GBT27530-2011牛出血性败血病诊断技术.pdf 11页

'ICS11．220B41a目中华人民共和国国家标准GB／T27530--2011牛出血性败血病诊断技术Diagnostictechniquesforbovinehaemorrhagicsepticaemia2011-11-21发布2012-03-01实施宰瞀鹗紫瓣訾矬赞星发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GS／T27530--2011本标准的附录A、附录B和附录c为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAc／Tc181)归口。本标准起草单位：甘肃农业大学。本标准主要起草人：胡永浩、包世俊、伏小平、曾巧英、温峰琴、杨学山、邢小勇、郝宝成、项海涛。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载牛出血性败血病诊断技术GB／T27530--20111范围、本标准规定了牛出血性败血病(bovinehaemorrhagicseptieaemia，HS)的临床与病理学诊断及病原学诊断的方法和技术要求。本标准适用于口岸、产地及集散地牛出血性败血病的诊断、检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准。GB／T4789．28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。3缩略语下列缩略语适用于本标准。AGID：琼脂凝胶扩散试验(agargelimmunodiffusiontest)CIEP：对流免疫电泳试验(counterimmunoelectrophoresistest)CSY：酪蛋白一蔗糖一酵母琼脂(casein／sucrose／yeastagar)HS：出血性败血病(haemorrhagicseptieaemia)IHA：间接血凝试验(indirecthaemagglutinationtest)PB：磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer)RBCs：红细胞(redbloodcells)4临床与病理学诊断4．1流行特征黄牛、水牛、牦牛和奶牛均可感染发病。患病动物、带菌动物为传染来源。有时，健康畜禽的口腔、扁桃体和上呼吸道带菌。畜群中发生巴氏杆菌病而查不出传染源时，一般认为家畜在发病前已经带菌。病畜由其排泄物、分泌物排出有毒力的病菌，污染饲料、饮水、用具和外界环境，经消化道而传染给健康家畜。或由咳嗽、喷嚏排出病菌，通过飞沫经呼吸道发生传染。也可通过有伤口的皮肤、黏膜发生传染。吸血昆虫叮咬也可传播病菌。本病的发生一般无明显的季节性。通常呈散发性流行，在畜群中少数几头动物先后发病。水牛、牦牛有时可呈地方性流行。发病率、病死率均高。寒冷、闷热、潮湿、拥挤、气候剧变、阴雨连绵、圈舍通风不良、营养缺乏、饲料突变、过度疲劳、长途运输以及其他疾病、感染等是诱发因素。4．2临床症状4．2．废绝血尿4．2．败血型：病牛病初体温高达41℃～42℃，呼吸及心跳加快，鼻镜干裂，皮温不整，食欲减退甚至病初便秘，后腹泻，粪便始呈粥样，后为液状并混有黏液、黏膜片及血液，恶臭。有时出现鼻漏和腹泻开始后体温下降，不久即死亡。病程多为12h～24h。浮肿型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的炎性水肿，同时伴有舌及周围组织的高度肿胀，舌多伸出齿外，呈暗红色。呼吸高度困难，皮肤和黏膜发绀，常因窒息或下痢而死。病程多为12h～36h。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载Ga／T27530--20”4．2．3肺炎型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛主要表现为急性纤维素性胸膜肺炎的症状。体温升高，呼吸困难，干咳，流泡沫样鼻液，后鼻液呈脓性。胸部叩诊有痛感。