GBT27532-2011犬瘟热诊断技术.pdf 9页

'ICS11．220B41固雪中华人民共和国国家标准GB／T27532--20112011—11—21发布犬瘟热诊断技术Diagnostictechniquesforcaninedistemper2012—03—01实施宰瞀鹃鬻瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB／T27532--2011本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载犬瘟热诊断技术GB／T27532--20111范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT—PCR检测的操作方法。本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断。2试剂和材料2．1改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配方参见附录A。2．2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。2．3磷酸盐缓冲液(PBS)：配制参见附录A。2．4青霉素、链霉素：配方参见附录A。2．5CDV阳性血清：中和抗体效价1；1024。2．6CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清。2．7酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。2．8底物溶液：配制参见附录A。2．9过氧化氢甲醇溶液：配制参见附录A。2．10盐酸酒精溶液：配制参见附录A。2．11胰蛋白酶溶液：配制参见附录A。2．12Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U／uL，一20℃保存。2．13逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U／iLL，--20℃保存。2．14RNA酶抑制剂(40U／tLL)：一20℃保存。2．15dNTP：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol／L，一20℃保存。2．16引物：浓度为20tzmol／L，其序列如下：上游引物(CDVF)：5’CGAGTCTTTGAGATAGGGTT3’；下游引物(CDVR)：5’CCTCCAAAGGGTTCCCATGA37。2．17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50ttmol／L，一20℃保存。2．18DEPC水：自配(参见附录A)，或购买商品化DEPC水。2．19Trizol试剂：4℃保存。2．20异丙醇：使用前预冷至一20℃。2．2175％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。2．221．5mL无RNA酶的Eppendorf管。2．230．2mL无RNA酶的PCR薄壁管。3器材和设备3．1细胞培养瓶(中号瓶)。3．2二氧化碳培养箱。3．3恒温水浴箱(5℃～100℃)。3．4普通光学显微镜。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27532--20113．50．45“m微iL滤膜。3．6离心机。3．7PCR扩增仪。3．8水平电泳仪。3．940个小孔的室玻片。3．10冷冻切片机。3．11高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达120009以上。3．12凝胶成像系统。4I临床检查4．1I临床症状4．1．1病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。4．1．2腹下可见米粒大丘疹。4．1．3病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。4．2病理变化4．2．1新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩；成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。4．2．2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。4．2．3中枢神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。4．2．4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性，位于胞浆内，直径lpm～5p-m，可在黏膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现，核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。4．3判定若临床症状符合4．1．1或4．1．3且出现4．2．4的病理变化，则可判定疑似犬瘟热，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT—PCR检测等方法确诊。5病毒分离5．1样品采集和处理5．1．1活犬可采集泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬可采集肝、脾、肺等组织器官。5．1．2上述样品用无血清DMEM制成20％组织悬液，10000r／min离心20rain，取上清液，经0．45pm微孔滤膜过滤，滤液用于CDV分离。5．2操作方法5．2．1细胞培养用含8％新生牛血清的DMEM培养基在细胞培养瓶(中号瓶)培养Vero细胞，置37℃二氧化碳培养箱，单层细胞长至80％～90％时，接种样品上清。5．2．2病料接种取0．1mL处理好的样品上清接种Vero细胞，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h，加入无血清DMEM继续培养5d～7d，观察结果。5．3结果判定若接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为CDV病原分离阴性。若Vero细胞培养4d～5d出现细胞病变(如细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成合胞体，并在胞浆中出现包涵体)，可用免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT—PCR三种方法之一进行确诊。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载6免疫酶检测GB／T27532--2016．1操作方法6．1．1将CDV标准株和待鉴定的样品分别接种Vero细胞，接种后5d～7d，病变达50％～75％时，用胰蛋白酶消化分散感染细胞，PBS液洗涤3次后，稀释至1×106个／mL细胞。取有40个小孔的室玻片，每孔滴加10pL。室温自然干燥后，冷丙酮(4℃)固定10rain。密封包装，置一20℃备用。6．1．2取出室玻片，室温干燥后，每份10倍稀释的CDV阳性血清和阴性血清，每份血清滴加到两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，置恒温水浴箱37℃孵育30rain。6．1．3PBS漂洗3次，每次5min，室温干燥。6．1．4滴加1：100稀释的酶结合物，置湿盒内，用恒温水浴箱37℃孵育30rain。6．1．5PBS漂洗3次，每次5min。6．1．6将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min～10rain。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。6．1．7吹于后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。6．2结果判定6．2．1若CDV阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色，且CDV阳性血清与正常细胞反应无色，与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色，则判定阴、阳性对照成立。6．2．2在符合6．2．1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈无色，判为CDV阴性，相应动物犬瘟热感染阴性。6．2．3在符合6．2．1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈无色，而与CDV阳性血清反应呈棕黄色或棕褐色，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。7免疫组织化学检测7．