GBT27537-2011动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程.pdf 13页

'ICS11．220B41a雪中华人民共和国国家标准GB／T27537m2011动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程AnimalinfluenzadetectionmProtocolofDNAmicroarrayexaminationforinfluenzaAvirussubtypes2011—11-21发布2012—03-01实施车冒馘繁糯l=t訾糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖再GB／T27537--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国人民解放军军事医学科学院、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：韩雪清、刘伯华、李建、林祥梅、王惹煜、刘建、陈茹、侯义宏、刘业兵、贾广乐、吴绍强、梁成珠、秦智锋、宁宜宝、薄清如、王伊琴。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程GB／T27537--2011本标准规定了A型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程。本标准适用于!Li岸样品中A型流感病毒全部亚型(H1～H16，NI～N9)的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。ctrl、ctr2和ctr3：质控探针1、2和3(control1、control2andcontrol3)DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)PBS：磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffersolution)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RT．PCR：反转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)SDS：十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate)SSC：氯化钠／柠檬酸钠缓冲液(sodiumchloride-sodiumcitratebuffer)TAMRA：羧基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine)4主要试剂和仪器4．1主要试剂4．1．1试验用水蒸馏水，按照GB／T6682，三级用水，除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。4．1．2提取试剂Trizol试剂等或商品化的病毒RNA提取试剂。4．1．3A型流感病毒多重不对称RT-PCR扩增引物和探针的合成特异性引物和探针(参见附录A)。探针和引物合成后，采用无RNA酶的水(参见附录B)分别溶解为50}tmol，--20℃保存备用。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27537--20”4．1．4RT-PCR反应试剂一步法R■PcR缓冲液，dNTP，酶混合物，RNA酶抑制剂等。4．1．5基因芯片含有A型流感病毒i6个HA亚型和9个NA亚型特异性探针和质控探针，参见附录C。4．1．6基因芯片杂交液商品化的基因芯片杂交液(参见附录B)，每份含有ddHzO0．7pL，20×SSC1．5pL，50×Denhardt’s1．5v-L，50％(质量体积比)硫酸葡聚糖3．0vL，4％(质量体积比)SDS1．5btL，共8．2pL／份。4．1．7杂交质控探针TAMRA荧光标记的一段寡核苷酸(ctrl)，与芯片上杂交阳性参照(PC，ctr2)序列互补，用于质控杂交过程(序列参见附录A)。合成后，采用无RNA酶的水溶解为50pmol／L，--20℃保存备用。4．2仪器4．2．1微型台式高速冷冻离心机(大于13000r／min)。4．2．2PCR仪。4．2．3涡旋混匀器。4．2．4恒温水浴箱。4．2．5芯片杂交盒。4．2．6脱色摇床。4．2．7基因芯片扫描仪。4．2．8冰箱(2℃～8℃、--20℃和--80℃三种)。4．2．9微量可调移液器。4．2．10离心管和枪头。5操作方法5．1采样工具下列采样工具应经(121+2)℃，15min高压灭菌并烘干——棉拭子；——剪刀；——镊子；——1．5mL离心管；——研钵。5．2样品采集5．2．1活动物取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：——取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取鼻腔分泌液；——取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取咽喉分泌液2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27537--2011——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便；——将采样后的拭子分别放人盛有1．