GBT27538-2011动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法.pdf 0页

'ICS11．220B41a雷中华人民共和国国家标准GB／T27538--2011动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法Animalinfluenzadetection--MethodofpyrosequencingforHAandNAininfluenzavirusA(H1N1)2011-11-21发布2012—03—01实施宰瞀鹳紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T27538--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、朱来华、张鹤晓、单虎。 1范围动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法GB／T27538--2011本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型HINl流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸序列检测方法。本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求NY／T541动物疫病实验室检验采样方法SN／T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ATP：三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)PBS：磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelaneedsolution)Pyrosequencing：焦磷酸测序RT-PCR：反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleieacid)Taq酶：TaqDNA聚合酶4原理焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APs)、荧光素孵育，逐一加人四种dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi)；ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰。每个光信号的峰高与反应中掺人的核苷酸数目成正比。ATP和未掺人的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27538--20115试剂和材料5．1除特别说明外，本标准所用试剂为分析纯或生化试剂，所有试剂均用无RNA酶污染的器具(用DEPC水处理)分装，实验用水符合GB／T6682的规定。5．2焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A。5．3AMV反转录酶。5．4TaqDNA聚合酶。5．5PyroGoldSqAReagentsDNA序列分析试剂盒或其他等效试剂。5．6DNTPs。5．7琼脂糖(电泳纯)。5．8三氯甲烷。5．9异丙醇。5．1070％乙醇：配制方法见附录B。5．11DNA分子量标准品(100bp～2000bp)。5．12裂解液：Trizol或其他等效总RNA提取试剂。5．13PBS：配制方法见附录B。5．1410×PCR缓冲液：建议使用厂家提供，如需配制见附录B。5．15电泳缓冲液：配制方法见附录B。5．16溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg／mL。5．17电泳加样缓冲液：配制方法见附录B。5．18磁珠悬液。6仪器设备6．1焦磷酸测序仪。6．2焦磷酸测序仪96孔板。6．3真空吸附器。6．4PCR仪。6．5冷冻离心机(最大离心力120009以上)。6．6微量移液器。6．7电泳仪。6．8紫外检测仪。6．91．5mLEppendorf管。7采样和样品制备7．1采样按照NY／T541和GB／T18088选取样品。样品处理和其他实验活动符合GB19489的有关规定。7．2样品处理7．2．1鼻腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，30009离心5rain，取上清液2 GB／T27538--20”转入无菌的1．5mLEppendorf管中，编号备用。7．2．2肌肉或组织脏器取待检样品2．0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4℃，30009离心15min，根据需要取上清液转入无菌的1．5mLEppendorf管中，编号备用。7．3样本存放制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。8操作方法8．1病毒RNA的提取8．1．1取灭菌的1．5mLEppendorf管，编号。8．1．2用微量移液器向每管中各加入600pL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200pL，混匀后再加入200pL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀30s。于4℃120009离心15min。8．1．3取与8．1．1相同数量灭菌的1．5mLEppendorf管，加人一20℃预冷的500pL异丙醇，做标记。吸取本标准8．1．2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500pL。8．1．4于冷冻离心机上4℃120009离心15rain，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体；加入600pL70％乙醇，颠倒洗涤。8．1．5于4℃120009离心10rain，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，室温干燥。8．1．6加入10pLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，20009离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置一70℃冰箱。8．2RT-PCR扩增8．2．1反转录在3止模板中分别加人2止25mmol／LMgCI：，1旺10×PCR缓冲液，l旺2．5mmol／LdNTP，0．25pL40U／／1LRNA酶抑制剂，0．5pL5U／／1LAMV反转录酶，0．5pL20pmol／pL焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物，用DEPC水补足体积至10PL，瞬时离心混合。在PCR仪上进行反转录，条件为42℃30min，98℃1min，冷却到4℃。8．2．2PCR反应8．2．2．1PCR反应体系在反转录后的10pLcDNA溶液中加入10×PCR缓冲液5pL，5u／pLTaqDNA聚合酶0．25ILL，20pmol／pL焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物各0．5pL，DEPC水补足体积至50pL，在PCR仪上扩增。8．2．2．2PCR循环条件8．2．2．2．1A型H1N1流感病毒HA基因：94℃预变性5min，94℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸305，共循环45次；然后72℃再延伸10rain。