病初便秘，后腹泻，粪便恶臭并混有血液。病程一般3d～7d左右。4．3病理剖检4．3．1败血型：皮下、各部位黏膜、浆膜、肌肉等均有出血点。胸腹腔有大量渗出液。真胃、小肠及大肠常见出血性炎症，肠内容物稀薄且多混有血液。淋巴结显著水肿。脾点状出血但不肿大。肺淤血、水肿。4．3．2浮肿型：咽喉部、颈部及肢体部皮下水肿，切开水肿部位流出深黄色透明液体，问或杂有出血。咽周围组织及会厌软骨韧带呈黄色胶样浸润，咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀。上呼吸道黏膜卡他性炎症。4．3．3肺炎型；胸腔中有大量浆液性纤维索性渗出液，肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜，肺脏切面呈大理石状。心包与胸膜粘连，内有干酪样坏死物。胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症。淋巴结肿大，呈紫色，布满出血点，尤以支气管淋巴结与纵膈淋巴结最为明显。4．3．4依据流行特征、临床症状以及病理变化可作出初步诊断，确诊要进行病原学诊断。5病原学诊断5．1病料采集及处理无菌采集病死动物的体腔渗出液、血液、肝脏、脾脏、淋巴结等新鲜病料，及时送检或置冷暗处保存备用。死亡时间较长的病例可采集长骨骨髓作为病料。可现场制作病料涂片或触片，供染色镜检。5．2染色镜检采集病料涂片或触片，染色后置显微镜下观察。革兰氏染色(按GB／T4789．28--2003中2．2规定操作)可见革兰氏阴性的短杆菌或球杆菌，菌体大小为(o．2pm～o．4pm)×(o．6pm～2．5pm)。瑞氏染色(按GB／T4789．28--2003中2．6规定操作)和美蓝染色(按GB／T4789．28--2003中2．1规定操作)时菌体两极浓染，印度墨汁染色(见附录A)可见明显的荚膜。慢性病例或腐败材料常不易发现典型细菌，应该经分离培养后再行染色镜检。镜检观察到典型菌体，结合流行特点、症状和病变，可初步诊断为本病。进一步进行病原分离鉴定以作出确切诊断。5．3病原分离鉴定5．3．1病原分离病料分别接种麦康凯琼脂培养基(见附录B)、酪蛋白一蔗糖一酵母(CSY)琼脂培养基(见附录B)和鲜血琼脂培养基(见附录B)，置37℃条件下培养18h～24h后，挑选可疑菌落进行鉴定。当病料中细菌含量小时，可用5％血清肉汤(按照GB／T4789．28--2003)于37℃进行增菌培养。5．3．2瘸原鉴定5．3．2．1培养特性多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长。在血液琼脂培养基上经18h～24h后可长成圆形、光滑、湿润、有灰白色光泽的半透明菌落，直径约1If]1TI，菌落周围无溶血现象。在CSY琼脂培养基上菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落。老龄培养物，特别是在无血培养基上的老龄培养物，形成的菌落小于血液琼脂培养基上的菌落。5．3．2．2菌体形态取血液琼脂培养基上生长18h～24h的典型菌落涂片，革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性的球杆菌，菌体大小为(o．2ptm～0．4pm)X(o．6pm～2．5／zm)。5．3．2．3生化试验5．3．2．3．1取纯培养的待检菌少许接种发酵管(见附录B)，置37℃培养，每天观察并记录结果。多杀性巴氏杆菌可分解葡萄糖、果糖、半乳糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖，产酸不产气；不发酵棉子糖、乳糖、鼠李2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27530—2011糖、菊糖、水杨苷、肌醇。5．3．2．3．2MR、VP试验(按GB／T4789．28—2003中3．4规定操作)阴性。5．3．2．3．3吲哚试验(按GB／T4789．28—2003中3．13规定操作)阳性。5．3．2．3．4氧化酶试验(按GB／T4789．28—2003中3．