0mLPBS的1．5mL离心管中，加盖、编号。5．2．2脏器或肌肉组织用无菌镊子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。5．3样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，24h内送实验室。5．4样品的处理5．4．1棉拭子处理方法样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30rain，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。5．4．2肌肉或组织脏器处理方法取待检样品2．0g，加入等量灭菌石英砂，于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加入10mLPBS混匀，4℃，3000r／rain离心15rain，取上清液转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。5．5样品RNA的制备5．5．1取上清液200pL，分别加入1．5mL离心管内，各加入Trizol试剂1．0mL，反复混匀，冰上放置5min。5．5．2加入200pL氯仿，小心盖上帽盖，用力摇动离心管15S，室温放置5min。5．5．312000r／min，4℃，离心15rain，可见分为三层，上层水相含RNA。5．5．4转移水相至一新离心管内，加入等量异丙醇，混匀，室温放置15rain。5．5．512000r／rain，4℃，离心10rain，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒而言，可能看不到沉淀)。5．5．6小心吸弃上清，加入500pL75％乙醇(用DEPC水配制)，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，12000r／min，4℃，离心5min。5．5．7小心吸弃上清，室温干燥RNA沉淀5min～10min。然后加入20pL无RNA酶的水溶解沉淀。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应放置--80℃冰箱保存。5．6A型琉感病毒RNA多重不对称RT-PCR扩增体系5．6．1引物混合比例25对引物分为4组。第1组包括H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2，其中H5和H7亚型的上游引物为0．65pL，下游引物为1．3pL，N2亚型的上游引物为0．6pL，下游引物为1．2乩，其余亚型的上游引物均为0．5pL，下游引物均为1pL；第2组包括H2、H4、H8、H10、Hll、H13、H15和H16，每个亚型的上游引物均为0．5pL，下游引物均为1pL；第3组包括H14、N4、N6、N7和N9，其中N7上游引物为0．65pL，下游引物为1_3pL，其余亚型上游引物均为0．5gL，下游引物均为1pL；第4组包括H12、N3、N5和N8，其中N5上游引物为0．6pL，下游引物为1．2pL，其余亚型上游引物均为0．5gL，下游引物均为1gL。5．6．2RT-PCR反应体系每个样品分4个管进行RT-PCR。在0．2mLPCR反应管中依次加入一步法RT—PCR缓冲液 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27537--20110pL，10mmol／LdNTP2．0gL，酶混合物2．0vL，RNA酶抑制剂0．5pL，通用引物上游0．5PL、下游5．0pL，RNA模板5．0pL，按照4组引物混合物的用量分别加入引物混合物，补无RNA酶的水至50．0pL。置于PCR仪立即进行RT-PCR扩增。5．7A型流感病毒多重不对称RT-PCR反应条件反应条件：50℃30mira95℃15mira94℃20S，52℃605，72℃90s，共20个循环；然后94℃20s，70℃90s，共20个循环；最后72℃延伸10rain。扩增反应结束后，取出放置于4℃。5．8基因芯片的杂交、洗涤与扫描5．8．1杂交步骤5．8．1．1扩增产物5．2vL(4组RT-PCR产物各取1．3pL)、杂交质控探针0．8pL和杂交液6pL于0．zmLPCR管中，混匀。5．8．1．295℃变性5rain，立即冰浴3min，4000r／rain离心5s～10s，将离心管放回冰浴。5．8．1．3在杂交盒的沟槽中加入200pL蒸馏水以防止杂交体系蒸发，将芯片正面向上放人盒中。5．8．1．4将已变性的杂交样品从冰盒中取出，用枪头轻轻吹吸3次～5次。5．8．1．5取7“L杂交混合液加到探针点阵区，迅速盖上益片和杂交盒并密封。5．8．1．6将杂交盒水平放人52℃的水浴锅中，杂交2．5h。5．8．2洗涤步骤5．8．2．1杂交结束后，立即将芯片取出，放人预热至45℃的洗涤液I中，100r／rain水乎振荡洗涤5rain，相同条件重复一次。5．8．2．2取出芯片，放人预热至45℃的洗涤液Ⅱ中，100r／rain水平振荡洗涤5min，相同条件重复一次。5．8．2．3取出芯片，放人洗液Ⅲ中，100r／rain室温振荡5rain。5．8．2．