GBT27531-2011病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法.pdf 9页

'ICS11．220B41囝图中华人民共$-n国国家标准GB／T27531--2011病毒性脑病和视网膜病病原逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)检测方法Protocolofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)forthepathogenofviralencephalopathyandretinopathy2011—11-21发布2012—03—01实施宰瞀髁鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昂GB／T27531—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘荭、卢体康、何俊强、史秀杰、郑晓聪、贾鹏、叶奕优、杨锦舜。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围病毒性脑病和视网膜病病原逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)检测方法GB／T27531—2011本标准规定了病毒性脑病和视网膜病(viralencephal。pathyandretinopathy，VER)病原分离和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。本标准适用于VER病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T18088出入境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变(cytopathiceffect)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyitrimethyammoniumbromide)DEPC：焦碳酸乙二酯(diethypyrocarbonate)EB：溴化乙锭(ethidiumbromide)EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4一(2一hydroxyerhyl)piperazine一1一erhanesulfonicacid]RNA：核糖核酸(ribonueleicacid)RNasin：核酸酶抑制剂(ribonucleaseinhibitor)VER：病毒性脑病和视网膜病(viralenc印halopathyandretinopathy)4试剂和材料水：符合GB／T6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶。VERV病毒参考株。胰酶一EDTA混合消化液(见附录A中A．1)。L-15培养液(见附录A中A．2)。SSN一1细胞系：用L_15培养液25℃培养。E-11细胞系：用L-15培养液25℃培养。AMV逆转录酶：20u／pL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。RNasin：20u／pL，一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。胰蛋白酶。，234567894 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27531—20114．10Taq酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4．11dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol／L。4．12引物：用于RT—PCR反应的引物浓度为40／zmol／L。其序列如下VERV—F：5’～CGTGTCAGTCATGTGTCGCT一3’VERV—R：5’一CGAGTCAACACGGGTGAAGA一34．13乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。4．14氯仿：分析纯。4．15矿物油：要求无DNA酶和RNA酶，用于无热盖的PCR扩增仪。4．16分子量标准。5器材和设备5．196孔细胞培养板。5．2倒置显微镜。5．3恒温培养箱。5．4普通冰箱和超低温冰箱。5．5组织研磨器(研磨器处理参见附录B)。5．6离心机和离一fl,管(离心管处理参见附录B)。5．7PCR扩增仪。5．8水平电泳仪。5．9微量移液器及吸头(吸头处理参见附录B)。5．10紫外照射仪或凝胶成像仪。5．11制冰机。6VERV的分离6．1采样待检测鱼，体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取头部和内脏(包括肾)，体长大于6cm的鱼取脑、眼、脾和肾。按GB／T18088的标准采样。6．2样品处理6．2．1组织处理用组织研磨器制备组织匀浆，按1：10的最终稀释度用L-15培养液稀释，稀释液中含有1000IU／mL青霉素和1000pg／mL链霉素，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。7000r／min离心15rain，收集上清液。6．2．2病毒分离细胞传代使用胰酶一EDTA混合消化液。对l：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将l：10、l：100、1：1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到两个生长约24hSSN一1或E一11细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100pL稀释液。15℃～20℃吸附0．5h～1h后，加入L-15细胞培养液。两个96孔板分别置于20℃和25℃培养。设2个阳性对照(接种VERV标准株)和1个空白对照(未接种病毒的细胞)。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T2753卜一201阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用倒置显微镜检查。