18规定操作)、过氧化氢酶试验(按GB／T4789．28—2003中3．20规定操作)阳性，口一半乳糖苷酶试验(按GB／T4789．28—2003中3．3规定操作)、脲酶试验(按GB／T4789．28—2003中3．15规定操作)阴性。5．3．2．3．5硝酸盐还原试验(按GB／T4789．28—2003中3．17规定操作)阳性，柠檬酸盐利用试验(按4789．28—2003中3．5规定操作)阴性。5．3．2．3．6硫化氢试验(按GB／T4789．28—2003中3．14规定操作)阴性，明胶液化试验(按4789．282003中3．10规定操作)阴性。5．3．2．3．7依据病原培养特性、菌体形态、生化试验，符合多杀性巴氏杆菌特征者可作出确定诊断。必要时进行血清分型试验和动物接种试验。5．3．2．4血清分型试验5．3．2．4．1间接血凝试验5．3．2．4．1．1材料所用材料如下所示：a)标准菌及待检菌荚膜抗原(见附录c)。b)特异性抗血清(见附录c)。c)1％新鲜绵羊红细胞(见附录C)。d)致敏绵羊红细胞(见附录C)。e)阿氏液(Alsever’s液)(见附录A)。f)80孔血凝反应板(大孔板)。5．3．2．4．1．2方法间接血凝试验方法步骤如下所示：a)反应板每排第1孔加入0．85％Nacl溶液o．72mL，自第2孔起各孔分别加入O．85％NaCl溶液O．4mL。b)各型特异性抗血清各自单独一排稀释，第1孔加入血清0．08mL，混匀，移取o．4mL到下一孔。同样方法稀释至第7孔。c)每孔加入O．4mL致敏绵羊红细胞。d)同时设如下对照：——血清对照：血清(10倍稀释)o．4mL+加1％新鲜绵羊红细胞o．4mL。——绵羊红细胞对照：1％新鲜绵羊红细胞0．4mL+o．85％NaCl溶液O．4mL。——抗原对照：1％致敏绵羊红细胞o．4mL+o．85％Nacl溶液o．4mL。——反应程序见表l。表1间接血凝试验(荚膜分型)反应程序8(抗体9(抗原10(绵羊红孔号1234567对照)细胞对照)血清稀释倍数2040801603206401280含O．3％甲醛的O．85％NaCl／mLO．72¨l¨10．4O．4O．36O．4型特异性抗血清加量／mLO．08，≈．4J、0．4J、、0．4J、o．4』、法扣。一O．4，0．4，l％致敏红细胞／mLO．40．4O．40．4O．41％新鲜红细胞／mLO．4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27530--2011加样后，轻微震荡，置室温，分别于2h～18h判读并记录结果。e)结果判定：绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为阳性，在孔中央形成钮扣状为阴性。依据凝集范围的大小判定凝集程度为以下几级：——“++++”：凝集颗粒细密并均匀地分布在整个孔底，边缘不整齐，示100％凝集。——“+++”；凝集的绵羊红细胞平铺孔底，但有卷边或缺口，示75％凝集。——“++”：凝集的红细胞平铺孔底，呈片层或沙撤布样，分布不均匀，边缘不整齐，示50％凝集。——“+”：绵羊红细胞凝集面积较小，凝集程度轻微，边缘稍增厚，示25％凝集。——“一”：绵羊红细胞沉积在孔中央，如小圆盘或钮扣状，示无凝集。以。++”为样品的滴度终点。当抗原与抗血清之间出现明显50％或50％以上凝集者，判读为阳性，抗原与抗血清之间出现25％或无凝集者，判读为阴性。未知菌株用具有凝集性的抗血清进行鉴定，若与所有血清都没有发生凝集反应，则用该方法对菌株无法分型。5．3．2．4．2琼脂凝胶免疫扩散试验5．3．2．4．2．T材料所用材料如下所示：a)琼脂。b)o．85％NaCl溶液。c)1％硫柳汞溶液。d)菌体抗原(见附录c)。e)多杀性巴氏杆菌菌体分型血清，1～16个血清型(见附录C)。5．3．2．4．2．2方法琼脂凝胶免疫扩散试验方法步骤如下所示：a)琼脂凝胶平板的制备：取0．9g优质琼脂加入90mL0．85％NaCI溶液中，加热溶化后再加人1％硫柳汞溶液1mL，最后加入适量0．85％NaCl溶液定容至100mL。冷却至45℃--50℃，倾注水平放置的洁净载玻片、玻璃片或平rm(凝胶厚度为2．