4将芯片在无水乙醇中浸提几次，然后把芯片放人芯片盒中，1000r／rain离心5min。5．8．3扫描用基因芯片扫描仪(波长532nm，PMT60％，激光能量90％，扫描仪参数不作硬性规定)进行芯片扫描。6结果判定6．1检测结果成立条件A型流感病毒基因芯片点样阳性参照(qc，即ctr3)和杂交阳性参照(PC，即ctr2)，经杂交扫描后出现特异性荧光信号，同时点样buffer参照(Nc)和空白参照(N)无荧光信号，则检测结果成立，否则结果不成立，应重新试验。6．2结果判断6．2．1阳性判定在试验结果成立的前提下，如果样品RT-PCR产物经杂交后，在各自的位置上(见图1)出现特异性4 GB／T27537--2011荧光信号，则判定为A型流感病毒各个亚型(包括HA和NA)核酸阳性。每条探针有2个重复位点，出现2个或2个以上荧光信号者判为该亚型核酸阳性；出现1个荧光信号需进行重复试验再次读判，如果仍出现1个荧光信号，就判为可疑，可采用其他方法进一步验证。如果只有HA或者只有NA位点出现荧光信号，或者2个以上HA或NA亚型位点出现荧光信号，都判定为该亚型核酸阳性。QCH1NCH1H2QCH2H3H4H5H6H7H8H9HlOH10H11NCH12PCH13NCH14H15H16N1N2N3N4N5N6N7N8QCN8N9N(：NCN9NQCQeQc——点样阳性参照；PC——杂交阳性参照；Nc——点样buffer参照；N——空白参照}DP(H1～H16，N1～N9)——检测探针图1芯片探针排布图6．2．2阴性判定如果在各亚型特异性探针位置上(见图1)均未出现荧光信号，则判定为A型流感病毒亚型核酸阴性。7注意事项7．1样品处理、RNA提取和RT-PCR加模板等操作应该符合相关生物安全操作管理规定的要求，同时注意自身防护。扩增后芯片杂交检测可在普通实验室进行操作。7．2因涉及RNA操作，为了防止RNA降解，用于试验的器皿和离心管、PCR管及枪头等均需要用DEPC水处理，并经过121℃、15min高压灭菌后才可使用。操作时应戴一次性手套，并经常更换。7．3模板RNA提取、PCR反应液配制、芯片杂交、芯片洗涤和结果观察等应分区或分室进行，实验室运作应从洁净区到污染区单方向进行。7．4当同时需要进行数个样品的多重不对称RT．PcR反应时，先配制除待检样品外的各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作产生的误差。7．5使用酶混合物和RNA酶抑制剂等酶类时，取样之前要瞬时离心，将液体收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50％的甘油，黏度高，应慢慢吸取以保证取样量的准确。7．6上机运行前应检查各PCR管盖是否盖紧，以防RNA和PCR产物污染仪器。7．7取杂交混合液加到探针点阵区时，一定要轻柔，避免出现气泡，否则会影响杂交结果。7．852℃杂交时，杂交盒要水平放置。7．9芯片洗涤时，洗涤液I和洗涤液Ⅱ要预热，否则洗涤不干净，影响扫描结果。7．10芯片常温避光保存。 GB／T27537--2011附录A(资料性附录)引物和探针序列表A．1A型流感病毒基因芯片多重不对称RT-PCB引物型别引物编号序列(5’～3’)长度U11iv_PMA一06001一ufTCACTTGCTTCCGTTGAGGersalPMA一06002一uoTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTH1PMA一06002·H1fTCACTTGCrTCCGTTGAGGGGAGCAATTGAGTTCAGTATC601bpPMA一06004一H1rTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGACACTCTCCTATTGTGACTGH3PMA一06005一H3fTCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTTACCCTTATGATGTGcC659bpPMA一06006一H3rTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCCTGTTGCCAATTTCAGAGH5PMA一06007一H5fTCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTGAATTGGAATATGGTAACTG380bpPMA一06008一H5rTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTAACTGAGTGTTCATTTTGTCAATH6PMA一05017-H6FTCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGCACTTATTGGRTCAGG685bpPMA一06018一H6RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTAGTTTCAATCTGTGGH7PMA一06009一H7fTCACTTGCTTCCGTTGAG(汀CAGGWTCTTCWTTCTATGC641bpPMA一06010一H7rTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTTCYCCTTGTGCATTTTGATGH9PMA一06011-H9fTCAcTTGCTTCCGTTGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGT493bpPMA一06012一H9rTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGATCTTACTCGCAATGTCTGN1PMA一06013一N1fTCACTTGCTTOCGTTGAGGTCCCACTTGGAATGCAGAAC328bpPMA一06014一NlrTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACATGCACATTCAGACTCTTGN2PMA一06015一N2fTCACTTGCTTCCGTTGAGGATAGCATGGTCCAGCTCAAG299bDPMA一06016·N2rTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTACATGCTGAGCACTTOCTGHZPMA一06019一H2FTCACTTGCTTCCGTTGAGGC(；TCATTCTTCAGG从CATGG229bpPMA一05020-H2RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGCCTTGTTGCTATTTCWGGH4PMA·06021-H4FTCAcTTGcTTCCGTTGAGGTTGTTAYCCATTTGATGTGCC324bpPMA一05022一H4RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTRACTCTTCCAGGGTTGTTH8PMA-05023一H8FTCACTTGcTTCCGTTGAGGAAGGTTGGTCATACATAGTGG444bDPMA一06024一H8RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTC；TCCTCTTACTAATG(；TCTGGH10PMA一06025一H10FTCACTTGCTTCCGTTGAGGGATTGACAAGATAAGCACCGG435bpPMA-06025一H10RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTTTACTYACTCTACTAGGTGCTATH11PMA-06027一H11FTCACTTGCTTCCGTTGAGGACTTAGAAATGTCoCAGCAA437hpPMA-06028一HilRTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTCATTTCCCTCGTCTTTGGCH12PMA一06035·H12FTCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTACAAGAACACCAGAGATT537bpPMA-06036一H12RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGC(汀CTGGCCATCCGCCTTCTATH13PMA-06029一H13FTCACTTGCTTCCGTTGAGGGACCCTTCTGCTCCTCATG474bpPMA一06030一H13RTAMRAGGTTTCGGATGTTACAGCGTGAAACTGATTGATTCCCCTGGH14PMA-06037-H14FTCACTTGCTTCCGTTGAGGTCTccCGACTAAACTGGCTA247bpPMA一06038一H14RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGCcGCTCTGATTCCTTAC6 表A．1(续)GB／T27537--2011型别引物编号序列(5’～3’)长度H15PMA·06031-H16FTCACTTGCTTCCGTTGAGGGACTCCTTGACTGAGATcTGG305hpPMA-06032一H15RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGTATCACATCTTTGTACCCACH16PMA一06033一H26FTCACTTGCTTCCGTTGAGGTAAACTTCTCGTGeTAATCG252bpPMA一06034一H16RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCTTCAACTTGATCCCTTCN3PMA一06049一N3FTCACTTGCTTccGTTGAGGGGGAAAGARTGGATGCATGT366bpPMA一06050-N3RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTTGTTGATTCTCATCCAAGGN4PMA一06039一N4FTCACTTGCTTccGTTGAGGGGAAGCAATCGACCATGGAT260hpPMA一06040一N4RTAMRA—GGTTTCC-GATGTTACAGCGTCGACACCCATCCATTAGCATN5PMA一06051一N5FTCACTTGCTTCCGTTGAGGACTGTTATTGGGTAATGACG459hpPMA一06052一N5RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTTGCTTGTTTTGGTCCAACCGN6PMA一06041一N6FTCACTTGCTTccGTTGAGGACCTAATAACAATGCTTCGG246bDPMA．