GBT27540-2011猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf 7页

'ICS11．220B41a园中华人民共$-n国国家标准GB／T27540—2011猪瘟病毒实时荧光RT—PCR检测方法Methodofthereal-timeRT—PCRforthedetectionofclassicalswinefevervirus2011—11—21发布2012-03-01实施丰瞀徽紫瓣警攒瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厦19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚置GB／T27540一201本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围猪瘟病毒实时荧光RT—PCR检测方法GB／T27540—2011本标准规定了猪瘟病毒(Classicalswine{evervirus，CSFV)实时荧光RT—PCR检测方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。CSFV：猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus)Ct值：达到阈值的循环数(cyclethreshold)DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶(HSTaqDNApolymerase)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链式反应(realtimefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction)4试剂和材料除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。4．1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃～8℃保存。4．2氯仿：4℃预冷。4．3异丙醇：4℃预冷。4．475％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。4．5DEPC水：去离子水中加入0．1％DEPC，37℃作用1h，(121土2)℃，高压灭菌15min。4．6RNA酶抑制剂(30U／t-L)。4．710×PCRbuffer(10mmol／LpH8．3Tris—HCI，50mmol／LKCI，1．5mmol／LMgCl2)。4．8dNTP(2．5mmol／L)。4．9用于RT—PCR反应的引物浓度为10pmol／L，探针浓度为5gmol／L，其序列如下：上游引物F：5一TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA一3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27540—2011下游引物R：5一CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3探针P：5-FAM—CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA—TAMRA一34．10反转录酶：SuperscriptII反转录酶(200U／pL)。4．11DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶(5u／“L)。4．12阴性对照：DEPC水。4．13强阳性对照：非感染体外转录RNA(4200pg／pL)。4．14弱阳性对照：非感染体外转录RNA(42pg／p-L)。5器材和设备5．1高速台式冷冻离心机：最大离心力120009以上。5．2冰箱。5．3荧光PcR检测仪。5．4组织匀浆器。5．5微量移液器和吸头。5．6离心管。6样品的采集6．1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴～次性手套，样本不得交叉污染。6．2采样工具扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3％氢氧化钠溶液浸泡消毒5min～10rnin经清水冲洗。灭菌牙签和0．5mL或1．5mL离心管经(121士2)℃，高压灭菌15rain；剪、镊经160℃干烤2h。6．3采样方法6．3．1活体样品固定活猪的上唇，用开口器打开El腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0．5mL或1．5mL离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1：5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，30009离心1,5min，取上清液转入离心管中编号备用。6．3．2内脏样品采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50rng～100mg待检样品，按1：5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，30009离心1srain，取上清液转入离心管中编号备用。6．3．34％EDTA抗凝血用无菌注射器直接全血，注入含1／104％EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27540—2016．3．4排泄物挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，振荡混匀，室温30009离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。6．3．5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入离心管中编号备用。6．4存放与运送采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h～8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7实时荧光RT-PCR检测7．1核酸提取在样本制备区进行。7．1．1取n个灭菌的1．5mL离心管，其中n为待检样品数×重复数3+阳性管数+弱阳性管数+阴性管数，对每个离心管进行编号。7．1．2每管加入500pLTrizo|，分别加入被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各200pL(由于阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染)，颠倒lo次混匀，静置5min；再加入200pL氯仿，混匀器上振荡混匀5s(也可以用手反复颠倒混匀)。于4℃、120009离心15min。7．1．3取与7．1．1中相同数量灭菌的1．5mL离心管，加入500pL异丙醇(4℃预冷)，对每个管进行编号。取7．1．2中离心后的上清液约500pL(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，一20℃静置30min。7．1．4于4℃、120009离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600pL75％乙醇，颠倒洗涤。7。1．5于4℃、120009离心10mJn(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。7．1．640009离心10s(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3min～10min。7．1．7加入38pL经DEPC处理的水和2pLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增；若需长期保存应放置--70℃冰箱。7．2荧光RT-PCR扩增体系的配制在反应混合物配制区进行。设PCR反应数为n，其中n为待检样品数×重复数3十阳性管数+弱阳性管数+阴性管数，每个样本测试反应体系配制见表1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27540—201表1每个样品反应体系配制表体系组分用量终浓度10XPCRBu{fer5．0t*L1×dNTPs1．5pL0．075／*mol／L猪瘟病毒RT—PCR反应液上游引物F3．Op-LO．6V-rod／L下游引物R3．0卢L0．6／1mol／L探针溶液探针PI．5p-L0．15／*mol／LSuperscriptⅢ反转录酶0．3uL2U／uL反应酶HSTaqDNA聚合酶0．5“L0．05U／／2L总量14．8"L7．3加样在样本处理区进行。在各设定的荧光RT—PCR管中分别加入本标准7．1．7中制备的35．2pLRNA溶液，盖紧管盖后500r／min离心30S。放人荧光PCR检测仪内。7．4荧光RT-PCR扩增在检测区进行。将本标准7．3中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。循环条件设置：a)反转录50℃／20min；b)预变性94℃／4min；c)88℃、8S，60℃、35S，40个循环。荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延伸时进行。7．5结果判定7．5．1阈值设定试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和ct值直接读取检测结果，ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。7．5．2质控标准7．5．2．1阴性对照无ct值，且无典型扩增曲线。7．5．2．2强阳性对照的ct值应<27．0并出现典型的扩增曲线；弱阳性对照的ct值应在34．0左右并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。7．5．3结果描述及判定7．5．3．1阴性无ct值并且无典型的扩增茁线，表示样品中无CSFV核酸。 7．5．3．2阳性GB／T27540—2011ct值≤34．o，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在CSFV核酸。7．5．3．3可疑ct值>34．0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现ct值≤34．0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。'