5mm～3mr91)。b)打孔：琼脂冷凝后打孔，孔径4mm，孔距6rllm，每组7孔，如图1所示。孔内琼脂小心用针头挑出，以防破坏周围琼脂，随后用酒精灯加热封底。④⑦③⑦④⑥⑤图1免疫琼脂双向扩散打孔示意图c)加样：中央孔加待检抗原(见附录c中c．5)，不同菌体型特异的抗血清加入周边孔内(以加满不溢出为度)。d)感作：加样完毕后，静置10min，然后置带盖湿盒中，在37℃恒温培养箱中反应。24h～48h后观察并判定结果，72h为最终判定时间。e)结果判定：将琼脂板置于暗背景的自然光下或强光照射下观察。抗原孔与抗血清孔之间出现清晰沉淀线者为阳性，未出现沉淀线者为阴性。所有能引起出血性败血病的血清型菌株均能与2型抗血清反应，与5型抗血清也可能发生交叉反应。琼脂凝胶免疫扩散试验也可用于荚膜分型。荚膜分型所用的抗原及抗血清与问接血凝法相同(见附录c)。所用琼脂凝胶配成1％浓度(见附录A中A．5)。 GB／T27530—20115．3．2．4．3对流免疫电泳试验5．3．2．4．3．1材料所用材料如下所示：a)荚膜抗原(见附录C)。b)荚膜型性特异性抗血清(见附录c)。c)巴比妥缓冲液(见附录A)。d)对流免疫电泳介质(见附录A)。e)0．85％NaCl溶液。f)电泳仪、打孔器、微量加样器。5．3．2．4．3．2方法对流免疫电泳试验方法步骤如下所示：a)琼脂玻片的制备：将12mL电泳介质倾注玻板(57mm×70mm)，制成厚度为2mm～3mm电泳板。b)打孔：琼脂冷却后打孔，一排7孔，孔径4mm，孔间距7mm，按图2所示。另外设一排对照组，其组内各孔中心之问的距离为6mm。挑去孔内琼脂，封底。oOo抗原体抗原体图2对流免疫电泳试验抗原、抗体加样孔位置图c)加样：同一组加样孔中，阴极端的孔中加人20pL荚膜抗原，同时在阳极端的孔中加等量的抗血清。对照组分别用0．85％NaCl溶液与阳性抗血清配对和荚膜抗原与阴性兔血清配对。d)电泳：电泳槽加入适量pH8．8巴比妥缓冲液，150V(25V／cm)电泳30rain，观察电泳出现的沉淀线。e)结果判定：抗原和抗血清孔之间出现明显的沉淀线者判为阳性，不出现沉淀线者判为阴性。5．3．2．5动物接种试验将5．1采集的病料用灭菌0．85％NaCI溶液制成1：10悬液(体腔渗出液可直接用于接种)，或用5％血清肉汤(按照GB／T4789，28--2003中4，74)24h的培养液，皮下或腹腔接种18g～22g健康小鼠4只～8只，每只0．2mL。同时取4只～8只清洁级小鼠注射等量无菌0．85％NaCl溶液作为对照。隔离饲养观察。多杀性巴氏杆菌强毒株多于12h～72h内致死小鼠。采集死亡小鼠心血和实质脏器，按5．2染色镜检，按5．3进行病原分离鉴定。6确诊当病原学诊断检出多杀性巴氏杆菌时，依据致病特性，结合临床症状和病理变化，即可作出确定诊断。 GB／T27530--2011A．1印度墨汁染色附录A(规范性附录)溶液及电泳介质的配制A．1．1试剂：印度墨汁。A．1．2操作：将标本与一滴印度墨汁染色液在载玻片上混合，加盖玻片，轻压一下，使标本混合液变薄，在显微镜下观察。A．2阿氏液(Alsever’s液)A．2．1成分葡萄糖柠檬酸钠(CeHsNasO，·5HtO)柠檬酸(C。HeOt·HzO)NaClA．2．2制法2．05g0．80g0．05g0．42g上述成分加蒸馏水至100mL，混合过滤，116℃灭菌15rain备用。A．30．2mol／L磷酸盐缓冲液(PB)A．3．1成分NaH2P04·2H20Na2HP04·12H20A．3．2制法先配制0．2mol／L的NaH2PO；(A液)和0．2mol／L的NazHPO。(B液)，两者按一定比例混和即成0．2mol／L磷酸盐缓冲液。A液：称取NaH：PO。·ZHzO31．2g，加双蒸水充分溶解定容至1000mL。B液：称取Na：HPO。·12H。O71．632g，加双蒸水充分溶解定容至1000mL。取A液19．0mL，B液81．0mL混合后摇匀即得0．2mol／L，pH7．4的PB。A．4巴比妥醋酸盐缓冲液(巴比妥缓冲液)巴比妥钠29．24g，无水醋酸钠11．70g，0．1mol／L盐酸180mL，加蒸馏水到3L，调整pH为8．