesizeofeachlayerofthegrowthringwereobserved.Theporesizeofthesurfacelayer,theintermediatelayerandthecorrosionlayerofthegrowthringwasbetween17.000Ǻ-3000.000Ǻ.TheBETspecificsurfaceareasofthesurfacelayer,theintermediatelayer,andtheetchinglayer222ofthegrowthringwere:97.2687m/g,63.11173m/g,53.4781m/g,respectively.Thespecificsurfaceareadistribution,poresizedistribution,andporevolumedistributionofBJHadsorptionanddesorptiondecreaseintheorderofthesurfacelayer,theintermediatelayer,andthecorrosionlayer.Themetalcontaminantsinthegrowthringsweremeasured.Themainmetalcontaminantsinthegrowthringswere:iron,lead,zinc,chromium,cadmium,andmanganese.Theironcontentreached642,500ug/g.Themaincomponentsofthegrowthringwereanalyzed.Themaincomponentsofthegrowthringweregoethiteandhematite.Thecontentsofbothwere76.93%and23.07%,respectively,andthegoethitecontentwasnearly3timesthecontentofthepyrite.ThetypeandcontentoftraceelementsinthegrowthringswereanalyzedbyX-rayfluorescencespectrometry.Themainelementsinthegrowthringswereoxygenandiron,accountingfor24.032%and29.334%,respectively,closeto1:1.II 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文Thepolysaccharidecontentintheextracellularpolymericsubstancesinthegrowthringwas1.852mg/mlandtheproteincontentwas1.274mg/ml.Usingmolecularmicrobiologytechnology,microbiologicalpopulationstructureofthemicroorganismsineachlayerofthegrowthringwasstudiedatthelevelofgates,classes,orders,families,andgenera.Heterotrophicbacteriaandpurebredironbacteriawereisolatedfromthegrowthrings,andmaterialswerepreparedforsubsequentexperiments.Thethreemostcommonorganicsubstancesindrinkingwater,methylenechloride,chloroformanddibutylphthalate,wereselectedforthestudy.Theextracellularpolymericsubstancessecretedbyironbacteriaandheterotrophicbacteriawereusedasresearchsubjectstoanalyzetheinfluenceofthemostcommonorganicpollutantsinwaterontheextracellularpolymerexcretedbytheselectedironbacteriaandheterotrophicbacteriaatdifferentconcentrations.Duetotheoligotrophicenvironmentinthewatersupplynetwork,theconcentrationofdichloromethane,chloroform,anddibutylphthalateinthethreeorganicsubstancesaddedtothewaterduringtheexperimentisverylow.Therefore,intheextracellularpolymerssecretedbyironbacteriaandheterotrophicbacteria,Boththepolysaccharidecontent,theproteincontentandthetotalamountoftheextracellularpolymericsubstancesarerelativelylow.Theeffectsofthreeorganicsubstances,methylenechloride,chloroformanddibutylphthalate,onthesecretionofextracellularpolymersfromironbacteriaandheterotrophicbacteria,withtheincreaseoftheconcentrationoforganicsubstancesinthewater,thecontentofpolysaccharidesandproteincontentandthetotalamountoftheextracellularpolymericsubstancesshowedanincreasingtrend.Keyword:growthrings,ironbacteria,heterotrophicbacteria,extracellularpolymericsubstancesIII 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文目录摘要...............................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................................II第1章绪论................................................................................................................11.1课题来源及研究背景.......................................................................................11.1.1课题来源................................................................................................11.1.2研究背景................................................................................................11.2生长环国内外研究及进展...............................................................................31.3生长环...............................................................................................................51.3.1生长环的组成成分................................................................................51.3.2生长环的成因........................................................................................71.4胞外聚合物.......................................................................................................71.4.1胞外聚合物的定义和组成....................................................................71.4.2胞外聚合物的提取方法........................................................................71.4.3胞外聚合物的分析................................................................................81.5研究内容与意义...............................................................................................91.5.1研究内容................................................................................................91.5.2研究意义..............................................................................................10第2章实验材料与实验方法.......................................................................................112.1实验材料..........................................................................................................112.1.1实验用水和生长环来源.......................................................................112.1.2实验仪器...............................................................................................112.1.3实验所用药剂......................................................................................122.2实验方法.........................................................................................................132.3生长环检测分析方法.....................................................................................152.3.1电子扫描电镜分析..............................................................................152.3.2比表面积和孔结构分析......................................................................152.3.3TOC测定..............................................................................................162.3.4生长环中金属类元素的测定..............................................................162.3.5生长环X射线衍射.............................................................................162.3.6生长环胞外聚合物表面官能团分析..................................................16IV 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文2.4胞外聚合物分析方法.....................................................................................162.4.1EPS的提取...........................................................................................172.4.2生长环中胞外聚合物中多糖的测量..................................................172.4.3胞外聚合物中蛋白质含量的测定......................................................172.5微生物实验方法.............................................................................................182.5.1培养基..................................................................................................182.5.2细菌染色..............................................................................................192.5.3微生物的计数......................................................................................202.5.4微生物的分离......................................................................................222.5.5细菌的鉴定..........................................................................................232.5.6铁细菌的纯化......................................................................................232.5.7PCR扩增...............................................................................................242.5.8Miseq测序............................................................................................26第3章供水管网中生长环的构成..............................................................................273.1生长环的微观结构分析.................................................................................273.1.1生长环表面形貌分析..........................................................................273.1.2生长环比表面积分析..........................................................................293.2生长环的化学成分分析.................................................................................353.2.1生长环中总有机碳的测定..................................................................353.2.2生长环中金属元素的测定..................................................................353.2.3生长环X射线衍射分析.....................................................................363.2.4生长环X射线荧光光谱分析.............................................................363.2.5生长环胞外聚合物表面官能团分析..................................................383.2.6生长环胞外聚合物中多糖和蛋白质含量的测定..............................383.3本章小结.........................................................................................................39第4章生长环中微生物种群的特异性研究..............................................................404.1细菌总数.........................................................................................................404.2生长环中DNA提取及PCR..........................................................................404.3生长环中微生物多样性分析.........................................................................424.4生长环中微生物的差异性分析.....................................................................434.5生长环中微生物群落组成分析.....................................................................46V 