06042一N6RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTCA(：TCTTCTATATGCTGTGCN7PMA一06043一N7FTCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTGCAGAGATAAYTGGCA352bpPMA-06044N7RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCGGAATAGCCTGACCAATTN8PMA一06045一N8FTCAC”GCTTccGTTGAoGGGoCAMTGATGTATGGATGG340bpPMA一06046一N8RTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAAGAATAGCTCCATCGrGccN9PMA一06047一N9FTCACTTGCITCCGTTGAGGTTCTATGCTCTCAGCCAAGG310hpPMA一06048一N9RTAMRA—GGTTTCGGATGTTACAGCGTTGGCATACGCATTCAGATTC注：Y=(C，T)，W=(A。T)。R=(A，G)表A．2A型流感分型基因芯片探针型别编号探针序列(5’～3’)质控探针QCPPBA一08001-ctrlTAIVIRA-CCTCAACGGAAGCAAGTGATPBA一08002一ctr2NH2一T15一ATCACTTGCTTCCGTTGAGGPBA—08003一ctr3NH2一GCT(；CCTCGGCAAGGAGT—TAMRAH1PBA一08004-HlaNH2一T15一TGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTCPBA一08066-HIdNH2·T15一AATAGAACCTGGAGACACAATAAPBA-08068一H11NH2一T15一CGAGATATTCCCCAAGACAAGTTH3PBA一08007一H3aNH2一T15一CCTCGGGGTTACTTCAAAATACGPBA一08008一H3bNH2一T15一GGAAGCATTOCCAATGACAAACCH5PBA—080i1-H5aNH2一T15一GTCACCAATAAGGTCAACTCGATCPBA-08012-H5bNH2一T15一ACCATAGCAATGAGCAGGGGAH6PBA一08025一H6aNH2一T15一TGAGATGTTTCCCAAAAGTACATGGPBA一08026一H6bNH2一T15一ATGGGAACTGAAAGCATGAATTTH7PBA一08013一H7aNH2-T15一CAGACCAAACTCTATGGAAGTGGAPBA一08014一H7bNH2一T15一(yrCAAACACAGACAAToCTGCTTPBA一08065-H7eNH2一T15一CAAGGAAAGACCCAGCTCTGATAATH9PBA-08017一H9aNH2一T15一CAAGACGCCCAATACACAAATAATPBA一08018一H9bNH2一T15一AAGCATGTTCAGATTCATTCTACAG7 GB／T27537--201表A．2(续)型剐编号探针序列(5’～3’)N1PBA一08019-NlaNH2一T15一AGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTGPBA一08020-INlbNH2一T15一CAAGAGTTGGAGGAAC从CATACTN2PBA一08022一N2aNH2一T15一GCGTTTGTATCAATGGAACTTGTAPBA一08023一N2bNH2一T15ATGATGGGAAAGCATGGTTACATGH2PBA一08027一H2aNH2一T15一ACATCAACACTGAATAAGAGGTCPBA一08028一H2bNH2一T15一GAACAAAGGACACTGTACCAGAATH4PBA一08029一H4aNH2一T15一GACAAAGGTCAACAATGGGGAPBA一08030一H4bNH2一T15-CTTCAACTGACGCAGAACA从H8PBA一0803I-H8aNH2一T15一TGGAGACATCATTTTCTTATGGGPBA一08032一H8bNH2一T15一GCATCTTACAAGAGAATAAGGCTATTH10PBA一08034一H10aNH2一T15一AAAACAACTTTGTGCcTGTGGTPBA一08035一H10bNH2一T15一CACAAGAAAAGAATGATcTGTATGGH11PBA一08036一H11aNH2一T15一CAGTGAAATAGAGGAGAGGATAAACCPBA．08037一H1lbNH2一T15一AGAAGGATGCTAAAGGACAATGH12PBA一08045一H12aNH2一T15一TAATCACAGGGAAATCACATGGCPBA一08046一H12bNH2一T15一CACTAGTAAGCACTATATTGGGAAH13PBA一08038+H13aNH2一T15一GGATGAAGATTTACTGGTATTTGATGPBA一08039一H13bNH2一T15一GTTCATGGAGTAGGAAATACAACCH14PBA一08047一H14aNH2一T15一CCATCAAGCGATAATGAGCAAACPBA一08048一H14bNH2一T15一TCTTATGTCAGGCTCTATCTCTGGH15PBA一08040一H15aNH2一T15一GCATACAATTGACCTTGCAGATTCPBA一08041一H15bNH2一T15一CCGATGTGACGATCAATGTATGH16PBA．