GBT27521-2011猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法.pdf 9页

'ICS11．220B41a雷中华人民共和国国家标准GB／T27521—2011猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法RT-PCRassayforswineinfluenzavirusnucleicacid2011-11-21发布2012-03-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学右中国国家标准化管理委员会厘111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载目q蟊GB／T27521--2011本标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中国检验检疫科学研究院，中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵、陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武、王慧煜、刘建、李建、梅琳、王伊琴、徐彪、阮周曦、宁宜宝、薄清如、秦智锋、林志雄。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GI／T27521—2011本标准规定了猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法的技术要求。本标准规定的RT·PCR检测方法适用于检测猪肺脏组织、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养物中的猪流感病毒核酸。2缩略语下列缩略语适用于本文件。DEPC：焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EB：溴化乙锭(ethidiumbromide)M_MLVRT：莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(moloneymurineleukemiavirusreversetran．-scriptase)PCR：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RNAaseinhibitor：RNA酶抑制剂RT-PCR：反转录一聚合酶链式反应(reverse_transcriptionpolymerasechainreaction)SPF：无特定病原体(specificpathogenfree)ngDNApolymerase：TnqDNA聚合酶3仪器3．1PcR仪。3．2台式低温高速离心机。3．3电泳仪。3．4电泳槽。3．5冰箱。3．6凝胶成像系统。3．7微量移液器。3．8水浴锅。4试剂4．1LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。4．2氯仿、异丙醇、无水乙醇。4．31．2％琼脂糖凝胶，见附录A中A．1。4．450×TAE缓冲液，见附录A中A．2。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27521--20114．5溴化乙锭(EB，10pg／pL)或核酸染料，见附录A中A．3。4．6焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，见附录A中A．4。4．7DNA分子量标准(100bp)。4．8M-MLV反转录酶。4．9RNA酶抑制剂。4．10TaqDNA聚合酶。4．11dNTP。4．12商品化的一步法RT—PCR反应试剂。含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。5引物5．1反转录引物见附录B中B．1。引物浓度为20pmol／pL。5．2PCR引物见附录B中B．2。引物浓度均为20pmol／pL。6样品对照以灭活的猪流感病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照，以正常SPF鸡胚尿囊液或者正常动物组织作为阴性对照。7操作步骤7．1样品的采集及处理7．1．1采样工具下列采样工具应经121℃士2℃，15rain高压灭菌并烘干；a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；d)1．5mL离心管；e)研钵。7．1．2活猪取鼻拭子。采集方法如下：将棉拭子深入鼻腔旋转，取鼻腔分泌液；将采样后的拭子分别放入盛有1．0mLPBS(见附录A中A．5)的1．5mL离心管中，加盖、编号。7．1．3病死猪取肺脏或气管分泌物等。采集方法如下：用无菌镊子和剪刀采集肺脏等，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。7．1．4样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，24h内送实验室。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载CB／T27521—20117．1．5样品处理7．1．5．1棉拭子处理方法样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，室温静置30min，4℃、3000r／rain离心15min，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。7．1．5．2脏器处理方法将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中，按质量体积比(1：1)加入样品保存液进行充分研磨；4℃、3000r／min离心15min，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。7．2RNA的提取7．2．1用LSTRIzol试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的RNA。7．2．2250pL样品处理液和750pLLSTRIzol置人一个1．5mL离心管，振荡数次，静置5rain。7．2．3加200pL氯仿，振荡混匀，室温放置5rain，4℃12000r／rain，离心15rain。7．2．4吸取上层水相至一新离心管中，加人等量异丙醇，混匀，室温放置15rain，4℃、12000r／min离心15rain，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒而言，可能看不到沉淀)。弃上清。7．2．5小心吸弃上清，加入500pL75％乙醇(DEPC水配置)，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，4℃、12000r／rain，离心5rain。7．2．6小心吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加适量DEPC水溶解。7．2．