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文4.5.1门水平分析..........................................................................................464.5.2纲水平分析..........................................................................................484.5.3目水平分析..........................................................................................504.5.4科水平分析..........................................................................................524.5.5属水平分析..........................................................................................554.6层次聚类分析和Heatmap图.........................................................................584.7本章小结.........................................................................................................59第5章有机物对生长环中微生物胞外聚合物的影响..............................................605.1有机物对生长环中微生物胞外聚合物中多糖的影响.................................605.2有机物对生长环中微生物胞外聚合物中蛋白质的影响.............................645.3有机物对生长环中微生物胞外聚合物总量的影响.....................................685.4本章小结.........................................................................................................72结论............................................................................................................................73参考文献........................................................................................................................75哈尔滨工业大学学位论文原创性声明和使用权限....................................................82致谢............................................................................................................................83VI 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文第1章绪论1.1课题来源及研究背景1.1.1课题来源城市水资源与水环境国家重点实验室（自主课题）（课题编号：2016TS02）。黑龙江省自然科学基金委面上项目（E201427）。1.1.2研究背景水是人类赖以生存的基础，随着我国经济的快速发展，国民生活水平日益提高，居民对饮用水的水质要求也越来越高，饮用水的水质安全性已成为社会关注[1-8]的热点。从2007年起，我国开始强制执行《生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)》，水质指标由原来的35项增加为106项。据2015年《中国环境状况公报》报道，我国地表及地下饮用水未达标水源地分别占各自总数的7.4%和13.4%，主要超标[9]指标分别为总磷、溶解氧、BOD和锰、铁、氨氮。事实上，即使采用较为先进的饮用水处理工艺来提高出厂水水质，仍然不能保证用户获得安全的饮用水。因为在管网输配过程中由于停留时间长、余氯损失、有机污染物的存在等因素导致[10-11]管网中水质发生了“二次污染”。2011年全国设市城市和县城公共供水末梢水[12]水质检测结果表明，与出厂水相比，管网中水的浊度、色度、重金属铁、锰及[13]其他细菌均有所增加，而管网末端余氯严重下降，水质总合格率较低。长期以来，对于饮用水安全保障技术的研究主要侧重于研发水处理新技术和开发水处理[14-18]新工艺，而对在管网输配过程中的水质变化规律和反应机理的研究相对滞后。因此，管网系统对于饮用水水质安全存在重要影响，在保证出厂水达标的同时，加强管网水的水质稳定控制与管理势在必行。供水管道同时受微生物诱导腐蚀和电化学腐蚀的作用，致使已达标的出厂水[19]水质恶化，造成了供水系统的“二次污染”问题。微生物腐蚀主要是由于管道系[20-25]统内存在的铁细菌、硫酸盐还原菌和异养菌产生，占整个管道腐蚀损失的40%。管内壁上的微生物及其胞外聚合物(EPS)与沉淀物、腐蚀物、黏垢等多种成分相互[26-29]作用，逐渐形成结构复杂、成分不均的环状物覆盖在其表面，称之为“生长环”。1 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文输配水过程中，水沿着生长环流动，与之进行着传质、扩散、解析的过程。生长环所含的细菌等成分，有些会溶于水，是造成“二次污染”的原因之一。此外，管道[30-34]内生长环逐年加厚，使管道的有效管径减小，降低输水能力、增加输水能耗。因此，减缓并控制生长环的产生是降低输配水过程二次污染，改善居民生活用水的有效手段。水源地水质对给水管网水水质稳定性有直接的影响，同时对管网中微生物的生长及管道腐蚀有重要影响。我国集中式水源地水质的监测结果显示，我国河流型水源的主要污染物是COD、BOD、氨氮和大肠菌群等，湖库型水源地的主要污染物是COD、总磷和总氮等，地下水型水源地的主要污染物是总硬度、氟化物、硝酸盐、硫酸盐、铁和锰等。有机污染物的监测结果表明，邻苯二甲酸二丁酯、[35-36]氯仿、二氯甲烷、苯和邻苯二甲酸二酯检出率最高。截止到2010年，黑龙江省集中式饮用水水源地水质调查结果表明，地表水水源地超标污染物主要为COD；地下水水源地超标污染物是铁、锰、氟化物、pH等背景水质指标及由面源污染引起的高锰酸盐指数、总大肠杆菌数及氨氮等。污染的原因主要有农业中化肥和农药的大量使用，以及部分水源保护区内工业企业、排污口、地下油罐、垃圾堆和[37]养殖场等污染源的存在。现有给水厂的常规处理工艺存在一定局限性，对部分有机物及氮磷等污染物的去除效果较差，导致管网中水质稳定性降低。给水管网是一个复杂的系统，管网水质影响着水中微生物的种类及管道的腐蚀速度。管网中铁细菌、硫酸盐还原菌以及异养菌等微生物，以水中的污染物为基质进行代谢与繁殖，同时产生各种胞外聚合物（EPS），而EPS又会增加水中微生物及沉积物的粘连，导致生物膜及生长环的形成，加速管道腐蚀速度的同时，也会导致末梢[38-40]水色度及浊度的增加。而对于管网中微生物代谢产生的EPS究竟如何影响生物膜及生长环的形成、不同种类微生物产生的EPS对生物膜和生长环的作用及腐蚀速度的影响机制等方面的研究还鲜有报道。因此，以给水管网系统为对象，研究不同饮用水水质对管网中微生物产生EPS的影响机制，建立细菌EPS与给水管网中生长环生长与管道腐蚀的关系，将为延缓及控制给水管网腐蚀提供理论支持。生长环为管壁上的微生物提供了一个复杂的、动态变化的生存环境，它的形成包括营养物质的吸附、微生物的新陈代谢、生物膜在管壁的附着/脱附等过程。在生长环形成的过程中微生物释放的EPS的组成成分和数量与悬浮的微生物相比[41-42]有较大的区别，EPS的产生有利于共凝聚作用发生，进而与给水管网生长环的形成具有很大相关性。在生长环的形成初期，微生物和营养基质运输到管壁表2 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文[43]面并发生积累，随着微生物增殖和微生物EPS的分泌，生物膜逐渐形成，此时[44-46]EPS可在细胞外部形成保护层并起到储备碳源和能源的作用，随着生物膜的不断更新和演替，EPS由于具有较大的表面积且表面富含负电基团，能通过配位络合、离子交换及螯合作用等与金属离子发生较强的吸附作用，进而有助于其它[47-48]颗粒在管壁的沉积，加速生长环的形成。因此，揭示EPS在供水管道生长环形成与演替过程中的微观作用机制，可为减缓生长环生物腐蚀提供理论依据。因此，研究给水管网金属管材腐蚀现象，基于供水管材中生长环的组分分析及EPS形成机制研究对于城市安全供水、保障人们正常生活等具有重大意义。1.2生长环国内外研究及进展赵洪宾教授通过对长期运行的管道调查研究，发现管道内壁长有坚硬的物质，这种物质是由沉淀物、锈蚀物、生物膜和黏垢组成的混合体。厚度逐年增加，且[27][30]呈环状，将它形象的成为生长环。袁一星等人通过对供水管网中生长环的研究，分析了生长环形成的原因以及生长环的存在对水质安全和管道过流能力的危影响。生长环形成的主要原因是管壁的电化学腐蚀、微生物腐蚀以及管道内的后沉淀。生长环的表面层疏松多孔，生长环表面形成的生物膜，容易被管网中的水流冲洗下来而，进入水中，污染水质，威胁饮用水水质安全，造成“二次污染”。他们通过对国内多家水厂的水质调查结果显示，由于管网中生长环的存在降低了水质。同时还发现管网中的生长环，加快了管网中余氯的消耗速率。由于生长环的存在使管道的过水断面面积减小，管道的过流能力减低，水头损失增加，同时[49]也增加输水成本。陈跃等人通过对东北某给水管道的研究，指出了生长环对饮用水水质和管道过流能力的影响，并介绍了几种常见的清除生长环的方法。通过现场对管道实施气压脉冲法清洗，发现管道的过流断面增大，过流能力增强，管道的水力条件明显改善，输水能耗降低，节约了运行成本。文中指出常用的清洗生长环的方法有机械刮管法、炮弹法、水力清洗法、高压射流法、气压脉冲法。[50]李欣等人通过调查发现生长环的存在，影响饮用水的色度和浊度等指标，影响感官，同时也促进了管网的进一步腐蚀。通过现场清洗实验发现，高压水射流法和气水脉冲法操作简单方便，冲洗效率高能耗低，冲洗效果好。同时指出两种给水管道内有效的防腐蚀的方法反转内衬管法和挤压内衬塑料管法。这两种方法，[51-52]施工方便经济节能。Port和Herro将管道内壁黏垢分为四层，分别是腐蚀层、[53]表面层、壳状层和内核层。赵志领等人对供水管网中的生长环进行了结构组成3 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文分析，结果显示生长环主要有铁和氧两种元素组成，其中铁元素的含量近似为56%，氧元素的含量近似为41%。研究还发现，生长环的存在，加速了管网中余氯的衰[54]减。Sarin等人，对给水管网中生长环的组成成分进行了研究结果显示生长环中[55]含量最高的元素为铁、氧、硅和锌。Lin等人通过对镀锌管和铸铁管进行研究，发现沉淀在管道底部的管垢内外层在结构上有比较明显的区别。最外面层平滑密实，最里面的部分多孔隙结构。表面层直接与管中水体接触，主要是由管道水体的后沉淀物和给水管道的腐蚀产物组成。当由于管径变化或坡度变化引起流速突然变化时，很容易造成表面层在水流的冲刷作用下发生脱落，进入水体污染水质，造成供水的二次污染。硬壳层质地较坚硬，外部有金属光泽，位于中间层，包裹着腐蚀瘤，是管道腐蚀瘤的骨架。内核层与给水管道的内壁结合的很紧密，结构内部含有大量的孔隙，是微生物生长繁殖的重要场所，主要有铁的氧化物构成。[56]刘姣等人对给水管网中生长环的原因进行了研究，发现管道的材质、水中所发生的沉淀反应以及管网中存在的微生物和生长环的生长具有紧密的关系。实际过程中可以通过更换管材，对管道定期进行清洗，强化管理等方式，对生长环的生[57]长进行控制，保证饮用水安全。徐雯雯等人对供水管网中的生长环从物理、化学方面进行了深入的研究。采用扫描电镜对生长环的表面形貌特征进行了观察，用BET测定了生长环的比表面积，用X射线荧光光谱分析了生长环中的组成元素。结果显示生长环的平均孔径为41Ǻ，生长环中的两种主要的铁的化合物是FeO(OH)和硫化亚铁，生长环中FeO(OH)的含量高达86%，硫化亚铁含量约为13%。生长环中的主要元素是铁、氧、铝、硫和硅。此外还含有一些微量的镁、磷、氯、钙、锰和钾。生长环形成的原因主要有沉淀作用、电化学腐蚀和微生物腐蚀。沉淀作用包括金属离子的沉淀作用和微絮凝体的后沉淀作用。金属离子的沉淀作用主要是水中的钙、镁、锰、铁等离子的沉淀，容易在水中生产碳酸钙、氢氧化铁、氢[58-59]氧化镁和氧化锰等沉淀在管道上，形成生长环的一部分。方伟和周韬对铸铁管和镀锌钢管中的腐蚀物的成分进行了分析，得出了与Lin相似的结论。有研究发现，材质不同的镀锌管和铸铁管管道内的污垢具有不同的特点，虽然镀锌管和铸铁管内的污垢颜色大体相同，但是铸铁管管道内壁的污垢外表比较光滑，内部质地密实，而镀锌管管道内的污垢质地疏松多孔，极容易受到水流的冲刷破坏，[60]从管壁脱落下来进入水体污染水质。Ramos等人通过研究发现，生长环中生长的微生物里，存在能够引发肠胃疾病的幽门螺杆菌。4 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文1.3生长环1.3.1生长环的组成成分出厂水经由管网送到用户，在这一过程中，管网犹如一个巨大的反应器，管网中的微生物的代谢产物和分泌物粘附在管道内壁，沿水流方向，逐步形成不规则的由沉淀物、锈蚀物、生物膜和黏垢形成的混合体。厚度逐年增加，且呈环状，[27]故形象的称之为“生长环”。刚形成的生长环比较疏松，容易被给水管中的水流带走，导致用户处出现黄水现象，没有被水流带走的部分积存了下来，逐年变厚变硬，成为细菌滋生的温床，导致饮用水中的细菌数量增多，威胁饮用水的安全。给水管中生长环的存在，不仅影响饮用水的供水质量，而且增加了水头损失，增加了能耗。生长环的结构成分复杂，是有微生物、微生物分泌物、有机物和无机物组成的混合体。（1）物理结构生长环按纵向结构可以划分三层，表面层、中间层和腐蚀层。腐蚀层的颜色多表现为棕红色，棕红色主要是铁锈的颜色，说明给水管常年埋在地下，在输水过程中存在锈蚀，该层主要是给水管的腐蚀产物氢氧化铁、氧化铁、硫化亚铁等，与管道内壁直接接触，质地坚硬。中间层主要是一层沉积物，多为黄褐色，主要是碳酸钙、管道沉积物和水中胶体颗粒。该层容易剥落，多孔且凹凸不平。当给水管中水质和流速发生变化时，管道中就会发生沉淀、结垢等现象加速中间层的形成。生长环的表面层是水体和管道直接接触的界面，表层中有许多有机物，里面有许多微生物，表面粘稠物质就是生物膜，它是由微生物、微生物的分泌物和被吸附的水中的有机物组成。生长在生物膜上的细菌通过表面的粘稠物质与水发生物质能量交换，水中的营养物质是细菌生长繁殖重要的物质和能量来源。细菌在给水管网中有两种繁殖生长方式，一种是附着在管壁生长环中生长，另一种是悬浮在水溶液中生长。饮用水中有机物质含量低，属于贫营养的生长环境，附着在生长环表面的细菌通过生物膜，可以从水中获得更多的营养[61-62]物质，在生长繁殖中比悬浮在水中生长的细菌占有优势。（2）化学组成生长环的组成大致是一样的，只是由于各种因素的影响，一些元素的含量存5 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文在差异。