GBT27644-2011禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法.pdf 10页

'Ics11．220B41a宦中华人民共和国国家标准GB／T27644--201禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法Protocolofreal—timePCRfordetectingGallidHepersVirus22011-12-30发布2012-04-01实施宰瞀鳃鬻瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚禹GB／T27644--201本标准按照GB／Tll1--2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、扬州大学、河南农业大学。本标准主要起草人：詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书琨、秦智锋、陈兵、高小博。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法本标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于禽疱疹病毒2型的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件GB／T27644—2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA：deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸。dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate三磷酸脱氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种脱氧核糖核苷。EDTA；ethylenediarninetetraaceticacid乙二胺四乙酸。GHV2：GallmHepersVirus2禽疱疹病毒2型(马立克氏病病毒血清1型)。MD：Marek’SDisease马立克氏病。PBS：phosphatebelaneedsolution磷酸盐缓冲生理盐水。PCR：polymerasechainreaction聚合酶链式反应。Real—timePCR：Real—timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链反应。Taq酶：Thermusaquaticuspolymerase耐热DNA聚合酶。4试剂4．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。4．2禽疱疹病毒2型荧光PCR检测试剂盒，一20℃保存，组成及使用注意事项参见附录A。4．3引物和探针序列(产物长度142bp)上游引物：5’CCACCACCTCCCATCTGTAC3’下游引物：5’GACAAGGCTGAGCGTAAAcc3’TaqMan探针：5’AcAcGGcTcGGTAAcAGGAcAcAATG3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。4．41％肝素钠，配制方法见B．1，4℃保存。4．5三氯甲烷，常温保存。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27644—20114．6异丙醇，使用前预冷至--20℃。4．7无水乙醇。4．875％乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。4．90．01mol／LPBS，pH7．2，配制方法见B．2。5器材和设备5．1无菌注射器，1mL，5mL，10mL，25mL，100mL。5．2一次性无菌塑料袋。5．31．5mL无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。5．40．2mL无DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。5．5荧光PCR检测仪。5．6高速台式冷冻离心机，可控温至4℃、离心速度可达120009以上。5．7振荡器。5．8研钵。5．9普通冰箱和超低温冰箱：规格2℃～8℃，--20℃，一80℃。5．10微量移液器，0此～2pL，lpL～10止，10vL～100儿，20pL～200此，100止～1000pL，并配备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。6样品的采集和处理6．1样品的采集6．1．1全血用预先加入1％肝素钠的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendorf管中，盖上管盖并编号。6．1．2羽毛和组织脏器取待检羽毛OA根部挤出少量羽髓)、肝脏、肾脏和脾脏样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。6．2样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。6．3样品处理6．3．1全血30009离心30min，取棕黄色层转人无菌的1．5mLEppendor{管中，加入500pLPBS洗涤，30009离心15min，弃上清，编号备用。6．3．2羽毛或组织脏器取待检样品2．0g加入2mLpH7．2的0．01mol／LPBS于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，分装编号备用。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27644—20116．4样本存放制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)，淋巴细胞样品在2℃～8℃条件下保存。7核酸提取及荧光PCR检测7．1注意事项实验室注意事项见附录C。7．2核酸提取7．2．1取n个灭菌的1．5mLEppendorf管(n为被检样品之和)，编号。7．2．2每管加入250pLDNA提取液(参见附录A)，然后分别加入被检样本各250pL，一份样本换用一个吸头，再加入10pL蛋白酶K(1mg／mL)，混匀器上振荡混匀，56℃消化2h，加入等体积的三氯甲烷，混匀，150009离心15min。7．2．3取与7．2．1相同数量灭菌的l_5mLEppendorf管，吸取7．2．2各管中的上清液转移至相应的管中，不能吸出中间层，然后再分别加入等体积的一20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀。7．2．4150009离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入800pL75％乙醇，颠倒洗涤。7．2．5150009离心10min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。7。2．650009离心10s，小心倒去上清，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min～10rain。7．2．7加入10pL灭菌双蒸水，溶解管壁上的DNA，60009离心5s，4℃保存备用。若需长期保存须放置一80℃冰箱。7．3扩增检测7．3．1扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。取出MDVPCR反应液(参见附录A)，在室温下融化后，10009离心5s，每个PCR反应按表l配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照)：表1试剂MDVPCR反应液Taq酶I用量21．75“L0．25ILL将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装22pL，转移至样本处理区。7．3．2加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸3pL，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27644--20117．3．3PCR扩增检测在扩增检测区进行。7．3．4反应条件设定第一步：50℃2min，95℃5rain；第二步：95℃5s，60℃45s，40个循环60℃时设置采集荧光。7．3．5荧光素设定ReportDye设定为FAM，QuenchDye设定为BHQ(或Tamra或Eclipse)；Referencedye设定为自带校正荧光ROX，如使用其他品牌仪器应设为空白或自带校正。8条件设定及结果判定8．1条件设定禽疱疹病毒2型阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照有s型PCR扩增曲线，而且ct值≤35阴性对照无S型PCR扩增曲线，而且ct值显示为无。否则此次实验结果无效。8．2结果判定及描述8．2．1ct值≤35的样本为阳性，表明禽疱疹病毒2型核酸阳性。ct值显示为无的样本为阴性样本，表明禽疱疹病毒2型核酸阴性。8．2．2对于35