8。A．5对流免疫电泳介质对流免疫电泳介质成分：琼脂糖2．0g，巴比妥钠2．06g，二乙基巴比妥酸0．37g，蒸馏水180mL及0．01％的硫柳汞20mL。 附录B(规范性附录)培养基的配制GB／T27530--201B．1麦康凯琼脂培养基称取适量干粉麦康凯琼脂培养基，按使用说明制作培养平板。B．2酪蛋白一蔗糖一酵母(cSY)琼脂培养基B．2．1成分水解酪蛋白3g蔗糖3g酵母浸膏5g氯化钠5g无水磷酸氢二钾3gB．2．2制法加蒸馏水至1L，完全溶解后调pH值至7．3～7．4后加入1．5％琼脂，116℃高压灭菌15rain。冷却至45℃～50℃时加入5％的犊牛血清并倾注平皿制成平板培养基。B．3鲜血琼脂培养基B．3．1成分牛肉膏5g蛋自胨10g氯化钠5g磷酸氢二钾1．0g琼脂粉25g蒸馏水1000mLB．3．2制法先将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和磷酸氢二钾溶于蒸馏水，调pH至7．4～7．6，再加入琼脂粉，混匀并高压灭菌后，冷却至50℃时加入无菌脱纤家兔鲜血5％，充分混合后倾注平皿制成平板培养基。B．4糖发酵管B．4．1成分蛋白胨10g氯化钠5g糖(醇、苷)10g0．2％的溴香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLB．4．2制法各成分加热溶于水中并调pH至7．4，分装试管，116℃高压灭菌15rain。 GB／T27530--2011c．1荚膜抗原制备附录C(规范性附录)多杀性巴氏杆菌分型抗原及致敏绵羊红细胞的制备方法将参考菌株(待检菌株)6h～8h肉汤培养物1mL均匀涂布到CSY血液琼脂平皿上(直径90ram)，37℃培养过夜。用3mL含0．3％甲醛的0．85％NaCl溶液将生长物洗下，56℃加热30rain后，4℃30009离心3．5rain，收集上清液保存在一20℃备用。若没有冷冻离心机，则15009离心30min，上清液作为抗原提取物。C．2不同荚膜型特异性抗血清的制备和处理C．2．1制备将CartorA、B、D、E标准菌株分别接种于CSY血液琼脂培养基上，37℃培养18h～20h，用含0．3％甲醛NaCl溶液将生长物洗下，将菌体悬液的浊度调到与布朗氏比浊管的第4管相同。每间隔3d～4d给兔静脉内注射菌液一次，注射量分别为0．2mL、0．5mL、1．0mL、1．5mL及2．0mL。最后一次注射后1周，取0．5mL相同的活菌悬液，给兔皮下或肌肉接种。10d后采血收集血清，血清保存于--20℃，而常用的少量血清可加入硫柳汞至0．01％，4℃保存。C．2．2处理用前将1份压积绵羊红细胞加入3份血清中，室温作用30min，离心除去绵羊红细胞，经56℃灭活30min即可。C．3新鲜绵羊红细胞的制备无菌采取绵羊血液，脱纤后，用6倍～8倍的0．85％NaCl溶液洗涤3次，每次皆用离心法收集绵羊红细胞(500g)，最后一次收集的绵羊红细胞，应恢复到原血量的一半。置2℃～8℃保存，2d内使用。C．4致敏绵羊红细胞的制备取3mL荚膜抗原(见附录C中c．1)，加入0．2mL洗净的绵羊红细胞(见附录c中c．3)，充分混匀，37℃振荡作用2h，离心去上清，再用10mL0．85％NaCI溶液洗涤一次，离心悬浮于20mL0．85％NaCl溶液，即为1％的致敏绵羊红细胞悬液。C．5菌体抗原制备将细菌接种血液琼脂平板培养24h后，用1mL含0．3％甲醛的8．50NaCI溶液冲洗并收获生长物。悬浮液100℃水浴中加热1h，离心弃沉淀，取上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗原。C．6菌体分型抗血清的制备12周龄～16周龄公鸡颈中部皮下接种1mL油乳菌苗(油乳菌苗制苗菌株选用分离自牛的6：B8 GB／T27530--201型多杀性巴氏杆菌，制备方法参见《中华人民共和国兽药典))(2005年版三部)“禽多杀性巴氏杆菌病油乳剂灭活疫苗”)，3周后胸部肌肉内再接种1mL(在胸骨的两侧各接种0．5mL)。1周后采皿，分离血清，并加o．01％硫柳汞或0．06％石炭酸防腐保存。出现交叉反应的血清应弃去。'