生长环中的水分含量很高，一般在30%—50%之间。另外还有有机物、微生物、微生物分泌物、铁的化合物和硫化物等。X射线衍射光谱分析发现生长环中的主要成分是针铁矿、纤铁矿和硫化亚铁。X射线荧光光谱分析结果表明生长环的主要元素是氧和铁，另外还有Si、S、Mg、Ca、Al、Mn等，其余元素的含量见表1-1。表1-1生长环XRF分析结果分析元素浓度（%）分析化合物浓度（%计算方法Fe24.032Fe2O345.386计算O29.334——计算Si1.232SiO23.021计算Ca0.216CaO0.361计算Mn0.093MnO0.153计算Mg0.124MgO0.236计算Al0.221Al2O30.486计算S0.025SO30.084计算P0.063P2O50.166计算K0.032K2O0.045计算Ti0.059TiO20.114计算Zn0.061ZnO0.105计算Na0.134Na2O0.214计算Cl0.042——计算总和56.312总和50.625—从表1-1中可以看出，生长环中主要元素是氧和铁分别占24.032%和29.334%，接近1:1，另外还含有硅、钙、锰、镁、铝、硫、磷、钾、锌等元素。由于水厂在水处理时投加混凝剂的原因，生长环中有铝，氯元素可能是由于消毒剂的投放造成的。Si主要是水中的携带的砂砾，经过管道的沉淀后，留在生长环中。（3）微生物组成生长环表层的生物膜中，生长着许多微生物，主要有铁细菌、硫酸盐还原菌、大肠杆菌和异养菌等，它们能够及时有效的从水中获得它们所需的营养物质，它们的数量随着管道使用年限的增加而逐渐增多。6 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文1.3.2生长环的成因生长环的形成过程十分复杂，受众多因素的影响，如水中杂质的物理沉淀、管道的电化学腐蚀、生物稳定性和化学稳定性的影响。1.4胞外聚合物1.4.1胞外聚合物的定义和组成胞外聚合物(ExtracellularPolymericSubstances，EPS)是细菌和其它微生物产生[64]的用于自我保护和相互粘附的天然有机物。胞外聚合物是生长环中重要的组成部分。它是一种微生物所分泌的、分散在细胞周围的有机物。EPS中存在多种官能团，如：COOH-、OH-、负离子等。它可以通过蛋白质-糖键、氢键、糖脂键以及离子间的相互作用力而结合到一起。EPS从被发现以来，有关其组成的研究一直最受关注。大多学者认为，EPS主要是由多糖、蛋白质、腐殖质、核酸以及一些无机物质组成。其中多糖和蛋白质的含量最高，两种质量约占EPS的70%—80%。从宏观上，Sheng等将胞外聚合物分为溶解型胞外聚合物和结合型胞外聚合物。结合型胞外聚合物根据分离的难易程度和空间分布，又分为紧密结合胞外聚合物和松散结合胞外聚合物。紧密结合胞外聚合物位于内层，和细胞表面紧密结合，稳定的附着在细胞壁外面，具有一定的外形；松散结合胞外聚合物位于外层，结构[64]比较松散，是没有明显边缘的粘液层，可以向周围环境扩散。1.4.2胞外聚合物的提取方法高效的提取胞外聚合物是对其进行定性和定量分析的基础。提取胞外聚合物[65]的方法主要可分为两类：物理方法和化学方法。物理提取法主要包括热提取法、超声波法和离心法，是通过物理外力来对EPS进行提取；化学提取法主要包括阳离子交换树脂法、EDTA法和NaOH法，是借助添加的化学试剂来对EPS进行提[66-67]取。采用不同的提取方法测得的EPS含量和组成存在明显的差异。化学方法虽然对提取EPS效率比较高，但是在提取过程中使用的化学试剂会对产造成一定[68-69][70-71]程度的污染，而且还会对EPS的高效体积排阻色谱的测定结果产生影响。常见EPS提取方法的特点见表1-2。7 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表1-2EPS提取方法方法特点超声波法单一的超声提取效率低热提取法--细胞破坏严重蒸汽热提取法细胞死亡率低H2SO4提取法提取效率高，细胞死亡率低NaOH提取法细胞破坏严重EDTA提取法提取效率高，但用紫外分光测核酸有干扰沸苯提取法提取效率低均质提取法提取效率低阳离子交换树脂法温和，提取效率高，细胞死亡率小甲醛NaOH法提取效率高，甲醛对细胞壁有很好的巩固作用甲醛—超声波法对细胞伤害小，但提取量少戊二醛提取法提取效率高，细胞死亡率小，但戊二醛对糖类物质测定有影响H2SO4-表面活性剂法提取效率高超声波—阳离子树脂法蛋白质提取效率高，但提取多糖的效果NaOH法会造成细胞破裂破坏生物的大分子物质；EDTA法提取EPS具有效率高，细胞破坏程度小等优点，但是剩余的EDTA会对EPS产生污染，对蛋白质的测定产生干扰；离子交换树脂法是一种比较温和的提取方法，有效率高，细胞破坏程度小等优点，可以有效的避免化学试剂对EPS产生的污染，并且有利于分析[72-75]过程的有效进行，是一种被广泛采用的方法。物理法会对EPS分子量的分布产生影响，物理法中的离心法虽然可以避免细胞破裂，但是单独使用时，只能提取细胞周围的EPS，对和细胞结合紧密的EPS提取效率很低；物理法中的超声波[65]法虽然对细胞的破坏比较小，但是提取EPS时效率比较低。因此，选择好的EPS提取方法，要尽量避免在提取过程中引起细胞自溶。1.4.3胞外聚合物的分析EPS提取之后，对其具体成分的测量也是EPS研究领域的热点之一。EPS的[65]含量通常是通过多糖和蛋白质来描述，腐殖质也是EPS的组成部分，通常通过[76]测定DNA的含量来检测细胞是否破裂。EPS中的多糖含量的测定常用的方法有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，通过对比研究发现苯酚-硫酸法所测定的多糖比采用8 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文[77]蒽酮-硫酸法测定的结果高，目前常采用苯酚-硫酸法进行测定，用标准葡萄糖溶液来绘制出标准曲线。EPS中蛋白质的含量通常采用Lowry法或者Bradford法进行测定。Bradford法具有测定过程简单，干扰因素少等优点，但其标准曲线由于不是严格的线性关系，所以偏差较大。Lowry法虽然测定过程复杂，但具有测定结果[65]准确，灵敏度高等优点。因此，EPS中蛋白质含量的测定，一般采用Lowry法。1.5研究内容与意义1.5.1研究内容1.5.1.1供水管网中生长环的组分分析和微生物种群结构研究分析供水金属管道中生长环剖面的微观结构特性，取服役期供水管道中的现有生长环，利用BET测试、扫描电镜（SEM）观察生长环横切面的比表面积、孔径和总孔容。根据生长环剖面的纵向分布将样品分为表面层、中间层和靠近管壁的腐蚀产物层。同时通过生长环上不同区域细菌总数的测定结果，确定不同的形态特点对微生物数量分布差别的影响，确定不同区域生长环结构特点造成的原因与危害；通过采用MAX(CNS)元素分析仪测得管垢中的总有机碳（TOC），原子吸收仪测定其中的金属Fe、Mn、Zn、Pb、Cu、Cr和Cd的含量。X射线衍射测试研究金属和合金的晶体结构。采用高通量测序技术研究不同区域生长环内微生物种群多样性：按照生长环剖面的纵向分布，将生长环分别制成表面层、中间层和腐蚀产物层的生长环样品，经离心沉淀后用PEbuffer（pH7.4）混匀，采用E.Z.N.ASoilDNA基因组抽提试剂盒提取基因组，并进行均匀混合后经PCR扩增得到纯化的PCR产物，并最终利用MiSeq高通量测序平台进行测序，分析各层中微生物的种群结构。1.5.1.2供水管网中主要类群微生物的筛选及纯化选取生长环靠近管壁的腐蚀产物层选取Winogradsky培养基，分离纯化筛选出铁细菌；选取生长环的表面层选取牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，筛选出异养菌，把筛选纯化的细菌进行培养与保存，留待后续实验。1.5.1.3有机物对生长环中微生物胞外聚合物的影响选取饮用水中最常见的三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，以筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物作为研究对象，分析这三类饮用水中最常见的有机污染物在不同浓度下对筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物EPS的影响，实验时每种有机物设计三个浓度梯度，分析有机物对胞外聚合物中9 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文的多糖含量，蛋白质的含量以及胞外聚合物总量的影响。技术路线如图1-1所示。供水管网生长环的构成及其微生物特性研究供水管网中生长环的组分分析和微生物群落结构研究基于微生物生态学的生长环中微生生长环微观结构分析生长环的化学成分结构分析物种群结构分析BETSEM细菌总数总有机碳的金属类污染物有机物的高通量测序MiSep平台测定测定的测定测定供水管网中主要类群微生物的筛选铁细菌：异养菌：LBWinogradsky培养基培养基有机物对生长环中微生物胞外聚合物的影响对多糖的影响对蛋白质的影响对EPS总量的影响图1-1技术路线图1.5.2研究意义以给水管道生长环中的主要菌群为研究对象，从微生物生理学角度确定不同菌群分泌的EPS组分及其相互作用关系，为抑制生长环的形成提供理论依据。建立细菌EPS与给水管网中生长环生长与管道腐蚀的关系，将为延缓及控制给水管网腐蚀提供理论支持,可为指导供水管道防腐及水质安全的研究与应用提供技术参考。因此，研究给水管网金属管材腐蚀现象，研究有机物对管网中细菌胞外聚合物的影响，对城市安全供水、保障人们正常生活等具有重大意义。10 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文第2章实验材料与实验方法2.1实验材料2.1.1实验用水和生长环来源2.1.1.1实验用水实验所用的水取自哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室自来水，先用浓度为75%的酒精将水龙头消毒，消毒完成后打开水龙头，让水先流淌3分钟，然后再取水。2.1.1.2生长环来源为了使本实验所用的细菌与实际供水管网中的菌种相似，本实验所用的细菌取自于一根自来水管的生长环中。取附着在给水管道管壁上的生长环，把生长环样品放入采样瓶中，密封保存，用牛皮纸把瓶口密封，防止混入杂菌。把密封好的取样瓶放在恒温培养箱中保存，在48小时内对细菌进行计数、提取和分离。2.1.2实验仪器实验过程中所用的主要仪器有试管、培养皿、量筒、锥形瓶250ml、锥形瓶1L、吸管、容量瓶100ml、涂布棒、接种环、试管架、酒精灯、滤纸等。其它主要仪器名称及型号和生产厂家信息见表2-1。表2-1主要仪器名称及型号和生产厂家信息仪器型号生产厂家HELIOSNano电子扫描电镜美国FEI公司Lab600i傅里叶转换红外光谱仪SpectrumOne美国Perkin-Elmer公司紫外-可见分光光度计T6北京普析通用有限公司总有机碳测定仪TOC-VCPH日本岛津公司比表面积及孔隙度测定ASAP2020M美国Micromeritics公司仪X射线衍射仪D/max-RB日本理学株式会所11 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-1（续表）仪器型号生产厂家高速离心机5810R德国Eppendorf公司数显恒温水浴锅HHS-21-4型上海鼎科科学仪器有限公司超纯水仪Milli-Q美国Milliopore公司超净工作台DL-CJ-2ND哈尔滨市东联电子公司全温震荡箱SPX-100B-D上海博迅实业有限公司分析天平DS-100亚太计量仪器有限公司电热恒温培养箱DH2500A天津市泰斯特仪器有限公司压力蒸汽灭菌锅280SA镇海金鑫医疗器械有限公司便携式余氯测定仪HI93711哈纳仪器有限公司电化学工作站2273Hach公司生化培养箱MJX-160B-Z上海博迅实业有限公司离心机Eppendorf5418德国Eppendorf公司DNA浓度测定仪NANODROP2000美国ThermoFisher公司电泳仪PowerpacTMBasic美国伯乐公司凝胶成像系统GelDoc2000美国伯乐公司突变检测系统DcodeTMsystem美国伯乐公司SEMS-570日本日立公司生产2.1.3实验所用药剂试验过程中所用的主要化学试剂名称及生产厂家和纯度信息如表2-2所示。表2-2化学试剂名称及生产厂家和纯度信息试剂等级生产厂家Na2SO4分析纯上海三爱思试剂有限公司K2HPO4分析纯上海三爱思试剂有限公司CaCl2分析纯天津风船化学试剂公司乳酸钠分析纯上海三爱思试剂有限公司MgSO4·7H2O分析纯上海三爱思试剂有限公司NH4Cl分析纯天津化学试剂有限公司12 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-2（续表）试剂等级生产厂家盐酸分析纯上海三爱思试剂有限公司NaOH分析纯上海三爱思试剂有限公司氯酸钠标准试剂美国ChemService公司次氯酸钠标准试剂美国ChemService公司次氯酸钠（溶液）—天津风船化学试剂公司营养琼脂—北京奥博星生物技术公司无水乙醇分析纯烟台三和化学试剂公司H2SO498%上海三爱思试剂有限公司葡萄糖分析纯北京奥博星生物技术公司生理盐水0.9%北京奥博星生物技术公司二氯甲烷分析纯上海三爱思试剂有限公司三氯甲烷分析纯上海三爱思试剂有限公司邻苯二甲酸二丁酯分析纯上海三爱思试剂有限公司酵母浸膏生物试剂北京生物技术有限公司2.2实验方法为了分析不同有机物对两类细菌产生的EPS的影响。实验选取饮用水中最常见的三种有机物（二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯），以筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物EPS作为研究对象，分析这三类饮用水中最常见的有机污染物在不同浓度下对筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物EPS的影响。这三类有机物的浓度设置以国家饮用水水质指标中规定的浓度为上限，国家饮用水水质指标中规定水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯的最高浓度分别为：0.02mg/L、0.06mg/L、0.003mg/L。实验时每种有机物设计三个浓度，各种有机物的浓度设计如表2-3所示。表2-3有机物设计浓度有机物名称编号浓度（mg/L）10.005二氯甲烷20.0130.0213 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-3（续表）有机物名称编号浓度（mg/L）10.02氯仿20.0430.0610.001邻苯二甲酸二丁酯20.00230.003具体操作流程如下：（1）选取18个已紫外灭菌的容量为1升的锥形瓶分为A、B、C、D、E、F，6个组，每组3个锥形瓶，分别标号为1、2、3；（2）将500ml用紫外灭菌后的饮用水加入到已标记的锥形瓶中；（3）往A、B组，C、D组，D、E组中分别加入二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，每组3个瓶中加入有机物的浓度见表；（4）往A、C、E组分别加入已配置好的铁细菌，B、D、F组分别加入异养菌；（5）配置好后密封好瓶口，放在室内培养。实验持续进行一段时间后提取胞外聚合物，并对胞外聚合物中的有机成分多糖，蛋白质的含量进行分析，反应体系见表2-4。表2-4实验反应体系组号编号有机物名称浓度(mg/L)接种细菌10.005A2二氯甲烷0.01铁细菌30.0210.005B2二氯甲烷0.01异养菌30.0214 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-4（续表）组号编号有机物名称浓度(mg/L）接种细菌10.02C2氯仿0.04铁细菌30.0610.02D2氯仿0.04异养菌30.0610.001E2邻苯二甲酸二丁酯0.002铁细菌30.00310.001F2邻苯二甲酸二丁酯0.002异养菌30.0032.3生长环检测分析方法2.3.1电子扫描电镜分析电子扫描电镜（SEM）可以观察生长环样品表面的形貌和分散性。先将生长环样品进行预处理烘干。用导电胶把预处理过的固体生长环样品粘接在样品台上，放进离子溅射镀膜仪中，使金溶胶喷在生长环样品的表面，增加生长环样品的导电性。最后对生长环样品进行喷金处理。将处理好的样品放进扫描电镜样品室中，进行表面形貌结构观察、扫描分析。2.3.2比表面积和孔结构分析将生长环样品进行烘干预处理，精确称取充分烘干后的生长环样品0.5g，放入已干燥至恒重的样品瓶中。样品经过常温脱气预处理后，将样品瓶移到分析口，然后加装灌有液氮的杜瓦瓶，用氮气吸附-脱附仪ASAP-2020M（中孔）测定生长环样品的低温氮气吸附-脱附曲线，脱气温度为150℃，脱气时间为12h，分析生长环的孔径、孔分布和比表面积等特性。15 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文2.3.3TOC测定总有机碳（TOC），是用碳的含量表示水中溶解性和悬浮性有机物总量的综合性指标。生长环中总有机碳的检测，采用日本岛津公司的TOC-VCPH总有机碳测定仪。2.3.4生长环中金属类元素的测定先将生长环样品消解，然后用原子吸收光谱仪，测定待测样品在铁、锰、锌、钠、铅空心阴极灯工作条件下的吸光度，查得相应浓度值，计算出微量金属元素锰、铁、钠、铅、铜、铬、镉，在生长环中的含量。2.3.5生长环X射线衍射X射线衍射仪（XRD）可以通过X射线照射样品产生特定的图谱。通过对产生的特定的图谱进行分析，可以分析样品的晶型以及物相。具体操作步骤为：将生长环样品充分干燥后，取一定量的生长环样品放入XRD样品盘的凹槽内，检测的生长环样品不能有凹凸，需要用玻璃板将样品压实，并且使玻璃板和样品盘保持平行，进行XRD图谱测试。