GBT27533-2011犬细小病毒病诊断技术.pdf 7页

'ICS11．220B41a亘中华人民共和国国家标准GB／T27533--2011犬细小病毒病诊断技术Diagnostictechniquesforcanineparvovirusdisease2011-11-21发布2012-03-01实施宰瞀鹳紫瓣警矬赞星发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖罱GB／T27533--2011本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：单虎、温建新、熊炜、黄娟、秦晓冰、于鹏程。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载犬细小病毒病诊断技术GB／T27533--20111范围本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法。本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。2试剂和材料2．1FK81细胞(猫肾细胞)。2．20．9％生理盐水：配制参见附录A中A．1。2．31％猪红细胞液：配制参见附录A中A．2。2．4犬细小病毒阳性血清。2．596孔“v”形微量反应板。2．6Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5u／pL，--20℃保存。2．71．5mLEppendorf管。2．80．2mLPCR薄壁管。2．9dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol／L，--20℃保存。2．10引物：浓度为20pmol／L，其序列如下：上游引物(CPVF)：57GAATCTGCTACTCAGCCAAC37；下游引物(CPVR)：5’GTGCACTATAACCAACCTCAGC3’。2．1110％十二烷基硫酸钠：配制参见附录A。2．12蛋白酶K贮备液：配制参见附录A中A．4。2．135×TBE电泳缓冲液：配制参见附录A中A．6。3器材和设备3．1PCR仪。3．2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达120009以上。3．3水平电泳仪。3．4凝胶成像系统。4临床检查4．1临床特征4．1．1潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40℃以上，粉红色黏稠血样物。4．1．2病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味。4．1．3患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。4．2病理变化4．2．1心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。4．2．2肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。4．2．3胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27533--201于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。4．3判定若临床症状符合4．1．1或4．1．2且出现4．2．1或4．2．3的病理变化，则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。5血凝与血凝抑制试验5．1血凝试验(HA)的操作方法5．1．1样品采集活犬的泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，30009离心15min，收集上清液待检；口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。5．1．2在96孔“v”形微量反应板上进行，自左至右各孔加100pL生理盐水。5．1．3于左侧第1孔加50pL待检样品于1．5mLEppendorf管，混合均匀后，吸50pL至第2孔，混合均匀后，吸50pL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50pL，稀释后病毒稀释度为第l孔1：2，第2孔1；4，第3孔1：8⋯⋯最后12孔为对照。5．1．4由左至右依次向各孔加1％猪红细胞悬液50pL置微型混合器上振荡，使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15min～30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。5．1．5判定结果：以100％凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。5．2血凝抑制试验(m)的操作方法5．2．1根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。5．2．2在96孔“v”形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50pL生理盐水，11和12孔分别为4单位CPV细胞病毒培养液和抗犬细小病毒阳性血清对照。5．2．3第1孔加犬细小病毒阳性血清50pL，混合均匀，吸50pL至第l孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50pL，如此稀释后血清浓度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8⋯⋯5．2．4由第1孔至11孔各加50止，4单位待测病毒液，第12孔50pL血清，混合均匀，置37℃温箱再作用15min～80rain，待4单位病毒已凝集红细胞可观察结果。5．2．5判定结果：被已知犬细小病毒阳性血清抑制血凝者，该病毒为犬细小病毒。6PCR检测6．1病料的采集及处理采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，30009离心15rain，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CPV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。6．2DNA抽提取上清液465pL，加入25pL10％十二烷基硫酸钠和lopL的20mg／mL蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h；加入等量的饱和酚溶液500pL，振荡混匀20s，120009离心5rain，取上清液；加入等量的酚：三氯甲烷：异戊醇(25：24：1)，振荡混匀20s，120009离心5min，取上清液；再加入等量的三氯甲烷：异戊醇(24：1)，振荡混匀20s，120009离心5rain，取上清液；最后加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，120009离心10rain，弃上清，室温干燥后，加入50pL双蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，--20℃贮存备用。CPV阳性对照样品和阴性对照样品与待检样品同步进行样品处理，并进行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提试剂盒进行。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27533--20116．3PcR检测在0．2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2．5pL、dNTP0．5pL、Taq酶0．5儿、DNA模板2pL、上游引物和下游引物(CPVF、CPVR)各0．5pL、三蒸水18．5pL，配制PCR检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94℃变性2rain；再94℃、30s，55℃、30s，72℃、40s进行35个循环；最后72℃、3min。用TBE电泳缓冲液配制1．5％的琼脂糖平板(含0．5gg／mLEB)，参见附录A中A．7，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10止PCR产物和2pL加样缓冲液(6×)，参见附录A中A．8，混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V／cm电泳约30rain，当溴酚蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。6．4结果判定6．4．1经PCR检测，CPV阳性对照样品可扩增出大小为609bp的核酸片段，参见附录B，且阴性对照样品无扩增条带，否则试验结果视为无效。6．4．2在符合6．4．1的条件下，若待检样品扩增出了大小为609bp的核酸片段，则初步判定犬细小病毒核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为609bp，则判定犬细小病毒核酸阴性。5．4．3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性大于等于90％，则可确诊为犬细小病毒核酸阳性，否则判定犬细小病毒核酸阴性。6．4．4若犬细小病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬细小病毒感染阳性。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27533--201附录A(资料性附录)试剂及其配制A．10．9％生理盐水称取9g无水氯化钠溶于l000mL去离子水中配成0．9％生理盐水，121．3℃灭菌15min。A．21％猪红细胞液1mL新鲜肝素抗凝猪血加入9mL灭菌生理盐水铷备而成。制备好后最好立即使用。暂时不用可放置4℃冰箱保存。A．3CPV细胞培养液CPV接种FK81细胞，培养3d～5d，当病变达60％～80％时收获。冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液分装后低温保存。A．410％十二烷基硫酸钠(sDs)在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸钠(电泳级)，加热至60℃助溶，用盐酸调pH值至7．8，加三蒸水定容至100mL。A．5蛋白酶K贮备液(20mg／mL)每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)1．21mg，乙二胺四乙酸(EDTA)1．86mg，十二烷基硫酸钠(SDS)5g，用盐酸调pH值至7．8。取该溶液按每毫升加入20mg蛋白酶K，充分溶解后分装。A．65×TBE电泳缓冲液每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)54．0g，乙二胺四乙酸(EDTA)2．9mg，硼酸27．5g，用5mol／L的盐酸调pH值至8．0。A．7EB核酸染色剂在10mL三蒸水中加入100mg溴化乙锭(EB)配制成10mg／mL的浓缩液。A．8加样缓冲液(6×)每100mL三蒸水中加入溴酚蓝0．25g和蔗糖40g。 附录B(资料性附录)犬细小病毒PCR扩增核酸片段参考序列g&&tctgctaCteagcc&ccaactaaagtttataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaataatactatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattgggtttttatccatggaaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaataccatctcatactggaactagtggcacaccaacaaatatataccatggtacagatccagatgatgttcaattttatactattgaaaattctgtgccagtacacttactgagaacaggtgatgaatttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagactaacacatacatggcaaacaaatagagcattgggcttaccaccatttctaaattctttgcctcaagctgaaggaggtactaactttggtccatttctaaattctttgcctcaagctgaaggaggtactaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaactcaaatgggaaatacaaactatatcactgaagctactattatgagaccagctgaggttggttatagtgcacGB／T27533--20115'