1样品处理对疑似CD的病死犬或扑杀犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10％的福尔马林溶液中固定，保存，送检。7．2操作方法7．2．1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片机切片风干后用丙酮固定10rain15rain，新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片(切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱)。7．2．2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37℃作用20rain。7．2．3胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2rain，以便充分暴露抗原。7．2．4漂洗：PBS漂洗3次，每次5rain。7．2．5封闭：滴加体积分数为5％的新生牛血清或1：lo稀释的正常马血清，37℃湿盒中孵育30min。7．2．6加lO倍稀释的CDV阳性血清或阴性血清，37℃湿盒中孵育1h或37℃湿盒中孵育30rain后4℃过夜。7．2．7漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。7．2．8加1：100稀释的酶结合物，37℃湿盒孵育1h。7．2．9漂洗：PBS漂洗3次，每次5rain。7．2．10底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min～10rain后漂洗。7．2．11从90％乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。7．2．12试验同时设阳性、阴性血清对照。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27532--20117．3结果判定7．3．1被检组织与阴性血清作用后应无着染，若出现黄色或棕褐色着染，判定阴性对照不成立，应重复实验。7．3．2在符合7．3．1的条件下，被检组织与CDV阳性血清作用后本底清晰，细胞浆内呈现黄色或棕褐色着染，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。8RT-PCR检测8．1病料的采集及处理采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，30009离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CDV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。8．2RNA抽提分别取100pL待检样品、CDV阳性样品和阴性样品的上清液各装入1．5mL无RNA酶的Eppen—dorf管，加入1mLTrizol试剂，用枪头充分吹打20次～30次；130009离心15min；取上层水相，加500pL异丙醇，颠倒数次混匀，--20℃放置20rain；130009离心10min；弃上清，沉淀用lmLDEPC水配制的75％乙醇清洗；80009离心10min；弃上清，沉淀室温干燥10min；加20pLDEPC水溶解RNA沉淀。RNA溶液在2h内进行逆转录合成cDNA模板。另外，RNA抽提也可采用市售的商品化RNA抽提试剂盒进行。8．3cDNA模板制备取17pLRNA溶液，加10倍逆转录酶浓缩缓冲液2．5pL、dNTP1．5v-L、随机引物2pL、RNA酶抑制剂1pL、逆转录酶lpL，室温放置lorain后，置PCR仪上经42℃、60min，70℃、10rain。8．4PCR检测在0．2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2．5pL、dNTP0．5／LL、Taq酶0．5弘L、cDNA模板2卜L、上游引物和下游引物(cDvF、CDVR)各0．5pL、三蒸水18．5pL，配制PCR检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94℃变性2min；再94℃、30S，55℃、30S，72℃、40S进行35个循环；最后72℃，3rain。用TBE电泳缓冲液配制1．5％的琼脂糖平板(含o．5tug／mLEB，参见附录A中A．11，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10止PCR产物和2pL加样缓冲液(6×)混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V／cm电泳约30rain，当溴酚蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。8．5结果判定8．5．1经RT-PCR检测，CDV阳性对照样品可扩增出大小为455bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，否则试验结果视为无效。8．5．2在符合8．5．1的条件下，若待检样品扩增出了大小为455bp的核酸片段，则初步判定犬瘟热病毒核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为455bp，则判定犬瘟热病毒核酸阴性。8．5．3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性≥90％，则可确诊为犬瘟热病毒核酸阳性，否则判定犬瘟热病毒核酸阴性。8．5．4若犬瘟热病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬瘟热病毒感染阳性。4 附录A(资料性附录)试剂及其配制GB／T27532--201A．1DMEM(高糖)培养液的配制量取去离子水950mL，置于适宜的容器中。将DMEM粉剂10g加于30℃的去离子水中，边加边搅拌。每l000mL培养液加3．7g碳酸氢钠。加去离子水至1000mL，用1mol／L氢氧化钠或盐酸将培养液pH值调至6．9～7．0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。立即用孔径0．45,um的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。A．2磷酸盐缓冲液(PBS，0．01mol／LpH7．4)氯化钠氯化钾磷酸二氢钾十二水磷酸氢二钠蒸馏水A．3青霉素、链霉素8g0．2g0．2g2．83g加至1000mL取注射用青霉素和链霉素溶解于三蒸水中，使每毫升含青霉素、链霉素各5万单位(pg)，除菌过滤，用时按l00mL1640-15培养液加0．2mL，使青霉素、链霉素的最终浓度各为100单位(pg)。A．4底物溶液3，3-二胺基联苯胺盐酸盐(DAB)40mgPBS100mL丙酮5mL30％过氧化氢0．1mL滤纸过滤后使用，现用现配。A．5过氧化氢甲醇溶液(0．3％)30％过氧化氢甲醇现用现配。A．6盐酸酒精溶液(1％)盐酸70％乙醇A．7胰蛋白酶溶液(0．5％)胰蛋白酶PBS低温保存。使用时，用PBS稀释为0．05％。1mL99mL1mL99mL0．5g100mL GB／T27532--201A．8DEPC溶液(0．1％)DEPC1mL蒸馏水加至1000mL磁力搅拌至溶解，高压灭菌121℃，30min后4℃冰箱保存备用。A．9生理盐水称取9g无水氯化钠溶于1000mL去离子水中配成0．9％生理盐水，121．3℃灭菌15rain。A．105×TBE电泳缓冲液每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)54．0g，乙二胺四乙酸(EDTA)2．9mg，硼酸27．5g用5mol／L的盐酸调pH值至8．o。A．11EB核酸染色剂在10mL三蒸水中加入100mg溴化乙锭(EB)配制成10mg／mL的浓缩液。A．12加样缓冲液(6x)每100mL三蒸水中加入溴酚蓝0．25g和蔗糖40g。 附录B(资料性附录)犬瘟热病毒RT-PCR扩增核酸片段参考序列cgagtctttgagatagggttcatcaaacggtggctgaatgacatgccattactccagacaaccaactatatggtcctcccggagaattctaaagctgaggtgtgtactatagcagtgggcgagctgacactggcttccttgtgtgtagatgagagcaccgtattattatatcatgacagcaatggtccacatgacagtgttctagtagtgacgctgggaatatttggggcaacaccgatgaatcaagtagaagaggtgatacctgtcgctcatccatcagtagaaaagatacatatcacaaatcaccgtggtttcataaaagattcagtagcaacctggatggtgcctgcattggtctctgagcaacaagaaggacaaaaaaattgtctggagtcggcttgtcaaagaaaatcctaccctatgtgcaaccaaacatcatgggaaccctttggaggGB／T27532--201'