用标准硅晶体校准之后，采用岛津（XRD-6100型）X射线衍射仪测生长环样品的X射线衍射图谱，扫描速度为2°/min,Cu/Ka为放射源，波长为0.15428nm，扫描范围为10-90°。2.3.6生长环胞外聚合物表面官能团分析生长环中胞外聚合物表面的官能团，用傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)，将经过研磨、压片的生长环样品经过红外光的照射，获得红外光谱图，从而可获得生长环中胞外聚合物中化学键或官能团的信息。采用溴化钾压片法，首先将溴化钾单独在红外灯下研磨均匀，在12.5MPa的压力下压制成均匀透明薄片，上机测试，将得到的谱线图做为背景;然后将生长环样品和溴化钾按一定的比例研磨均匀，在相同的压力下，压制成均匀透明的薄片，上机检测，在背景图的基础上得到该样品的红外谱图。2.4胞外聚合物分析方法16 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文2.4.1EPS的提取EPS的提取，取50ml样品于离心筒中，5000r/min离心5min，倒掉上清液，加入蒸馏水至离心管初试刻度，摇匀后于80℃水浴中加热30min，5000r/min离心5min，上清液经过0.45μm滤膜后收集滤液用于EPS分析。2.4.2生长环中胞外聚合物中多糖的测量胞外聚合物中多糖含量的测定采用硫酸苯酚法。具体测定步骤见表2-5。表2-5硫酸苯酚法方法具体测定步骤名称(1)将待测溶液稀释到可测定的浓度范围；(2)取2ml溶液，加入2ml5%（w/w）苯酚溶液；(3)加入6ml浓硫酸；(4)放置冷却至室温；(5)490nm比色，高纯水参比；硫酸(6)对照标准曲线得到多糖浓度苯酚(7)取适量的葡萄糖（试验用化学纯）致烘箱烘干去除水分，时间20min内；法(8)取100mg葡萄糖，加高纯水在100ml容量瓶中溶解；(9)取10ml葡萄糖溶液，加高纯水在100ml容量瓶中溶解（100mg/l）；(10)分别取100mg/l溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0ml加高纯水溶解成2ml溶液，浓度：0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100mg/L；(11)将标准溶液按测试步骤经比色后，绘制葡萄糖浓度-ABS曲线，线性拟合，得到标准曲线方程。按照样品ABS，计算多糖浓度。2.4.3胞外聚合物中蛋白质含量的测定胞外聚合物中的蛋白质含量的测定用lowry法。采用上海荔达生物科技有限公司的lowry法蛋白质试剂盒，操作步骤见表2-6。表2-6lowry法方法名称操作步骤(1)给样品编号编为，标0，标1，标2，标3标4，标5，标6，待测；17 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-6（续表）方法操作步骤名称(2)加样，分别加入蛋白标准样品或待测蛋白样品0.1ml各管依次加入试剂A5ml；混匀后室温放置10分钟；(3)加试剂B：各管依次加入试剂B0.5ml（每加一管必须立即混匀）；室温放置30lowry分钟；法(4)测定：750nm波长光下，以标0号管对设备进行调零，测定每一管的吸光（OD值）；(5)计算：根据标0—标6号管所测数据绘制标准曲线，计算出各待测样品的浓度。2.5微生物实验方法2.5.1培养基2.5.1.1异养菌类培养基培养异养菌常用的有普通培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，普通培养基组成成分见表2-7。根据给水管网的实际营养环境态，采用改良的R2A培养基更有利于给水管中异养菌的培养，R2A培养基各成分见表2-8。表2-7普通培养基成分组成成分含量牛肉膏3mg蛋白胨10mg氯化钠5mg琼脂15mg蒸馏水1000ml表2-8R2A培养基组成成分成分含量琼脂15g葡萄糖0.5g可溶性淀粉0.5g酸水解干酪素0.5g18 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-8（续表）成分含量酵母提取物0.5g蛋白胨0.5gMgSO47H2O0.05gK2HPO40.3g丙酮酸钠0.3g蒸馏水1L2.5.1.2铁细菌培养基铁细菌培养常用的培养基有Winogradsky培养基和IronCarbonate培养基，各培养基的组成成分见表2-9。表2-9各种铁细菌培养基及其成分组成培养基成分含量(NH4)2SO40.5mgNaNO30.5mgWinogradsky培K2HPO40.5mg养基MgSO4·7H2O0.5mg18～20℃培养CaCl2·6H2O0.2mg2～10天柠檬酸铁铵10mg琼脂粉15mg蒸馏水1000ml(NH4)2SO41mgMgSO4·7H2O0.05mgIronCarbonate培K2HPO40.1mg养基Ca(NO3)2·4H2O0.02mgFeCO30.05mg蒸馏水1000ml2.5.2细菌染色为了能够用显微镜清晰的观察细菌的个体形态特征，先将细菌进行染色。目19 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文前主要的染色方法是革兰氏染色法，根据细菌最终染色的不同，可以将细菌分为[78]革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两类。具体的染色操作步骤见表2-10。表2-10细菌染色操作操作步骤名称（1）接种细菌：用滴管滴一滴无菌蒸馏水到清洁的载玻片上，用接种环挑取少量菌体，接种到载玻片上的水滴中；（2）涂片：均匀涂片，使涂片层薄而均匀；（3）晾干：让涂片自然干燥；（4）固定：涂片自然干燥后，菌膜朝上，在酒精灯火焰上过2次固定，控制好温度，以不烫手为宜；（5）染色：往涂片上滴加草酸铵结晶紫溶液，染色1分钟；细菌（6）水洗：用水冲洗涂片上的染色溶液，同时用吸水纸将多余的水分吸干；染色（7）媒染：往涂片上滴加一滴碘溶液，染色1分钟，用水将多余的碘溶液缓慢冲洗干净，再用吸水纸将水分吸干；（8）脱色：倾斜盖玻片，往涂片上滴加95%的乙醇溶液，保持大概20—30秒，至流出液体无紫色，立即水洗；（9）复染：往涂片上滴加蕃红，染色3-5分钟，然后用水把涂片冲洗干净。（10）观察：涂片干燥后，把涂片放在显微镜下观察，调节显微镜，观察视野中分散的单独菌体的颜色，如果菌体颜色为红色，该细菌为革兰氏阴性菌，如果菌体颜色为蓝色则为革兰氏阳性菌。2.5.3微生物的计数传统的微生物计数方法主要有平板计数法和MPN（最大可能计数）法。这两[79]种方法比较成熟，使用时间长，而且计数稳定，是目前统计细菌总数的主要方法。2.5.3.1MPN计数法MPN计数法的具体操作流程如下：（1）配置好液体培养基，用灭菌锅在121℃高温灭菌，灭菌后让培养基冷却到室温；（2）将冷却好的液体培养基放入无菌操作台中操作，每次从中取出10ml，置于已灭菌的各支无菌试管中；20 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文（3）将待测液放入无菌操作台中操作，从中取出1ml待测液，注射到装有9ml无菌蒸馏水的无菌管中，充分震荡混合均匀后，从稀释后的试管中取1ml注射到装有9ml无菌蒸馏水的无菌试管中，重复这样操作，直到稀释到合适的倍数；（4）用移液枪在无菌操作台中从各个不同稀释倍数的试管中各吸取1ml菌液，注射到事先注有10ml培养基的试管内，震荡摇匀后，用棉塞封口，并用记号笔在试管上标记稀释倍数。每个稀释倍数的菌液接种3-5管，同时放置一支试管，不接种菌液作为空白样；（5）将试管置于恒温培养箱中培养，培养一段时间直至试管出现阳性反应；（6）观察空白样试管，如果无阳性反应，记录出现阳性反应试管的稀释倍数和数量，查表计算确定细菌数目。2.5.3.2平板菌落计数法平板菌落计数法是先将待测样品稀释一定倍数，以便使待测样品中的细菌分散为单个的细胞。取一定量的稀释后的样品液涂布在制作好的已灭菌平板上。培养一段时间，单个细胞可以繁殖生长成肉眼可见的菌落，当平板中长的菌落数量在30—300范围时，计数是有效的。统计菌落数，根据稀释倍数和接种量计算出待测样品中的细菌总数。为了使计数更加准确，实验时先把样品稀释多个倍数，然后再进行测量。平板计数法的操作步骤如下：（1）用高压蒸汽灭菌锅将已经配置好的固体培养基，移液枪枪头、玻璃器皿等高温灭菌，灭菌后放入无菌操作台中冷却；（2）在无菌操作台中将冷却至45~55℃的液态培养基，倒入培养皿中1/3-2/3高度处，制作成平板；（3）用倍比稀释法先将样品溶液分别稀释10倍、100倍和1000倍，稀释所用水采用已灭菌的蒸馏水；（4）用配有已灭菌枪头的移液枪吸取0.2ml稀释水样，注射到已制作好的平板上，用涂布棒均匀的将水样涂布在平板上，使水样完全分散均匀的分布在平板上面；（5）每个待测水样分别做三个平行平板和一个空白平板，涂好平板后用生化封条将培养皿密封，将培养皿倒置，放入30℃的恒温培养箱中培养。培养7天后，观察各平板上细菌的生长情况，如果空白样上没有菌落生长，则平板没有遭到污染，对菌落独立生长的平板上的菌落数进行计数，菌落数在30~300之间为有效，取平均值计算水样中的细菌总数。21 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文2.5.4微生物的分离本实验需要从生长环中分离得到异养菌和铁细菌并且还需要进一步纯化铁细菌得到纯种铁细菌，故先需要分离细菌，再对铁细菌进行纯化。本实验采用的细菌分离方法是平板分离法。2.5.4.1异养菌的分离异养菌的分离采用R2A固体培养基，具体操作步骤见表2-11，异养菌涂布图见图2-1。表2-11异养菌分离方法操作步骤名称（1）将配置好的R2A固体培养基先灭菌，在无菌操作台中趁热倒入培养皿中，待其冷却；平板分（2）用配有已灭菌枪头的移液枪取0.2ml菌液，接种到已制作好的平板培养基离法上；（3）用涂布棒均匀的将均匀涂布在平板培养基上面；用生化条将培养皿封口，放在30℃恒温箱里培养5-7天，直到平板培养基上长出肉眼能见的菌落图2-1异养菌涂布图2.5.4.2铁细菌的分离铁细菌的分离采用Winogradsky培养基，具体操作步骤与异养菌的分离相同，铁细菌22 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文涂布图图见图2-2。图2-2铁细菌涂布图2.5.5细菌的鉴定为确保分离出的是铁细菌，需对已分离出的目标菌进行鉴定，鉴定菌落时用普鲁士蓝染色，如果细菌中含有亚铁离子，那么镜检时能够产生普鲁士蓝阳性反应，可以认为目标菌落中含有铁细菌，进而可以对已分离的目标菌，进行下一步的纯化。2.5.6铁细菌的纯化平板培养能够使细菌在平板培养基表面分散的长出单一的菌落，通过观看菌落的颜色和形状的特征，能初步得到较纯的目标细菌。但这种方法得到的细菌不能达到后续实验的要求，需要获得更加纯的细菌，所以需要对已经分离得到的细菌加以纯化。一般对目标细菌经过反复3-4次纯化，能够获得该目标细菌的纯种细菌。实验采用平板划线法对分离出的细菌进行纯化，具体操作步骤见表2-12。表2-12铁细菌纯化操作操作步骤名称铁细菌（1）用配有已灭菌枪头的移液枪取0.2ml菌液，接种到已制作好的平板培养纯化基上；23 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表2-12（续表）操作操作步骤名称（2）用涂布棒均匀的将均匀涂布在平板培养基上面；（3）用生化条将培养皿封口，放在30℃恒温箱里培养5-7天，直到平板培养基上长出肉眼能见的菌落；铁细（4）用涂布棒均匀的将均匀涂布在平板培养基上面；菌纯（5）选取表面具有金属光泽的棕色平滑圆形菌落，进行镜检，镜检结果为革兰氏阴性菌，则该细菌为铁细菌；化（6）用涂布棒均匀的将均匀涂布在平板培养基上面；（7）用接种环从单个菌落的中央菌苔处挑取菌体，平板划线；用生化条将培养皿封口，放在30℃恒温箱里培养5-7天，直到平板培养基上长出肉眼能见的菌落。重复上述操作过程4次，完成细菌的纯化，放入4℃冰箱中保存备用。图2-3铁细菌第1次纯化图图2-4铁细菌第2次纯化图图2-5铁细菌第3次纯化图图2-6铁细菌第4次纯化图2.5.7PCR扩增PCR所用的引物为338F引物和806R引物，进行PCR扩增实验时，要注意避24 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文光，防止荧光引物分解，引物序列如表2-13。表2-13引物序列表引物名称序列515FGTGCCAGCMGCCGCGG907RCCGTCAATTCMTTTRAGTTTPCR反应扩增体系的组成和各物质的体积如表2-14所示。在进行PCR反应前，先将引物稀释至5mmol/L。表2-14PCR反应扩增体系物质名称体积（μl）物质名称体积（μl）模板DNA1TaqBuffer5引物515F1EXTaq酶0.25引物907R1无菌水37.75dNTPmix4PCR扩增反应的条件和程序见表2-15。PCR反应完后，取琼脂糖0.32g和1×TAE30mL制作成琼脂糖凝胶，取样品5μL、6×LoadingBuffer1μL，在80V的恒定电压下进行凝胶电泳，检测PCR效果。表2-15PCR扩增反应的条件和程序名称反应温度（℃）反应时间循环数预变性943分钟0变性9430秒5退火4520秒5延伸6530秒5变性9420秒20退火5520秒20延伸7230秒20延伸725分钟2025 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文2.5.8Miseq测序用DNA检测试剂盒对回收的DNA样品进行准确定量，上机测序的DNA样品的浓度为20pmol。构建Miseq文库，将样品进行Miseq测序。26 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文第3章供水管网中生长环的构成实验中所用的生长环样品取自学院实验室一根自来水管中，根据取出的生长环剖面的纵向分布将样品分为表面层、中间层和靠近管壁的腐蚀产物层。对生长环各层进行物理化学组成分析。3.1生长环的微观结构分析生长环的表面层、中间层、腐蚀层，在表面形貌和孔隙结构方面各有自己的特征，为了深入的分析各层的特征，分别对表面层、中间层、腐蚀层进行扫描电镜和比表面积分析。3.1.1生长环表面形貌分析对生长环的表面层、中间层、腐蚀层进行扫描电镜分析，对它们各层的表面微观形貌进行分析，表面层和中间层放大500倍，腐蚀层放大1000倍，各层的扫描电镜图见图3-1—图3-3。图3-1表面层扫描电镜图27 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图3-2中间层扫描电镜图图3-3腐蚀层扫描电镜图从图3-1和图3-2可以看出：在放大500倍观察时，表面层有非常明显的团聚现象，团聚颗粒呈雪花状，多孔隙结构，比较疏松，中间层也有团聚现象，团聚28 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文颗粒呈块状，比较致密，孔隙结构少于表面层。从图3-3看出，在放大1000倍观察腐蚀层时，腐蚀层也有团聚现象，团聚颗粒紧密的聚在一起，颗粒之间孔隙最小，聚集的最为紧密。从表面层、中间层、到腐蚀层，总体上来说孔径逐渐减小，颗粒聚集的越来越紧密。3.1.2生长环比表面积分析用比表面积分析法分析生长环的表面层、中间层和腐蚀层的比表面积和孔径分布，得到各层的氮气吸附—脱附等温线和孔径分布图，具体结果见图3-4—3-15。图3-4生长环表面层的N2吸附-脱附等温线图图3-5生长环表面层的比表面积分析图29 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图3-6生长环表面层吸附的孔体积分布图图3-7生长环表面层脱附的孔体积分布图从图3-4可以看出，生长环表面层的N2吸附-脱附等温线之间存在偏差没能完全重合，这个现象说明了生长环表面层的物理等温吸附过程是不可逆的，被吸附的气体都附着在生长环表面层的孔隙里。从图3-6—图3-7可以看出，生长环表面层，无论是在对气体的吸附还是脱附的过程中，它的孔体积随着孔径的变小而展现出增大的趋势，而且孔径的大小在:17.000Ǻ-3000.000Ǻ之间。采用BJH和BET方法分析测试的数据结果，得出生长环表面层的BET比表面积2是97.2687m/g，生长环表面层吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分223布分别为：67.160m/g和78.9835m/g、78.533Ǻ和69.511Ǻ、0.131857cm/g和30 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文30.137256cm/g，见表3-1。表3-1表面层的比表面积和孔径23类型比表面积分布（m/g）孔径分布（Ǻ）孔体积分布（cm/g）吸附67.16078.5330.131857脱附78.983569.5110.137256图3-8生长环中间层的N2吸附-脱附等温线图图3-9生长环中间层的比表面积分析图31 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图3-10生长环中间层吸附的孔体积分布图图3-11生长环中间层脱附的孔体积分布图从图3-8可以看出，生长环表面层的N2吸附-脱附等温线之间存在偏差没能完全重合，这个现象说明了生长环表面层的物理等温吸附过程是不可逆的，被吸附的气体都附着在生长环表面层的孔隙里。从图3-10—图3-11可以看出，生长环表面层，无论是在对气体的吸附还是脱附的过程中，它的孔体积随着孔径的变小而展现出增大的趋势，而且孔径的大小在:17.000Ǻ-3000.000Ǻ之间。采用BJH和BET方法分析测试的数据结果，得出生长环中间层的BET比表面积2是63.11173m/g，生长环表面层吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分32 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文223布分别为：41.727m/g和49.1365m/g、68.546Ǻ和61.127Ǻ、0.071505cm/g和30.075090cm/g，见表3-2。