7提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，须放置--70℃冰箱保存。7．2．8也可采用商品化的基因组RNA提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴、阳性对照样品RNA的提取。7．3RT-PCR7．3．1一步法反应操作步骤(如实验室有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤)7．3．1．1在0．2mL反应管中依次加入：一步法RT—PCR缓冲液10pLdNTP(10mmol／L)2．0”L酶混合物2．0PLRNA酶抑制剂0．5pL上游引物0．5mL下游引物0．5pLRNA模板5儿DEPC水29．5pL上述体系根据扩增目的片段不同，分别选择相应的M、H1HA、甲H1HA、H3HA、N1NA及N2NA单个基因的上／下游引物进行反应。7．3．1．2采用PCR仪立即进行RT-PCR扩增。检测同时设立阴、阳性对照。7．3．1．3RT-PCR反应条件为：48℃45rain194℃2min；然后94℃30s，50℃1rain，68℃2min，共40个循环；最后68℃延伸7rain。7．3．2两步法反应操作步骤(如实验室没有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤)7．3．2．1RT取5肛LRNA，加1pL反转录引物(unil2)，70℃水浴5rain。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27521—20117．3．2．2冰浴2rain，继续加入：5×反转录反应缓冲液4pL0．1mol／LDTT2“L2．5mmol／LdNTPs2“LM—MLV反转录酶0．5pLRNA酶抑制剂0．5pLDEPC水5弘L7．3．2．337℃水浴1h，合成cDNA。取出直接进行PCR或置--20℃保存。7．3．2．4根据扩增目的片段不同，选择相应的上／下游引物进行扩增。PCR体系包括：双蒸灭菌水37．5pL反转录产物4pL上游引物0．5pL下游引物0．5pL10×PCRBuffer5“L2．5mmol／LdNTPs2“LTaq酶0．5pL首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加人上述成分，每一次要加入到液面下。全部加完后，混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。7．3．2．5PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸6rain。8扩增产物的电泳检测制备1．2％琼脂糖凝胶板，见附录A中A．1。在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3pL～5pL扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，加到凝胶孔。加入分子量标准。恒压(ii0V)下电泳30min～40min，将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。9试验成立的条件阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。10结果判定10．1阳性判定应用引物M-684U／M-684L、H1—668U／H1—668L、甲一428U／甲一428L、H3—668U／H3-668L、N1—615u／N1—615L、N2—246U／N2—246L，按照各基因检测体系对样品进行检测，扩增产物如果在684bp、668bp、428bp、668bp、615bp、246bp位置出现特异性条带，则判定为猪流感病毒或相应亚型病毒核酸阳性。10．2阴性判定如果在所用引物预期扩增片段的位置均未出现特异性条带，则判定为猪流感病毒核酸阴性。4 A．11．2％琼脂糖凝胶附录A(规范性附录)相关试剂的配制琼脂糖1×TAE电泳缓冲液放人100mLTAE电泳缓冲液(1×)中，加热融化。均匀铺板，厚度为3mm～5mm。A．250×TAE电泳缓冲液A．2．1A．2．2GB／T27521—20111．2g加至100mL温度降至60℃左右时，加入5pL核酸染料0．5moi／L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8．0)二水乙二铵四乙酸二钠18．61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8．0灭菌双蒸水加至100mLTAE电泳缓冲液(50×)羟基甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57．1mL0．5mol／L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8．0)100mL灭菌双蒸水加至1000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用。A．3溴化乙锭(EB)溶液A．4DEPC水溴化乙锭灭菌双蒸水20mg加至20mL灭菌双蒸水100mL焦碳酸二乙酯(DEPC)50pL室温过夜，121℃高压灭菌15rain，分装到1．5mLDEPC处理过的离心管。A．5PBS缓冲液A．5．1A液0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液。 GB／T27521—2011NaHzPO。·H2027．6g，溶于灭菌双蒸水中，定容至1000mL。A．5．2B液0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液。NazHPOt。7HzO53．6g(或NazHPOt‘12HzO71．6g或Na2HPOt‘2HzO35．6g)，溶于灭菌双蒸水中，定容至1000mL。A．5．30．0fmol／L、pH7．2磷酸盐缓冲液的配制60．2mol／LA液14mL0．2mol／LB液36mLNaCl8．5g加灭菌双蒸水定容至1000mL。 B．1反转录引物Uni12：57一AGCAAAAGCAGG一37。B．2PCR引物引物名称M-684UM-684LH1—668UH卜668L田一428U田一428LH3—668UH3—668LN1—615UN卜615LN2—246UN2—246L附录B(规范性附录)引物引物序列(57～3’)CAAGACCAATCCTGTCACCTCAAGACGATCAAGAATCCACAAAGCAAAAGCAGGGGAAAATAATGCATTCTGGTAGAGACTTTGCAGCAAATCCTACAGGAATGGAGATGTTCCAAGTCTGATCTGTTACCCTTATGATGTGCCCCCTGTTGCCAATTTCAGAGTTGCTTGGTCRGCAAGTGCYCWGTCCAYCCATTWGGATCCCAGTAGTAATGACTGATGGCCTGAGCACACATAACTGGA长度(bp)684GB／T27521—2011扩增目的片段猪流感病毒M基因668猪流感病毒H1亚型HA基因428猪甲型H1N1流感病毒HA基因668猪流感病毒H3亚型HA基因615猪流感病毒N1亚型NA基因246猪流感病毒N2亚型NA基因'