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000r／min、4℃离心15rain，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现CPE，则应换用SSN一1或E-11细胞和待测样品重新进行病毒学检查。7VERV的RT-PCR检测7．1样品处理将450pL细胞病变悬液冻融后，放人1．5mL的塑料离心管，再加入450肚CTAB溶液(见附录A中A．3)并混匀，25℃作用2h。7．2核酸抽提在含有样品的塑料离心管中加入600pL抽提液1(见附录A中A．4)，用力混合至少30s。12000r／min离心5rain，小心取上层水相(约800pL)。再加入700pL抽提液2(见附录A中A．5)，用力混合至少30s。12000r／min离心5rain，小心取上层水相(约600wL)。再加入一20℃预冷的1．5倍以上体积的无水乙醇，倒置数次混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r／min离心30min，小·tL,倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸千液体。37℃干燥20min或抽真空干燥；最后加10pL水溶解后，作为PCR模板。7．3变性和退火在PCR管中加人10pL模板和5pL引物(vERv—F和VERV—R各2．5vL)，置于70℃反应5min。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。7．4eDNA合成在上述反应管中继续加入dNTP2pL、5倍逆转录酶缓冲液5pL、RNA抑制剂1pL、逆转录酶1“L、无菌蒸馏水1．5vL，低速离心后，覆盖50pL矿物油。将PCR管置于PCR扩增仪。42℃60min反应制各模板的cDNA。反应结束后，70℃10rain灭活逆转录酶，立即冰浴。7．5PCR扩增在上述反应管中再继续加入Taq酶1pL，dNTP1pL，反向引物和正向引物各1pL，25mmol／L的MgCl。(见附录A中A．6)10“L、10倍Taq酶缓冲液(见附录A中A．7)10pL、加水到总体积100vL。混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃4rain，再开始35次循环(核酸变性94℃1min、引物退火58℃1min、延伸72℃1rain)，然后72℃下延伸10rain，最后4℃保温。7．6设立对照7．6．1在7．2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。7．6．2取含有已知vERv的病毒标准株的病鱼组织悬液作为阳性对照。7．6．3采用未接种病毒的正常SSN—l细胞抽提核酸作为阴性对照。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27531—20117．6．4取等体积的水代替模板作为空白对照。7．7琼脂糖电泳用TBE(见附录A中A．8)电泳缓冲液配制1．5％的琼脂糖(含lp-g／mLEB，见附录A中A．9)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6pLPCR扩增产物和2pL溴酚蓝指示剂溶液(见附录A中A．10)混匀后加入孔内。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V／cm电泳约0．5h，当溴酚蓝到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7．8结果判定7．8．1用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。如阳性对照出现一条427bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带，则表明反应体系正常。7．8．2待测样品电泳后在相应427bpDNA位置上有带者，取PCR扩增产物进行测序，同参考序列(参见附录c)进行比较，相似性达到95％以上，则判定为阳性。 A．1胰酶-EDTA混合消化液氯化钠(NaCI，分析纯)氯化钾(KCI，分析纯)磷酸二氢钾(KH：PO。，分析纯)磷酸氢二钾(K。HPO。，分析纯)乙二胺四乙酸(EDTA，分析纯)胰酶(分析纯)双蒸水过滤除菌后分装备用。A．2培养液附录A(规范性附录)试剂及其配制0．8g0．02g0．02g0．115g0．02g0．1g100mLGB／T27531—2011L-15培养基，按说明书的要求配制，然后加人10％的胎牛血清，抽滤除菌，4℃保存。开放系统使用时，加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0．02mol／L。A．3CTAB溶液按2％CTAB，1．4mol／LNaCl，20．0mmol／LEDTA，20．0mol／LTris—HCIpH7．5配制。用前加巯基乙醇到终浓度为0．25％。A．4抽提液1酚／氯仿／异戊醇，用1．0mol／LpH(7．9土o．2)Tris饱和过的重蒸酚：氯仿：异戊醇按25：24：1的比例混合，密闭避光保存。A．5抽提液2氯仿／异戊醇，将氯仿和异戊醇按24；1的比例混合，密闭避光保存。A．6MgCl225．0mmol／L。A．7Taq酶用10倍浓缩缓冲液 GB／T27531—2011KClTritonX-100500．0mmol／L1％A．8TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris54．0g硼酸27．5gEDTA2．9g加水到1000．0mL用5．0mol／L的HCl调pH到8．0。A．9EB用水配制成10．0rng／mL的浓缩液。用时每10．0mL电泳液或琼脂中加1．0pL。A．10溴酚蓝指示剂溶液(6倍上样缓冲液)溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移人溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。 附录B(资料性附录)耗材去RNA酶的处理方法GB／T27531—2011本方法适用于本标准中所使用的研磨器、离心管和吸头。使用前于3．80oC干燥8h以上，或用0．1％DEPC水浸泡处理。DEPC处理时，先在37℃浸泡2h然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15rain，去除器皿上残余的DEPC。'