表3-2中间层的比表面积和孔径23比表面积分布（m/g）孔径分布（Ǻ）孔体积分布（cm/g）吸附41.72768.5460.071505脱附49.136561.1270.075090图3-12生长环腐蚀层的N2吸附-脱附等温线图图3-13生长环腐蚀层的比表面积分析图33 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图3-14生长环腐蚀层吸附的孔体积分布图图3-15生长环腐蚀层脱附的孔体积分布图从图3-12可以看出，生长环腐蚀层的N2吸附-脱附等温线之间存在偏差没能完全重合，这个现象说明了生长环腐蚀层的物理等温吸附过程是不可逆的，被吸附的气体都附着在生长环腐蚀层的孔隙里。从图3-14—图3-15可以看出，生长环腐蚀层，无论是在对气体的吸附还是脱附的过程中，它的孔体积随着孔径的变小而展现出增大的趋势，而且孔径的大小在:17.000Ǻ-3000.000Ǻ之间。采用BJH和BET方法分析测试的数据结果，得出生长环腐蚀层的BET比表面积2是53.4781m/g;，生长环腐蚀层吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分34 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文223布分别为：39.230m/g和46.8467m/g、66.695Ǻ和58.691Ǻ、0.065410cm/g和30.068737cm/g，见表3-3。表3-3腐蚀层的比表面积和孔径23比表面积分布（m/g）孔径分布（Ǻ）孔体积分布（cm/g）吸附39.23066.6950.065410脱附46.846758.6910.0687372从以上分析结果可以看出，BET比表面积表面层最大为97.2687m/g，中间层2次之，腐蚀层最小为53.4781m/g，表面层的比表面积近似达到腐蚀层的两倍。BJH吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分布，也是按照表面层、中间层、腐蚀层的顺序依次递减。表面层孔体积大，表面积大，有利于与管内的水进行物质能量的交换，适合异养菌的生长。中间层和腐蚀层表表面积和孔体积小有利于硫酸盐还原菌和铁细菌的生长。生长环的这种大比表面积和多孔隙的结构特征，使它成为了细菌滋生的温床，生长环的存在，对饮用水的水质安全是一个重要的挑战。有效的控制给水管中的生长环的生长，可以控制给水管中细菌生长的环境，减少细菌的数量，对保证饮用水水质安全具有重要的意义。3.2生长环的化学成分分析3.2.1生长环中总有机碳的测定生长环中的总有机碳（TOC）采用MAX(CNS)元素分析仪测得。通过测定，所取生长环样品中TOC为2.31%。3.2.2生长环中金属元素的测定用原子光谱仪测得所取生长环样品中的金属元素见表3-4。表3-4生长环中金属元素含量重金属名称CdCrFeMnPbZn含量（ug/g）5.256.256425002.0109.8514.05由表3-4可知，生长环中主要金属元素有：铁、铅、锌、铬、镉、锰。其中铁的含量最高达到了642500ug/g，铁主要来自于管道的电化学腐蚀和微生物腐蚀所产生的铁的腐蚀产物。35 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文3.2.3生长环X射线衍射分析采用X射线衍射仪对所取的生长环样品进行成分分析，所得的X射线衍射图谱见图3-16，分析结果见表3-5。表3-5XRD的分析结果CompoundNameFormulaY-ScaleS-Q纤铁矿（Lepidocrocite）γ-FeOOH13.2936%23.07%针铁矿（Goethite）α-FeOOH36.9436%76.93%图3-16生长环XRD分析图谱图由表3-5中的数据可以看出，生长环中的主要成分是针铁矿和纤铁矿，两者的含量分别是76.93%和23.07%。针铁矿的含量将近是纤铁矿含量的3倍。3.2.4生长环X射线荧光光谱分析生长环是由沉淀物、锈蚀物、生物膜和黏垢形成的混合体，生长环中含有许多种金属和非金属元素，为了探究生长环中所含元素的种类类和含量，对生长环进行X射线荧光光谱分析，具体数据见表3-6。X射线荧光光谱分析结果表明生长36 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文环中的主要元素是氧和铁，另外还有Si、S、Mg、Ca、Al、Mn等元素。表3-6X射线荧光光谱分析结果分析元素浓度（%）分析化合物浓度（%计算方法Fe24.032Fe2O345.386计算O29.334——计算Si1.232SiO23.021计算Ca0.216CaO0.361计算Mn0.093MnO0.153计算Mg0.124MgO0.236计算Al0.221Al2O30.486计算S0.025SO30.084计算P0.063P2O50.166计算K0.032K2O0.045计算Ti0.059TiO20.114计算Zn0.061ZnO0.105计算Na0.134Na2O0.214计算Cl0.042——计算总和56.312总和50.625—从表中可以看出，生长环中主要元素是氧和铁分别占24.032%和29.334%，接近1:1，另外还含有硅、钙、锰、镁、铝、硫、磷、钾、锌等元素。由于水厂在水处理时投加混凝剂的原因，生长环中有铝。氯元素可能是由于消毒剂的投放造成的。Si主要是水中的携带的砂砾，经过管道的沉淀后，留在生长环中。生长环中化合物和元素所占的比重分别为50.625%和56.312%，两者比例将近1:1,生长环中的化合物以铁的氧化物为主，主要是Fe2O3，含量高达45.386%，这个结果与生长环的X射线衍射分析的结果—生长环主要是由针铁矿和纤铁矿组成，相吻合。生长环中还含有少量的Al2O3和SiO2化合物。生长环中Al2O3存在的原因可能是水厂在水处理时投加的混凝剂，有少量随出厂水进入到了给水管网中，经过一系列的反应最终留在生长环中，成为了生长环的一部分。SiO2主要是由于给水管网水流中携带的砂砾和泥沙经过长时间的沉淀，留在了给水管底，经过长年的运行，日积月累成为了生长环的一部分。37 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文3.2.5生长环胞外聚合物表面官能团分析生长环是由沉淀物、锈蚀物、生物膜和黏垢形成的混合体，生长中含有许多种类有机物，如蛋白质、糖类、核酸等，不同的有机物中含有不同的官能团，对生长环样品进行傅里叶变换红外光谱分析，从红外光谱图中，可以获得分子中的化学键或官能团信息，生长环的红外光谱图见图3-17。54.3525048464442401631.32383634%T3230281023.30797.6326891.642422203137.30181614462.9911.64000.03600320028002400200018001600140012001000800600400.0CM-1图3-17生长环红外光谱图用傅里叶变换红外光谱对所取的生长环样品进行分析，以确定生长环中所含-1物质的化学键和官能团。通过对所得的光谱进行分析，生长环在3137.3cm和-11631.32cm处，出现了强的款峰，结合专家学者总结的表面基团所对应的红外谱-1-1线可知，在3400~3000cm的区间内3137.3cm处出现的峰，是因为-OH的伸缩-1-1振动形成的；在1640~1400cm区间内1631.32cm处出现的峰，是由于H-O-H的-1-1-1变形振动形成的。同时生长环的红外光谱在1023.30cm、891.64cm和797.63cm三处出现了峰值尖锐的特征吸收峰，查阅文献得知，FeOOH的特征吸收峰在-11100~450cm区间内，这与生长环的X射线衍射光谱分析得出的结论—生长环的主要成分是针铁矿（α-FeOOH）和纤铁矿（γ-FeOOH），相吻合。3.2.6生长环胞外聚合物中多糖和蛋白质含量的测定38 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文实验测得胞外聚合物中多糖含量为1.852mg/ml，蛋白质含量为1.274mg/ml。3.3本章小结本章以给水管网中的生长环为研究对象，将生长环按照剖面的纵向分布分为表面层、中间层和腐蚀层，对各层进行物理和化学组成分析。得出以下结论：（1）生长环表面层、中间层和腐蚀层孔径的大小在:17.000Ǻ-3000.000Ǻ2之间。生长环表面层、中间层和腐蚀层的BET比表面积分别为：97.2687m/g、2263.11173m/g、53.4781m/g。BJH吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分布，按照表面层、中间层、腐蚀层的顺序依次递减。（2）所取生长环样品中TOC为2.31%。生长环中主要金属元素有：铁、铅、锌、铬、镉、锰，其中铁的含量最高达到了642500ug/g。（3）由X射线衍射分析得出，生长环的主要成分是针铁矿和纤铁矿，两者的含量分别是76.93%和23.07%，针铁矿的含量将近是纤铁矿含量的3倍。（4）X射线荧光光谱分析结果表明生长环中的主要元素是氧和铁，分别占24.032%和29.334%，接近1:1。（5）对生长环中胞外聚合物进行分析，测得胞外聚合物中多糖含量为1.852mg/ml，蛋白质含量为1.274mg/ml。39 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文第4章生长环中微生物种群的特异性研究在供水管网生长环的形成过程中，微生物起到重要的作用。铁细菌、硫酸还原菌、硝酸还原菌等微生物分泌的胞外聚合物是生长环重要的组成部分。微生物一部分以生物膜的形式附着在生长环表面，一部分生长在生长环的中间层和腐蚀层。高通量测序是近年较为热门的分子生物学研究手段，测序结果可以获得大量的生物学信息，准确全面地反映微生物种群数量特征。以生长环表面层、中间层和腐蚀层中的微生物为研究对象，采用高通量测序的手段对生长环各层中微生物种群结构的特性进行研究，分别从多样性、差异性和群落组成等几个方面对生长环各层中的微生物进行研究。4.1细菌总数细菌计数的常用方法有MNP法和平板计数法，实验采用平板计数法，选择R2A培养基，对生长环中的细菌数进行测量，测量细菌总数的结果为：9×710CFU/ml。4.2生长环中DNA提取及PCR把采集的DNA样品放置在-80℃的低温冰箱中冷冻保存，使用时，先在常温下解冻，然后把DNA样品加入到10ml的离心管中，在8000r/min的转速下，离心5分钟。离心后倒掉上清液，提取有效的DNA。本实验一共选取3个不同位置的生物样本进行研究，生长环表面层、生长环中间层和生长环腐蚀层，分别编为：1、2、3号。成功提取DNA后用NanoDrop2000对所提取DNA的浓度和纯度进行检测，用琼脂糖凝胶电泳对DNA完整性进行检测，并对提取的DNA做PCR扩增，DNA的检测结果见表4-1和图4-1。表4-1DNA检测结果序号浓度（ng/μL）OD260/230OD260/280检测结果17.20.041.94A220.90.041.53A312.40.461.92A40 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图4-1DNA琼脂糖凝胶电泳图实验采用515F和907R作为DNA的引物来进行PCR扩增，以细菌16sRNA作为目标序列。为保证后续数据分析的准确可靠，严格控制实验条件：尽可能的使用低循环数进行PCR扩增；保证每个样品进行PCR扩增时循环数统一。随机选取20个样品进行预实验，通过对预实验结果进行分析，确定正式实验时的反应参数。正式实验时PCR扩增采用TransGenAP221-02，TransStartFastpfuDNAPolymerase，20μL反应体系。PCR反应体系各引物和药品的用量见表4-2。表4-2PCR反应体系试剂用量10×buffer2μL2.5mMdNTPs2μL正引物0.8μL反引物0.8μLrTaq聚合酶0.2μL血清蛋白0.2μLDNA模板10ng无菌水补至20μL41 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文4.3生长环中微生物多样性分析本实验对样品所有的OTU在97%的相似水平下聚类，进行生物学统计分析。选取多个能够反映微生物丰富度和多样性的统计学指标。生态学中常用的估计物种总数的指标有Chao和Ace，它们都以样本的OTU数据为基础，两者的区别是所采用的算法不同。常用作反映微生物群落多样性的指标有Shannon和Simpson，Shannon的数值越大，微生物群落的多样性越高，Simpson反映了群落结构中优势菌种的优势度，Simpson的数值越大，生物多样性就越低。Coverage反映样本基因组文库的覆盖率，数值越大，样本中序列被检测出的概率越大。具体结果见表4-3。表4-3样品多样性指数表测序数据样品编号OTUAceChaoShannonSimpsonCoverage量1392711107120012055.530.01180.9972112352161107122812285.360.01350.9959163272711051117911945.440.01090.992424[80]稀释性曲线以样本OTU数量作为纵坐标，选取随机抽取的样本测序数据量作为横坐标，能够说明样本测序数据的合理性，可以反映测序的数据量对样本中的丰富的影响。当曲线趋于水平时，说明增加测序数据产生新的OTU的数量较少，选取的测序数据量比较合理；反之说明增加测序数据量可以产生比较多的新的OTU，测序结果不准确。所以通过对稀释性曲线的分析，可以看出样本的测序是否合理。样品的稀释性曲线见图4-2。图4-2样品的稀释性曲线42 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文[81]Rank-abundanc曲线是分析物种的多样性和均匀度的方法之一。在一个单一的样本中，把OTU按照丰度由大到小的顺序排序，选取每个OTU中所含的序列数作为纵坐标，选取OTU的等级作为横坐标。Rank-abundance曲线不仅可以反映物种丰富的变化，还能够表征物种的均匀度。曲线的宽度表征物种的丰富度，曲线在水平方向宽度越大，则物种的丰富度越高；同时曲线的平滑程度表征物种的均匀度，曲线越平缓表明物种在所测样品当中分布的越均匀。样品的Rank-abundanc曲线见图4-3。图4-3样品Rank-abundance曲线通过对样品的多样性指数表、稀释性曲线和Rank-abundance曲线的分析发现，所选用的多样性指数得出的结论一致，并且与Rank-abundance曲线和稀释性曲线的结论相吻合。1号样本OTU数为1107,2号样品OTU数为1107,3号样品OTU数为1051，说明三者的生物多样性差不多，同时也反映了生长环表面层、中间层和腐蚀层的微生物群落结构比较稳定，这也与实际情况相符生长环是经过长年累月才生长出来的，其上生长繁殖的微生物，无论是在种类还是在数量上都比较稳定。三者的Ace和Chao指数数值相差不大比较接近，3号样品的Ace和Chao指数在三者中最低，2号样品的Ace和Chao指数最大，说明相当来讲生长环中间层的生物多样性高些，生长环腐蚀层的生物多样性低些。样品的Shannon指数分别为5.53、5.36、5.44所反映的结果与Ace和Chao指数相同。4.4生长环中微生物的差异性分析43 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文[82]OTU分布Venn图是选取OTU数量作为研究对象，直观地显示出各个生物样本共有的OTU数量和独有的OTU数量。在OTU分布Venn图中，相互重叠的部分表示各个生物样本共同拥有的OTU，不重叠的部分表示各个生物样本独有的OTU。样品的OTU分布Venn图见图4-4。图4-4样品的OTU分布Venn图由图可知1号、2号、3号样品OTU的数量分别为1107、1107、1051。1、2、3号样品共有的OTU数量为772个，在1、2、3号样品中所占的比例分别为69.7%、69.7%、73.5%。表明生长环表面层、中间层和腐蚀层中的共有微生物种类很多，所占比例将近70%。1号和2号样品共有的OTU数量为957个，在总数中所占的比例分别为86.4%和86.4%。2号和3号样品共有的OTU数量866个，在总数中所占的比例分别为78.2%和82.4%。1号和3号样品共有的OTU数量为857个，在总数中所占的比例分别为77.4%和81.5%。从所得的数据可以看出生长环表面层和中间层共有的微生物种类达到86.4%，生长环的中间层和腐蚀层以及生长环的表面层和腐蚀层共有的微生物近似达到80%。1号、2号、3号样品独有OTU数量分别为65、56和100，在总数中所占的比例分别为5.87%、5.06%和9.51%。从数据可以看出，生长环表面层和中间层所独有的微生物种类很少，只占总数的5%左右，腐蚀层独有的微生种类相对多点占微生物总数的9%左右。从以上的分析结果可以看出，生长环的表面层、中间层和腐蚀层上的细菌绝44 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文大多数共有，种群结构比较稳定。[83]NMDS（非度量多维尺度分析）和PCA（主成分分析）是分析样本群落组成差异性和相似性的重要指标。PCA（主成分分析）通过对数据进行简化分析，有效找出数据中的主要结构和元素，样本中物种的组成越相似，PCA图中的距离就越近。样品的PCA分析见图4-5。NMDS分析通过将多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时保留对象间的原始关系。通过点与点之间的距离反映不同样本之间的差异程度，在样本的空间定位点图中，点与点之间的距离越近，差异越小。样品的NMDS分析见图4-6。