GBT27539-2011动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法.pdf 9页

'ICS11．220B41a亘中华人民共和国国家标准GB／T27539--2011动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法Animalinfluenzadetection--Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionofinfluenzavirusA2011·1I-21发布2012-03-01实施宰瞀鹳鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T27539--20”本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、深圳匹基生物工程有限公司。本标准主要起草人：汪琳、林志雄、周琦、高志强、陈茹、乔彩霞、蒲静、杨伟、梁成珠。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法本标准规定了A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于活动物及其产品中A型流感病毒的检测。2规范性引用文件GB／T27539--2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求GB／T27401实验室质量控制规范动物检疫SN／T1330进出口生、熟毛皮检验规程3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Ctvalue)DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)PBS：磷酸盐缓冲液(配方见附录A)(phosphatebuffersaline)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR：反转录一聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)4原理流感病毒(influenzavirus)属正粘病毒科，根据抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)型。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定，仅感染人类；甲(A)型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，常引起世界性大流行。编码基质蛋白的M基因是A型流感病毒共有且较保守。采用Taqman技术，针对M基因中特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，探针的5’端标记报告荧光基团(R)，3’端标记淬灭荧光基团(Q)。在PCR退火阶段，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下沿着模板链合成新链，当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，Taq酶发挥5’一3’外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，标记在探针上的R基团就游离出来，R所发出的荧光不为Q所吸收而被检测仪所接收，随着PCR反应的进行，PCR产物量与荧光信号呈现正比关系。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27539--20115材料与试剂5．1仪器设备5．1．1荧光PCR检测仪。5．1．2高速微型离心机(离心速度12000r／min以上)。5．1．3台式高速离心机(离心速度3000r／min以上)。5．2试剂5．2．1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验室用水符合GB／T6682的要求。所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5．2．2DEPC水(见附录B)。5．2．3Trizol。5．2．4氯仿。5．2．5异丙醇：一20℃预冷。5．2．6PBS：(121-4-2)℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000U／raL。5．2．775％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，--20℃预冷。5．2．8A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液体系组成及使用注意事项见附录B。6抽样6．1采样工具下列采样工具应该经(121士2)℃，15rain高压灭菌并烘干：——棉拭子；——剪刀；——镊子；——注射器；——1．5mL离心管；——研钵。6．2样品采集6．2．1活动物取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：—～取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取鼻腔分泌液；——取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取咽喉分泌液——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便；——将采样后的拭子分别放人盛有1．0mLPBS的1．5mL离心管中，加盖、编号。6．2．2脏器或肌肉组织用无菌镊子采集待检脏器或肌肉组织，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27539--20116．2．3血清、血浆用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。6．2．4动物皮采样方法按照SN／T1330，将待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。6．3样品贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，24h内送实验室。6．4样品处理6．4．1拭子样品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，3ooor／min离心5rain，吸取上清液1mL转人无菌的1．5mL离心管中备用。6．4．2脏器或肌肉组织取待检样品2．0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃，取上清液1mL转入无菌的1．5mL离心管中，编号备用。6．4．3动物皮先用消毒的镊子、剪刀将动物皮剪成1mrn3大小的颗粒，称取2．0g于无菌的研钵中，加液氮充分研磨后，加10mLPBS混匀，4℃，3000r／rain离心5rain，取上清液1mL转入无菌的I．5mL离心管中，编号备用。6．5样品存放制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。7操作方法7．1实验室设置标准与生物安全管理A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测按照GB／T27401，GBl9489，GB／T19495．2的规定。7．2样品核酸提取7．2．1在样品制备区进行。取n个灭菌的1．5mL离心管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，编号。7．2．2每管加入600pLTrizol，分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200pL，混匀，再加入200pL氯仿，上下颠倒混匀。于4℃、12000r／rain离心15rain。7．2．3取与7．2．1相同数量灭菌的1．5mL离心管，加入等体积异丙醇(～20℃预玲)，做标记。吸取本标准7．2．2各管中的上清液转移至相应的管中，吸取上清液，不能吸出中间层，颠倒混匀。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27539--2017．2．4于4℃、12000r／min离心15rain，小心倒去上清，加入600pL75％乙醇(一20℃预冷)，颠倒洗涤。7．2．5于4℃、12000r／rain离心10min，小心倒去上清，晾干。7．2．6加入11pLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r／rain离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT—PCR扩增，若需长期保存应放置--70℃冰箱。7．3检测7．3．1扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。荧光RT_PCR反应液体系组成见附录B，充分混匀后，转移至样品处理区。7．3．2加样在样品处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入样品处理7．2．6中制备的RNA溶液各10pL，盖紧管盖500r／rain离心30s。7．3．3荧光RT-PCR反应在检测区进行。将本标准7．3．2中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。循环条件设置：第一阶段，反转录42℃、30rain。第二阶段，预变性92℃、3rain。第三阶段，92℃、10s，45℃、30s，72℃、1min，5个循环。第四阶段，92℃、10s，60℃、30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光衄线和ct值判定结果。8结果判定8．1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8．2质控标准8．2．1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。8．2．2阳性对照的ct值应小于28．0，并出现典型的扩增曲线。8．2．3当8．2．1和8．2．2都成立时，此次试验才有效；否则，此次试验视为无效。8．3结果描述及判定8．3．1阴性无ct值并且无扩增曲线，判为阴性。 8．3．2阳性ct值小于30，且出现典型的扩增瞌线，判为阳性。8．3．3有效原则ct值大于30的样品建议重做。重做结果无ct值者为阴性，否则为阳性。GB／T27539--2011 GB／T27539--2011附录A(规范性附录)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配方A．1A液(0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液)NaH2P04·HzO27．6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至l000mL。A．2B液(0．2mol／L磷酸氢二钠水溶液)Na2HP04·7H2053．6g，(或Na2HPO。·12HzO71．6g或Na2HP04·2HzO35．6g)加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。A．30．01mol／L、pH7．2磷酸盐缓冲生理盐水的配制60．2raol／LA液0．2mol／LB液NaCl用蒸馏水稀释至l000mL。14mL36mL8．5g B．1引物探针序列引物探针序列见表B．1。附录B(规范性附录)引物探针序列及RToPCR反应体系组成表B．1引物探针序列GB／T27539--2011名称序列上游引物5t_GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-37下游引物5’一AAGATCTGTGTTcTTTCCTGCAAA一3’探针5"-(FAM)一CCCTCAAAGCCGAGATCGC-(TAMRA)一3’B．2RT-PCR反应液体系组成10×PCRBuffer上游引物(10／zmol／L)下游引物(10t,tool／L)探针(10t*mol／L)MgCl2(25retool／L)dNTPs(25mmol／L)Taq酶RT-PCR反转录酶颗粒补H20(RNase-free)至B．3说明2pL“L肛LttL0．75tLL0．1ttL0．25t*L0．25颗15tLLDEPC水，是用1％DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。B．4使用时的注意事项在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。RT-PCR反转录酶颗粒极易吸潮失活，应在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量剩余部分立即放回干燥器中。'