8．2．2．2．2A型H1N1流感病毒NA基因：94℃预变性5rain，94℃变性30s，56℃退火30S，3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27538--20”72℃延伸30S，共循环45次；然后72℃再延伸10min。8．2．2．2．3A型HINt流感病毒墨西哥株HA基因：94℃预变性5rain，94℃变性30S，58℃退火30s，72℃延伸30s，共循环45次；然后72℃再延伸10rain。8．2．2．2．4A型HINI流感病毒墨西哥株NA基因：94℃预变性5rain，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸308，共循环45次；然后72℃再延伸10rain。8．2．3对照系统检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。8．3PCR扩增产物电泳检测在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶；将3pL～6pLPCR扩增产物分别和适量电泳加样缓冲液混合，点样；以DNA分子量标准品做对照；9V／cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录；扩增到目标片段的PCR产物用于测序。8．4焦磷酸测序8．4．1测序单链模板的制备8．4．1．1测序使用焦磷酸测序专用试剂盒或其他等效试剂。8．4．1．2在焦磷酸测序仪96孔板中每孔预先加人44pL退火缓冲液，1pL20pmol／／-L测序引物，混匀。8．4．1．3混匀磁珠悬液，将需要使用的磁珠总量(按每样3pL)转移到一个1．5mLEppendor{管中，加入结合缓冲液，使得平均每样达50pL。8．4．1．4将50pL标记有生物素的PCR产物与50pL链霉亲和素包被的磁珠混合，在室温25℃下振荡孵育20rain。8．4．1．5用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在纯水中清洗30s；在70％乙醇中清洗5s；变性缓冲液洗55≠最后移到洗涤缓冲液中清洗10s。8．4．1．6真空吸附器放人含有焦磷酸测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2rain，再冷却到室温。8．4．2测序反应测序反应在28℃下于焦磷酸测序仪上进行，加样使用600mb／8ms的加样压力和时间，每轮反应时间65s。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。8．5结果判定8．5．1A型IllNI流感病毒的确定8．5．1．1HI和N1RT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与HI、NI目标片段完全相同的，确定为A型HINl流感病毒亚型。8．5．1．2H1和N1RT—PCR反应均为阳性的，HI和N1测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定为可疑，进行HA或HA基因全序列测定，确定其亚型和毒株，如为HINt变异株，建议将其作为新序列公布，以供其他诊断参考。8．5．1．3HI、N1RT_PcR反应全部或有一个为阴性的判定为非A型HINl流感病毒。4 8．5．2A型HINI流感病毒墨西哥变异株的确定GB／T27538--20118．5．2．18．5．1中确定为A型HINl流感病毒的样品，建议采用A．2中的引物，按照8．1到8．4的程序进行测序。8．5．2．2所得序列参照8．5．1中的方法，对照附录C中的A型HINI流感病毒墨西哥变异株的目标片段确定是否为A型HINI流感病毒墨西哥变异株。9检测过程中防止交叉污染的措施按照SN／T1193要求执行。10废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27538—2011附录A(规范性附录)RT-PCR及测序引物A．1A型H1N1流感病毒RT-PCR及测序引物H1基因上游引物(88bp)H1基因下游引物H1基因测序引物N1基因上游引物(249bp)N1基因下游引物N1基因测序引物5’一TTTGGCGATCTACTCCACAGTCl3’5"-ACCCATTAGAACACATCCAGAAGC-35"-AGAACACATCCAGAAGCl3’5’一AATTGGCATGGCTCAAATCG一3’5’一TGGATCCCAAATCATCTCAAAA一3’5，_CGTTTAAATACGGCAAT一3’A．2A型H1N1流感病毒墨西哥变异株RT-PCR殛测序引物6H1基因上游引物(86bp)H1基因下游引物H1基因测序引物N1基因上游引物(147bp)N1基因下游引物N1基因测序引物57生物素标记5’生物素标记57一GAAGACAAGCATAACGGGAAACl35"-AGGATccAGccAGcAATGTTA(’-35’生物素标记57一CAAGCATAACGGGAAA一357一GGGAATCAAAATCAGATTGAAACA一35"-GGAATTGcCCGCTAATTTcA‘·357生物索标记5"-CAACTTTGCTGCTGG-3 B．170％乙醇附录B(规范性附录)试剂配制取70mL乙醇加蒸馏水稀释定容至100mL。B．2磷酸盐缓冲生理盐水配方GB／T27538--201B．2．1A液(0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液)一水合磷酸二氢钠(NaHzPO。·Hz0)27．6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1000mL。B．2．2B液(0．2mol／L磷酸氢二钠水溶液)七永合磷酸氢二钠(Na=HPn·7HzO)53．6g，[或十二水合磷酸氧二钠(Na：HPO。·12H。o)71．6g或二水合磷酸氢二钠(Na：HPO。·2H。O)35．6g]加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。B．2．30．01mol／LpH-／．2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0．2mol／LA液14mL0．2mol／LB液36mL氯化钠8．5g用蒸馏水稀释至1000mL。B．310xPCR缓冲液500mmol／LKCl100mmol／LTris—CI(pH8．3，室温下)15mmol／LMgCl2在1．05kg／cm2高压下蒸汽灭菌10min。分装后贮存在--20℃。B．4电流缓冲液B．4．1贮存液(50x)Tris242g冰乙酸57．1mL0．5mol／LEDTA(pH8．0)100mL加蒸馏水至1000mL。B．4．2使用液将上述贮存液做50倍稀释。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27538--201B．5溴化乙锭贮存液取1g溴化乙锭加蒸馏水稀释定容至100mL，磁力搅拌数小时，确保完全溶解。然后用铝箔包裹容器或将溶液保存于棕色瓶中，于室温保存。B．6电渌加样缓冲液溴酚蓝蔗糖加水稀释至100mL。0．25g40．0g 附录C(规范性附录)已知亚型目标片段GB／T27538--201A型HINI流感病毒H1目标片段：GGGGGCAATA型HINI流感病毒N1目标片段：GGTGTTTGGATAGGA型HINI流感病毒墨西哥变异株HI目标片段：TGCAAACTAAGAGGGGTAA型HINI流感病毒墨西哥变异株N1目标片段：cAGTcAGTGGTT9'