图4-5样品的PCA分析图图4-6样品的NMDS分析图45 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文由图4-6可知1号、2号和3号样品之间的距离相隔都比较远，这说明在微生物种类上，虽然生长环表面层、中间层和腐蚀层有很多共同拥有的微生物，但各种类的微生物在各层上的数量有差异，导致在微生物群落结构组成各层差异特别明显。4.5生长环中微生物群落组成分析将所选的样本进行高通量测序之后，对所检测到的基因序列按各个微生物水平进行分析，本实验在门、纲、目、科、属五个水平，分别对生长环表面层、中间层和腐蚀层中的微生物的群落结构和组成进行分析，研究不同样本中微生物的种类及各种类微生物在各个样品中的相对丰度。4.5.1门水平分析将所选的样本进行高通量测序之后，对所检测到的基因序列在门水平进行分析，结果见图4-7。图4-7门水平生物群落结构分析图46 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文在所检测的3个样品当中，在门水平下对丰度在1%以上的微生物种类进行分析，主要由11个种类的细菌组成，分别是：变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门(Verrucomicrobia)、拟杆菌门(bacteroidetes)、蓝细菌门（Cyanobacteria）。其中丰度低于1%的细菌种类归为其他。从图4-7可以看出变形菌门（Proteobacteria）在1号、2号、3号样品中占绝对优势，在样品中的丰度分别为46.4%、47.5%、57.7%。变形菌能够分泌较多的[66]胞外聚合物，使微生物粘附给水管道内壁上形成生物膜。从图中可以看出无论是在生长环的表面层，中间层还是腐蚀层，变形菌都占有绝对优势，在腐蚀层中的占比最高达到了57.7%。有研究表明，变形菌门和污水中有机物的降解效果有很[84][85-86]大的关系。在污水和污泥的研究当中，变形菌通常和脱氮除磷有关。酸杆菌门（Acidobacteria）在1号、2号、3号样品中所占的比例分别为：15.7%、17.3%、10%，为第二高的细菌，在生长环的中间层含量最高为17.3%。绿弯菌门（Chloroflexi）在1号、2号、3号样品中的丰度分别为7.3%、8.7%、7.5%，差别很小。放线菌门(Actinobacteria)在1号、2号、3号样品中的占比分别为11.6%、8.8%、3%，在生长环的表面层含量最高为11.6%，在腐蚀层中含量最低为3%，差别很大，表面层中的含量将近腐蚀层中的4倍，其余微生物的相对丰度见表4-4。表4-4样品中微生物门水平相对丰度细菌名称1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度变形菌门46.4%47.5%57.7%酸杆菌门15.7%17.3%10%绿弯菌门7.3%8.7%7.5%放线菌门11.6%8.8%3%浮霉菌门5.8%4.2%4.3%47 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表4-4（续表）细菌名称1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度硝化螺旋菌门2.9%3.9%1.8%芽单胞菌门2.6%2.0%2.4%厚壁菌门1.0%1.6%3.6%疣微菌门1.8%1.9%1.4%拟杆菌门0.6%0.4%2.0%蓝细菌门0.1%0.3%1.3%4.5.2纲水平分析将所选的样本进行高通量测序之后，对所检测到的基因序列在纲水平进行分析，结果见图4-8。在所检测的3个样品当中，在纲水平下对丰度在1%以上的微生物种类进行分析，主要由17个种类的细菌组成，分别是：β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、酸杆菌纲(Acidobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、浮霉菌纲（Planctomycetacia）、硝化螺旋菌纲（Nitrospira）、KD4-96、芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）、厌氧绳菌纲（Anaerolineae）、祐菌纲(Opitutae)、梭菌纲(Clostridia)、蓝菌纲(Cyanobacteria)、P2-11E、拟杆菌纲(Bacteroidia)、Phycisphaerae，其中丰度低于1%的细菌种类归为其他。从图4-8可以看出：β-变形菌纲（Betaproteobacteria）在所测的3个样品中丰度最高，在1、2、3号样品中的占比分别为：18.6%、19.1%、22.1%，在2号和3号样品中优势菌种。在1号样品中α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）是优势菌种，占比为20.5%，在2号和3号中的占比分别为16.5%和15%。γ-变形菌纲在1、2、3号样品中的丰度分别为：3.1%、4.4%、8.9%，在3号样品中的含量最高。梭菌纲(Clostridia)只在3号样品中被检测到，丰度为2.7%。48 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图4-8纲水平生物群落结构分析图P2-11E只在1号和2号样品中被检测到，且在1号和2号中的占比分别为1.4%和0.1%。Phycisphaerae仅在3号样品中含有，丰度为1%，其余微生物的相对丰度见表4-5。表4-5样品中微生物纲水平相对丰度1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）β-变形菌纲18.619.122.1α-变形菌纲20.516.515酸杆菌纲15.717.310.1放线菌纲11.68.83.0δ-变形菌纲4.07.411.749 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表4-5（续表）1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）δ-变形菌纲4.07.411.7γ-变形菌纲3.14.48.9浮霉菌纲5.53.63.2硝化螺旋菌纲2.93.81.8KD4-962.03.12.2芽单胞菌纲2.63.91.8厌氧绳菌纲1.12.43.4祐菌纲1.81.91.4梭菌纲002.7蓝菌纲001.2P2-11E1.40.10拟杆菌纲00.11.2Phycisphaerae001.04.5.3目水平分析将所选的样本进行高通量测序之后，对所检测到的基因序列在目水平进行分析，结果见图4-9。在所检测的3个样品当中，在目水平下对丰度在1%以上的微生物种类进行分析，主要由16个种类的细菌组成，分别是：根瘤菌目（Rhizobiales）、亚硝化单胞菌目（Nitrosomonadales）、全噬菌目（Holophagales）、浮霉菌目(Planctomycetales)、兰克氏菌目（Frankiales）、甲基球菌目(Methylococcales)、Solibacterales、红环菌目（Rhodocyclales）、嗜氢菌目（Hydrogenophilales）、红螺菌目(Rhodospirillales)、Gaiellales、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、厌氧绳菌目（Anaerolineales）、梭菌目（Clostridiales）、脱硫菌目（Desulfuromonadales）、拟杆菌目(Bacteroidales)。其中丰度低于1%的细菌种类归为其他。50 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图4-9目水平生物群落结构分析图从图4-9可以看出，其中根瘤菌目（Rhizobiales）在所测样品中的丰度最大，占绝对优势，在1、2、3号样品中的丰度分别为：16.2%、13.3、11.9%，在三者中的丰度差别不大，在1号中丰度最高。亚硝化单胞菌目（Nitrosomonadales）在1、2、3号样品中的丰度分别为：8.6%、9.7%、10.2%。全噬菌目（Holophagales）在1、2、3号样品中的丰度分别为：5.0%、10.5%、3.9%，在三者中的差别明显，2号中的丰度最大。拟杆菌目(Bacteroidales)为3号样品所独有，且在3号样品中的丰度为1.1%，其余微生物的相对丰度见表4-6。表4-6样品中微生物目水平相对丰度1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）根瘤菌目16.213.311.9亚硝化单胞菌目8.69.710.2全噬菌目5.010.53.951 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表4-6（续表）1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）浮霉菌目5.53.63.2兰克氏菌目5.94.40.8甲基球菌目1.13.16.9Solibacterales5.12.33红环菌目2.83.13.4嗜氢菌目3.72.82.9红螺菌目2.92.82.6Gaiellales3.42.71.6芽单胞菌目2.62.02.4厌氧绳菌目1.12.43.4梭菌目0.10.12.6脱硫菌目0.20.12.9拟杆菌目000.14.5.4科水平分析将所选的样本进行高通量测序之后，对所检测到的基因序列，在科水平进行分析，结果见图4-10。在所检测的3个样品当中，在科水平下对丰度在1%以上的微生物种类进行分析，主要由23个种类的细菌组成，分别是：披毛菌科（Gallionellaceae）、全噬菌科(Holophagaceae)、甲基球菌科(Methylococcaceae)、浮霉状菌科（Planctomycetaceae）、孢鱼菌科（Sporichthyaceae）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）、红环菌科（Rhodocyclaceae）、嗜产菌科(Hydrogenophilaceae)、亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）、甲基球菌科（Methylococcaceae）、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）、厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、丛毛单胞菌科52 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文（Comamonadaceae）、丰祐菌科(Opitutaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、硫还原菌科(Desulfurellaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、泉发菌科(Crenotrichaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、地杆菌科（Geobacteraceae），其中丰度低于1%的细菌种类归为其他。图4-10科水平生物群落结构分析图在所检测的3个样品当中，在科水平下对丰度在1%以上的微生物种类进行分析，主要由23个种类的细菌组成，分别是：披毛菌科（Gallionellaceae）、全噬菌科(Holophagaceae)、甲基球菌科(Methylococcaceae)、浮霉状菌科（Planctomycetaceae）、孢鱼菌科（Sporichthyaceae）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）、红环菌科（Rhodocyclaceae）、嗜产菌科(Hydrogenophilaceae)、亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）、甲基球菌科（Methylococcaceae）、黄色杆53 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文菌科(Xanthobacteraceae)、芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）、厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、丰祐菌科(Opitutaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、硫还原菌科(Desulfurellaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、泉发菌科(Crenotrichaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、地杆菌科（Geobacteraceae），其中丰度低于1%的细菌种类归为其他。从图4-10可以看出在3个检测的样品中，披毛菌科（Gallionellaceae）的丰度最高，在1、2、3号样品中的丰度分别为：4.9%、7.6%、7.6%，且在3号样品中占有优势。全噬菌科(Holophagaceae)在1、2、3号样品中的占比分别为：5%、10.5%、3.9%，三者中的含量差别明显，在2号样品中含量最高，是2号样品中的优势菌。甲基球菌科(Methylococcaceae)在1、2、3号样品中的丰度分别为：5.5%、3.6%、3.2%。1号样品中的优势菌是孢鱼菌科（Sporichthyaceae），丰度为5.7%。脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、泉发菌科(Crenotrichaceae)、地杆菌科（Geobacteraceae）为3号样品所独有，在3号样品中的丰度分别为：2.4%、2.6%、2%、1.6%。地杆菌科（Geobacteraceae）以乙酸盐作为惟一碳源，以Fe（Ⅲ）为最终端电子受体，它的存在与上生长环腐蚀层的形成有很大关系。其余微生物的相对丰度见表4-7。表4-7样品中微生物科水平相对丰度1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）披毛菌科4.97.67.6全噬菌科5.010.53.9甲基球菌科5.05.03.6浮霉状菌科5.53.63.2孢鱼菌科5.74.30.1慢生根瘤菌科4.43.51.5红环菌科2.83.13.4嗜产菌科3.72.82.9亚硝化单胞菌3.72.12.6科54 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表4-7（续表）1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）甲基球菌科0.12.64.7黄色杆菌科2.42.02.7芽单胞菌科2.62.02.3厌氧绳菌科1.12.43.4脱硫弧菌科0.41.74.4丛毛单胞菌科1.62.21.7丰祐菌科1.81.91.4生丝微菌科1.90.71.8嗜甲基菌科1.20.12.6硫还原菌科1.20.80.7酸杆菌科1.30.92.0泉发菌科0.00.02.0根瘤菌科1.11.10.2地杆菌科0．00.01.64.5.5属水平分析将所选的样本进行高通量测序之后，对所检测到的基因序列，在属水平进行分析，结果见图4-11。在所检测的3个样品当中，在属水平下对丰度在1%以上的微生物种类进行分析，主要由18个种类的细菌组成，分别是：地发菌属（Geothrix）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）、Ferriphaselus、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、硝化螺菌属（Nitrospira）、Ferritrophicum、sulfuritalea、Bryobacter、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、Varibacter、丰祐菌属（Opitutus）、披毛菌属（Gallionella）、生丝微菌属（Hyphomicrobium）、铁氧化属细菌（Sideroxydans）、嗜甲基菌属（Methylotenera）、泉发菌属（Crenothrix）、地杆菌属（Geobacter）、Denitratisoma属，其中丰度低于1%的细菌种类归为其他。从图4-11中可以看出，宏观上看1、2、3号样品中都没有占绝对优势的菌种，1号和2号样品中微生物的种类比3号样品中多。55 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图4-11属水平生物群落结构分析图在3个样品中丰度最高的为地发菌属（Geothrix），在1、2、3号样品中的丰度分别为：4.7%、9.3%、3.6%。1号样品中占比相对高点的细菌有：甲基孢囊菌属（Methylocystis）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、Ferritrophicum，在1号样品中的丰度分别为：5%、4.3%、3.6%。2号样品中占比相对高点的细菌有：甲基孢囊菌属（Methylocystis）、Ferriphaselus、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、硝化螺菌属（Nitrospira），在2号样品中的丰度分别为:5.1%、3.3%、3.5%、3.9%。