08043一H15bNH2一T15一GACAGAACATTAGACCTGCATGATPBA一08044一H15cNH2一T15一ATCATGAGGACTACAAAGAAGAGN3PBA一08049一N3aNH2一T15一TATGTAGGGACAATTGGAAGGGPBA一08050一N3bNH2一T15一GATAATGATGCAAGTGCCCAGAN4PBA一08051-N4aNH2一T15一GGCTATGTATGTAGTGGGATATTTGPBA一08052一N4bNH2一T15一GATGGCACAGGCTCATGTAATAGN5PBA一08053-N5aNH2一T15一GTTTGCCGAGATAATTGGAATGGPBA一08054一N5bNH2一T15一AGGGAGGTCACATTGAAGA(玎N6PBA一08055一N5aNH2一T15一GGCAGGAAATATATTAAGGACTCAPBA一08056一N6bNH2一T15—CCAGCTAATAACAGAGCAGAAACN7PBA一08057一N7aNH2一T15一ATGTTGAAAATACCTAATGCAGGPBA一08058一N7bNH2一T15一AAGGGATTCGGGTTTCrAAATGGN8PBA一08060-N8aNH2一T15一AGCTCCATTGTGATGTGTGGPBA一08061一N8bNH2一T15一从CTTAAATTGGTCAGGATACAGCGN9PBA一08062一N9aNH2一T15一TCATCACCACCCACAGTATACAAPBA一08063一N9bNH2一T15一AGAGCCAGGATGTCGATATGTA8 B．1无RNA酶的水附录B(资料性附录)试剂配制GB／T27537--201000mL超纯水中加入1mLDEPC，37℃静置1h，然后121℃高压蒸汽灭菌15min。B．220×SSC用800mL超纯水溶解175．3g氯化钠和88．2g柠檬酸钠，调节pH值至7．0，定容至1000mL。分装后121℃高压蒸汽灭菌15min。B．350×Denhardt’S50×Denhardt’s试剂的成分为：1％(质量体积比)聚糖体400，1％(质量体积比)聚乙烯吡咯烷酮和1％(质量体积比)牛血清白蛋白。B．450％(质量体积比)硫酸葡聚糖用900mL超纯水溶解500g硫酸葡聚糖，定容至1000mL。B．54％(质量体积比)SDS用900mL超纯水溶解40gSDS，调节pH值至7．2，定容至1000mL。B．6PBS缓冲液B．6．1A液(0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液)NaHzPO。·H：O27．6g，溶于超纯水中，定容至1000mL。B．6．2B液(0．2mol／L磷酸氢二钠水溶液)Na2HP04·7H2053．6g(或NazHP04·12H2071．6g或NazHP04·2H2035．6g)，溶于超纯水中，定容至1000mL。B．6．30．01mol／L、pH7．2磷酸盐缓冲液的配制0．2mol／LA液0．2mol／LB液NaCl加超纯水定容至14inL36mL8．5g1000mL。9 GB／T27537--2011B．7洗涤液I、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ洗涤液I：2×SSC，o．1％SDS(17．53g氯化钠，8．82g柠檬酸三钠，调pH一7，用超纯水定容到1000mL，后加1gSDS)；洗涤液Ⅱ：0．2×SSC，0．1％SDS(1．753g氯化钠，0．882g柠檬酸三钠，调pH=7，用超纯水定容到1000mL，后加1gSDS)；洗涤液HI：0．2×SSC(1．753g氯化钠，0．882g柠檬酸三钠，调pH=7，用超纯水定容到1000mL)。 C．1芯片的设计方案附录C(资料性附录)基因芯片的制备与检验GB／T27537--2011本芯片设计为每张经醛基修饰的玻片上含4个点阵，每个点阵的微矩阵为14×9阵列(见图c．1)，芯片点样矩阵图包括5个部分：Qc为点样阳性参照，8个重复位点；NC为点样buffer参照，8个重复位点；PC为杂交阳性参照，2个重复位点；N为空白参照，2个重复位点；其他位点为检测探针：HA亚型和NA亚型(Hl～H16，NI～N9)的52条特异性探针，每条探针2个重复位点。Q(：Q(’H1NC：N0H1H2eK：QC、口H2H3H4H5口H6H7H8口it8H8H9H10H11NCH12PCPt、H13NCN(：口H14H15H16N1N2N3N4N5N6N7N8黝QCN8N9N(、N9NQCQc——质控探针；Pc——阳性探针；Nc——阴性对照；N——空白对照}DP——检测探针(H1～H16，NI～N9)。C．2芯片的制备图c．1芯片点样矩阵图稀释好的探针按照芯片点样矩阵图点制到醛基基片上，即为点制好的芯片，保存期为12个月。C．3芯片的检验从每批点制好的芯片中随机抽取2张，应为无色、透明，无缺刻，无划伤的玻璃片，对光观察能看到有明显的4个点阵。'