3号样品中占比相对高点的细菌有：甲基孢囊菌属（Methylocystis）、Ferriphaselus、脱硫弧菌属（Desulfovibrio），在2号样品中的丰度分别为:3.6%、4.9%、4.4%。脱硫弧菌属（Desulfovibrio）能够利用给水管道内壁表层的有机物作为碳源，把硫酸盐还原成硫化氢，加快金属给水管的腐蚀，它是硫酸盐还原菌的一种。3号样品中独有的菌种为：嗜甲基菌属（Methylotenera）、泉发菌属（Crenothrix）、地杆菌属（Geobacter）、Denitratisoma属，在3号样品中的丰度分别为：2%、2%、1.5%、1.4%。其余微生物的相对丰度见表4-8。56 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表4-8样品中微生物属水平相对丰度1号样品中相对丰度2号样品中相对丰度3号样品中相对丰度细菌名称（%）（%）（%）地发菌属4.79.33.6甲基孢囊菌属5.05.13.6Ferriphaselus1.63.34.9慢生根瘤菌属4.33.51.4硝化螺菌属2.93.91.8Ferritrophicum3.62.22.1sulfuritalea2.73.01.9Bryobacter3.81.22.0脱硫弧菌属0.11.74.4Varibacter1.41.32.4丰祐菌属1.81.91.4披毛菌属1.01.61.6生丝微菌属1.00.51.2铁氧化属细菌1.11.10.5嗜甲基菌属0.00.02.5泉发菌属0.00.02.0地杆菌属0.00.01.5Denitratisoma属0.00.01.4在检测到的所有微生物种类中，与管道腐蚀密切相关的细菌主要有硝酸盐还原菌（NitrateReducingBacteria）和铁细菌（IronRespringBacteria）两类。铁细菌有2个种：Sediminibacterium和披毛菌属（Gallionella）。在样品中仅检测到披毛菌57 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文属（Gallionella），在1、2、3号样品中的占比分别为：1%、1.6%、1.6%。总的来说铁细菌在样品中的丰度不大，主要是因为铁细菌是自养好氧型细菌，当环境中缺氧时，铁细菌很难生存。另外一种与管道腐蚀密切相关的微生物种类是硝酸盐还原菌，现在已知的硝[87]酸盐还原菌大约有50多种，130多个属。一些种类的硝酸盐还原菌在生长繁殖[88]的过程中能够产生产铁的载体（siderophore），与铁在不同价态之间的转化密切相关。在三个样品中检测出的硝酸盐还原菌有：慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、硝化螺菌属（Nitrospira）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）。硝酸盐还原菌的相对丰度在各样品中的相对丰度见表图4-9。表4-9各样品中硝酸盐还原菌的相对丰度细菌名称相对丰度（1号）相对丰度（2号）相对丰度（3号）慢生根瘤菌属4.3%3.5%4.9%硝化螺菌属2.9%3.9%1.8%脱硫弧菌属0.1%1.7%4.4%4.6层次聚类分析和Heatmap图采用bray-curtis算法，在门水平下对样品中的微生物群落进行层次聚类分析，结果见图3-30，从图中可以看出1号和2号样品的相似度相对要高些。Heatmap图将样本间物种的丰度分布差异通过颜色加以区分，直观的显示样品中微生物群落结构的差异性。样品的Heatmap图见图4-13从左到右的三列分别表示3号、1号、2号样品的检测结果。图4-12群落聚类分析图58 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图4-13样本Heatmap分析图4.7本章小结本章以给水管网中的生长环为研究对象，将生长环按照剖面的纵向分布分为表面层、中间层和腐蚀层，对各层进行物理和化学组成分析，应用微生物分析方法，研究了各层微生物的种群结构。得出以下结论：7（1）实验对生长环中的细菌总数进行了测量测得的结果为：9×10CFU/ml。（2）所取样品生长环表面层、中间层和腐蚀层中的OTU的数量分别为1107、1107、1051。表面层、中间层和腐蚀层样品共有的OTU数量为772个，在表面层、中间层和腐蚀层中所占的比例分别为69.7%、69.7%、73.5%。表明生长环表面层、中间层和腐蚀层中的共有微生物种类很多，所占比例将近70%。（3）在属水平下所取生长环样品各层微生物群落主要由地发菌属（Geothrix）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）、Ferriphaselus、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、硝化螺菌属组成。表面层、中间层和腐蚀层中没有占绝对优势的菌种，腐蚀层中独有的菌种为：嗜甲基菌属（Methylotenera）、泉发菌属（Crenothrix）、地杆菌属（Geobacter）、Denitratisoma属，在腐蚀层中的丰度分别为：2%、2%、1.5%、1.4%。样品中检测到与管道腐蚀密切相关的细菌有铁细菌和硝酸盐还原菌。59 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文第5章有机物对生长环中微生物胞外聚合物的影响实验选取饮用水中最常见的三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，以筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物作为研究对象，分析这三类饮用水中最常见的有机污染物在不同浓度下对筛选出的生长环中微生物胞外聚合物EPS的影响，这三类有机物的浓度设置以国家饮用水水质指标中规定的浓度为上限，国家饮用水水质指标中规定水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯的最高浓度分别为：0.02mg/L、0.06mg/L、0.003mg/L。实验时每种有机物设计三个浓度梯度，分析有机物对胞外聚合物中的多糖含量，蛋白质的含量以及胞外聚合物总量的影响。5.1有机物对生长环中微生物胞外聚合物中多糖的影响研究水中三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，在不同浓度下对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中多糖含量的影响。A、B组实验中胞外聚合物中多糖含量测定结果见表5-1和图5-1。表5-1AB组胞外聚合物中多糖含量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌多糖含量（mg/ml）10.0051.525A20.01铁细菌1.62630.021.713二氯甲烷10.0052.052B20.01异养菌2.08630.022.16760 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图5-1AB组胞外聚合物中多糖含量从表5-1可以看出随着水中二氯甲烷浓度的增加，A组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从1.525mg/ml上升到1.713mg/ml。从图5-1可以看出，图中后部分线段突然变缓，斜率减小，说明A组2号到3号水中二氯甲烷浓度从0.01mg/L增加到0.02mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中二氯甲烷浓度从0.005mg/L增加到0.01mg/L时，增速减慢。从表5-1可以看出随着水中二氯甲烷浓度的增加，B组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从2.052mg/ml上升到2.167mg/ml，增幅比较小。从图5-1可以看出，图中两段线段基本在一条直线上，斜率变化不明显，说明B组2号到3号水中二氯甲烷浓度从0.01mg/L增加到0.02mg/L时，胞外聚合物中多糖含量和从1号到2号水中二氯甲烷浓度从0.005mg/L增加到0.01㎎/L时，增速差不多。C、D组实验中胞外聚合物中多糖含量测定结果见表5-2和图5-2。表5-2CD组胞外聚合物中多糖含量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌多糖含量（mg/ml）10.021.883C氯仿铁细菌20.041.97561 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表5-2(续表)组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌多糖含量（mg/ml）C30.06铁细菌2.13210.022.172氯仿D20.04异养菌2.25330.062.381图5-2CD组胞外聚合物中多糖含量从表5-2可以看出随着水中氯仿浓度的增加，C组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从1.883mg/ml上升到2.132mg/ml。从图5-2可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率增大，说明C组2号到3号水中氯仿浓度从0.04㎎/L增加到0.06mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中水中氯仿浓度从0.02mg/L增加到0.04mg/L时，增速加快。从表5-2可以看出随着水中氯仿浓度的增加，D组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从2.172mg/ml上升到2.381mg/ml。从图5-2可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率增大，说明D组2号到3号水中氯仿浓度从0.04mg/L62 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文增加到0.06mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中氯仿浓度从0.02mg/L增加到0.04mg/L时，增速加快。E、F组实验中胞外聚合物中多糖含量测定结果见表5-3和图5-3。表5-3EF组胞外聚合物中多糖含量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌多糖含量（mg/ml）10.0012.144E20.002铁细菌2.26330.0032.476邻苯二甲酸二丁酯10.0012.583F20.002异养菌2.62130.0032.683图5-3EF组胞外聚合物中多糖含量从表5-3可以看出随着水中邻苯二甲酸二丁酯浓度的增加，E组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从2.144mg/ml上升到2.476mg/ml。从图5-3可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率明显增大，说明E组2号到3号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.002mg/L增加到0.003mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比63 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文从1号到2号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.001mg/L增加到0.002mg/L时，增速加快。从表5-3可以看出随着水中邻苯二甲酸二丁酯浓度的增加，F组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从2.583mg/ml上升到2.683mg/ml。从图5-3可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率增大，说明F组2号到3号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.002mg/L增加到0.003mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.001mg/L增加到0.002mg/L时，增速加快。5.2有机物对生长环中微生物胞外聚合物中蛋白质的影响研究水中三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，在不同浓度下对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中蛋白含量的影响。A、B组实验中胞外聚合物中蛋白质含量测定结果见表5-4和图5-4。表5-4AB组胞外聚合物中蛋白质含量测定结果蛋白质含量组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌（mg/ml）10.0051.171A20.01铁细菌1.19230.021.266二氯甲烷10.0051.495B20.01异养菌1.56330.021.686从表5-4可以看出随着水中二氯甲烷浓度的增加，A组胞外聚合物中的蛋白质含量总体呈增长的趋势，从1.171mg/ml上升到1.266mg/ml。从图5-4可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率突然变大，说明A组2号到3号水中二氯甲烷浓64 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文度从0.01mg/Ll增加到0.02mg/L时，胞外聚合物中蛋白质含量比从1号到2号水中二氯甲烷浓度从0.005mg/L增加到0.01mg/L时，增速变大。图5-4AB组胞外聚合物中多蛋白质含量从表5-4可以看出随着水中二氯甲烷浓度的增加，B组胞外聚合物中的蛋白质含量总体呈增长的趋势，从1.495mg/ml上升到1.686mg/ml。从图5-4可以看出，图中两段线段基本在一条直线上，斜率变化不明显，说明B组2号到3号水中二氯甲烷浓度从0.01mg/L增加到0.02mg/L时，胞外聚合物中蛋白质含量和从1号到2号水中二氯甲烷浓度从0.005mg/L增加到0.01mg/L时，增速差不多。C、D组实验中胞外聚合物中蛋白质含量测定结果见表5-5和图5-5。表5-5CD组胞外聚合物中蛋白质含量测定结果组号有机物名称编号浓度（mg/l）接种细菌蛋白质含量（mg/ml）10.021.395C2氯仿0.04铁细菌1.47630.061.53765 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表5-5（续表）组号有机物名称编号浓度（mg/L）接种细菌蛋白质含量（mg/ml）10.021.873D2氯仿0.04异养菌1.94630.062.131图5-5CD组胞外聚合物中蛋白质含量从表5-5可以看出随着水中氯仿浓度的增加，C组胞外聚合物中的蛋白质含量总体呈增长的趋势，从1.395mg/ml上升到1.537mg/ml。从图5-5可以看出，图中后部分线段变缓，斜率稍微变小，两段线段近似的在一条直线上，说明C组2号到3号水中氯仿浓度从0.04mg/L增加到0.06mg/L时，胞外聚合物中蛋白质含量和从1号到2号水中水中氯仿浓度从0.02mg/L增加到0.04mg/L时，增速相近，差异不明显。从表5-5可以看出随着水中氯仿浓度的增加，D组胞外聚合物中的蛋白质含量总体呈增长的趋势，从1.873mg/ml上升到2.131mg/ml。从图5-5可以看出，图中66 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文后部分线段突然变陡，斜率增大，说明D组2号到3号水中氯仿浓度从0.04mg/L增加到0.06mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中氯仿浓度从0.02mg/L增加到0.04mg/L时，增速加快。E、F组实验中胞外聚合物中蛋白质含量测定结果见表5-6和图5-6。表5-6EF组胞外聚合物中蛋白质含量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌多糖含量（mg/ml）10.0011.852E20.002铁细菌1.87330.0032.146邻苯二甲酸二丁酯10.0012.343F20.002异养菌2.43730.0032.461图5-6EF组胞外聚合物中蛋白质含量从表5-6可以看出随着水中邻苯二甲酸二丁酯浓度的增加，E组胞外聚合物中的蛋白质含量总体呈增长的趋势，从1.852mg/ml上升到2.146mg/ml。从图5-6可67 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率显著增大，近似成陡直，说明E组2号到3号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.002mg/L增加到0.003mg/L时，胞外聚合物中蛋白质含量比从1号到2号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.001mg/L增加到0.002mg/L时，增速显著加快。从表5-6可以看出随着水中邻苯二甲酸二丁酯浓度的增加，F组胞外聚合物中的蛋白质含量总体呈增长的趋势，从2.343mg/ml上升到2.461mg/ml。从图5-6可以看出，图中后部分线段突然变缓，斜率变小，说明F组2号到3号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.002mg/L增加到0.003mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.001mg/L增加到0.002mg/L时，增速变慢。5.3有机物对生长环中微生物胞外聚合物总量的影响研究水中三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，在不同浓度下对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物总量的影响。A、B组实验中胞外聚合物总含量测定结果见表5-7和图5-7。表5-7AB组EPS总量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌EPS含量（mg/l）10.0052.696A20.01铁细菌2.80830.022.979二氯甲烷10.0053.547B20.01异养菌3.64930.023.85368 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文图5-7AB组胞外聚合物总含量从表5-7可以看出随着水中二氯甲烷浓度的增加，A组胞外聚合物含量总体呈增长的趋势，从2.696mg/ml上升到2.979mg/ml。从图5-7可以看出，图中两段线段基本在一条直线上，斜率变化不明显，说明A组2号到3号水中二氯甲烷浓度从0.01mg/L增加到0.02mg/L时，胞外聚合物中多糖含量和从1号到2号水中二氯甲烷浓度从0.005mg/L增加到0.01mg/L时，增速差不多。从表5-7可以看出随着水中二氯甲烷浓度的增加，B组胞外聚合物含量总体呈增长的趋势，从3.547mg/ml上升到3.853mg/ml。从图5-7可以看出，图中两段线段基本在一条直线上，斜率变化不明显，说明B组2号到3号水中二氯甲烷浓度从0.01mg/L增加到0.02mg/L时，胞外聚合物中多糖含量和从1号到2号水中二氯甲烷浓度从0.005mg/L增加到0.01mg/L时，增速相差不大。C、D组实验中胞外聚合物总含量测定结果见表5-8和图5-8。表5-8CD组EPS总量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌EPS含量（mg/ml）C1氯仿0.02铁细菌3.27869 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文表5-8（续表）组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌EPS含量（mg/ml）20.043.451C铁细菌30.063.6691氯仿0.024.045D20.04异养菌4.19930.064.512图5-8CD组胞外聚合物总含量从表5-8可以看出随着水中氯仿浓度的增加，C组胞外聚合物含量总体呈增长的趋势，从3.278mg/ml上升到3.669mg/ml。从图5-8可以看出，图中后断线段略有变陡，但不明显两段线段基本在一条直线上，斜率变化不明显，说明C组2号到3号水中氯仿浓度从0.04mg/L增加到0.06mg/L时，胞外聚合物中多糖含量和从1号到2号水中氯仿浓度从0.02mg/L增加到0.04mg/L时，增速差不多。从表5-8可以看出随着水中氯仿浓度的增加，D组胞外聚合物总含量总体呈增70 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文长的趋势，从4.045mg/ml上升到4.512mg/ml。从图5-8可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率增大，说明D组2号到3号水中氯仿浓度从0.04mg/L增加到0.06mg/L时，胞外聚合物中多糖含量比从1号到2号水中氯仿浓度从0.02mg/L增加到0.04mg/L时，增速加快。E、F组实验中胞外聚合物总含量测定结果见表5-9和图5-9。表5-9EF组EPS总量测定结果组号编号有机物名称浓度（mg/L）接种细菌EPS含量（mg/ml）10.0013.996E20.002铁细菌4.13630.0034.622邻苯二甲酸二丁酯10.0014.926F20.002异养菌5.05830.0035.144图5-9EF组胞外聚合物总含量71 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文从表5-9可以看出随着水中邻苯二甲酸二丁酯浓度的增加，E组胞外聚合物中的多糖含量总体呈增长的趋势，从3.966mg/ml上升到4.622mg/ml。从图5-9可以看出，图中后部分线段突然变陡，斜率显著增大，说明E组2号到3号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.002mg/L增加到0.003mg/L时，胞外聚合物总含量比从1号到2号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.001mg/L增加到0.002mg/L时，增速加快。从表5-9可以看出随着水中邻苯二甲酸二丁酯的增加，F组胞外聚合物含量总体呈增长的趋势，从4.926mg/ml上升到5.144mg/ml。从图5-9可以看出，图中后部分线段略有变缓，斜率变小，说明F组2号到3号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.002mg/l增加到0.003mg/L时，胞外聚合物总含量比从1号到2号水中邻苯二甲酸二丁酯浓度从0.001mg/L增加到0.002mg/L时，增速减慢。5.4本章小结本章以铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物EPS为研究对象，探究饮用水中最常见的三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，在不同浓度下，对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中多糖、蛋白质以及胞外聚合物总量的影响。得出以下结论：（1）由于给水管网中属于贫营养环境，实验中水中添加的三类有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯浓度很低，所以铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中无论是多糖含量、蛋白质含量还是胞外聚合物总量都比较低。（2）水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯三类有机物对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中多糖的影响，随着水中有机物浓度的增加，胞外聚合物中的多糖含量呈增长趋势。（3）水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯三类有机物对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中蛋白质的影响，随着水中有机物浓度的增加，胞外聚合物中的蛋白质含量增多。（4）水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯三类有机物对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物总量的影响，随着水中有机物浓度的增加，胞外聚合物总含量增加。72 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文结论本文对给水管网中的生长环的组成进行了研究，将生长环按剖面纵向分为表面层、中间层和腐蚀层。对生长环中的有机碳进行了测量，用扫描电镜，BET测试对生长环各层的形貌结构以及比表面积和孔径进行了观察，用原子吸收仪对生长环中的金属污染物进行了测量，用X射线衍射光谱分析了生长环的主要成分，用X射线荧光光谱分析生长环中的微量元素的种类和含量，用红外光谱分析了生长环中的化学键和官能团信息，同时测得了生长环中胞外聚合物中多糖和蛋白质的含量。应用分子微生物技术对生长环各层中的微生物在门、纲、目、科、属水平下进行了微生物种群结构研究，并从生长环中分离得到了异养菌和纯种的铁细菌，为后续实验准备了材料，实验选取饮用水中最常见的三种有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯，以筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物作为研究对象，分析这三类饮用水中最常见的有机污染物在不同浓度下对筛选出的铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物EPS的影响。得出以下主要结论：（1）生长环表面层、中间层和腐蚀层孔径的大小在:17.000Ǻ-3000.000Ǻ之间。生长环表面层、中间层和腐蚀层的BET比表面积分别为：97.2687222m/g、63.11173m/g、53.4781m/g。BJH吸附和脱附的比表面积分布、孔径分布和孔体积分布，按照表面层、中间层、腐蚀层的顺序依次递减。（2）所取生长环样品中TOC为2.31%。生长环中主要金属元素有：铁、铅、锌、铬、镉、锰，其中铁的含量最高达到了642500ug/g。由X射线衍射分析得出，生长环的主要成分是针铁矿和纤铁矿，两者的含量分别是76.93%和23.07%，针铁矿的含量将近是纤铁矿含量的3倍。X射线荧光光谱分析结果表明生长环中的主要元素是氧和铁，分别占24.032%和29.334%，接近1:1。对生长环中胞外聚合物进行分析，测得胞外聚合物中多糖含量为1.852mg/ml，蛋白质含量为1.274mg/ml。（3）所取样品生长环表面层、中间层和腐蚀层中的OTU的数量分别为1107、1107、1051。表面层、中间层和腐蚀层样品共有的OTU数量为772个，在表面层、中间层和腐蚀层中所占的比例分别为69.7%、69.7%、73.5%。表明生长环表面层、中间层和腐蚀层中的共有微生物种类很多，所占比例将近70%。73 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文（4）在属水平下所取生长环样品各层微生物群落主要由地发菌属（Geothrix）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）、Ferriphaselus、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、硝化螺菌属组成。表面层、中间层和腐蚀层中没有占绝对优势的菌种，腐蚀层中独有的菌种为：嗜甲基菌属（Methylotenera）、泉发菌属（Crenothrix）、地杆菌属（Geobacter）、Denitratisoma属，在腐蚀层中的丰度分别为：2%、2%、1.5%、1.4%。样品中检测到与管道腐蚀密切相关的细菌有铁细菌和硝酸盐还原菌。（5）由于给水管网中属于贫营养环境，实验中水中添加的三类有机物二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯浓度很低，所以铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中无论是多糖含量、蛋白质含量还是胞外聚合物总量都比较低。（6）水中二氯甲烷、氯仿、邻苯二甲酸二丁酯三类有机物对铁细菌和异养菌分泌的胞外聚合物中多糖、蛋白质和胞外聚合物总含量的影响，随着水中有机物浓度的增加，胞外聚合物中的多糖含量、蛋白质含量和胞外聚合物总含量呈增长趋势。74 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文参考文献[1]LiX,LinP,WangJ,etal.Treatmenttechnologiesandmechanismsforthreeodorantsattracelevel:IPMP,IBMP,andTCA[J].EnvironmentalTechnology,2016,37(3):308-315.[2]ZhangX,ChenC,LinP,etal.EmergencyDrinkingWaterTreatmentduringSourceWaterPollutionAccidentsinChina:OriginAnalysis,FrameworkandTechnologies†[J].EnvironmentalScience&Technology,2011,45(1):161.[3]张晓健.加强城市供水应急处理技术和应急系统建设的研究[J].给水排水,2007,33(11):1-1.[4]陈超,张晓健,董红,等.自来水厂应急净化处理技术及工艺体系研究与示范[J].给水排水,2013,39(7):9-12.[5]张晓健.《生活饮用水卫生标准》新国标和净水厂工艺改进[J].供水技术,2007,1(2):1-4.[6]王占生,刘文君.饮用水标准及水环境安全[J].建设科技,2009(23):44-46.[7]梅金华.水与人体健康的关系探讨[J].低碳世界,2014(12):327-328.[8]宋兰合,由阳,李宗来,等.饮用水水质标准体系研究[J].中国给水排水,2016(6):1-6.[9]佚名.2015年中国环境状况公报[J].环保工作资料选,2016(6).[10]ClarkRM,SivaganesanM.PredictingChlorineResidualsinDrinkingWater:SecondOrderModel[J].JournalofWaterResourcesPlanning&Management,2002,128(2):152-161.[11]HuaP,CheungP,ZhangJ.Influencesofmodelstructureandcalibrationdatasizeonpredictingchlorineresidualsinwaterstoragetanks[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2018,634(7):705–714.[12]TaoT,XinK.Publichealth:AsustainableplanforChina"sdrinkingwater.[J].Nature,2014,511(7511):527.[13]中国城镇供水协会.城市供水行业2010年技术进步发展规划及2020年远景目标[M].中国建筑工业出版社,2005.[14]SwannerED,MloszewskaAM,CirpkaOA,etal.Modulationofoxygen75 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哈尔滨工业大学工程硕士学位论文哈尔滨工业大学学位论文原创性声明和使用权限学位论文原创性声明本人郑重声明：此处所提交的学位论文《供水管网生长环的构成及其微生物特性研究》，是本人在导师指导下，在哈尔滨工业大学攻读学位期间独立进行研究工作所取得的成果，且学位论文中除已标注引用文献的部分外不包含他人完成或已发表的研究成果。对本学位论文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明。作者签名：日期：2018年6月21日学位论文使用权限学位论文是研究生在哈尔滨工业大学攻读学位期间完成的成果，知识产权归属哈尔滨工业大学。学位论文的使用权限如下：（1）学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文，并向国家图书馆报送学位论文；（2）学校可以将学位论文部分或全部内容编入有关数据库进行检索和提供相应阅览服务；（3）研究生毕业后发表与此学位论文研究成果相关的学术论文和其他成果时，应征得导师同意，且第一署名单位为哈尔滨工业大学。保密论文在保密期内遵守有关保密规定，解密后适用于此使用权限规定。本人知悉学位论文的使用权限，并将遵守有关规定。作者签名：日期：2018年6月21日导师签名：日期：2018年6月21日82 哈尔滨工业大学工程硕士学位论文致谢时光荏苒，至此硕士学习生活已接近尾声，在硕士学习期间，在科研和生活上得到了许多老师和同学的热情帮助，正是由于他们的帮助，我的研究才得以顺利的进行，在此我要对他们表示深深的感谢。首先要感谢的是我的导师邱微老师！邱老师严谨认真务实的科研态度深深的影响着我，每次科研上遇到困难，邱老师总是热忱的鼓励我，想方设法的给我解决，为我实验能顺利开展，给我创造各种实验条件，支持我。在课题上给我耐心指导，指明研究方向，明确研究内容，感谢邱老师在科研过程中的谆谆教诲。在此我要对邱老师致以最真诚的感谢和最诚挚的祝福，祝您工作顺利！感谢赫俊国老师和李昂老师在我研究过程中的悉心指导，感谢吴晨光老师和孙琳琳老师在实验条件上的大力支持。感谢实验中心的王常海老师和刘峻峰老师在实验中对我的辛勤指导，正是由于得到了你们的支持实验才得以顺利完成。感谢所有传授我们知识的老师们，谢谢你们的悉心培养，祝你们工作顺利，身体健康。感谢李炜煜和郑砚石师兄，在实验过程中对我的指导，感谢王梦菲师姐在实验过程中的热情帮助。感谢16硕市政3班的全体小伙伴们，很有幸能遇到你们，感谢你们在平时的生活和学习中给予我的帮助和支持。感谢我的室友戴斌仁、林臻和李西齐，在生活中对我的关怀和帮助，有你们的陪伴生活中多了许多乐趣，同时特别感谢林臻在实验过程中的帮助。感谢我的父母和家人，感谢曹彬、雅、静，感谢你们对我的宽容、理解和支持，才使我无所顾虑，风雨无阻，不断前行。最后，我要对参加论文评阅和答辩委员会的各位专家表示衷心的感谢！伍先云二零一八年六月于哈尔滨83'