GBT27639-2011结核病病原菌实时荧光PCR检测方法.pdf 11页

'ICS11．220B41a园中华人民共和国国家标准GB／T27639--2011结核病病原茵实时荧光PCR检测方法Real—timePCRmethodforthedetectionoftuberculosispathogenicorganisms2011-12-30发布2012-04-01实施宰瞀鹊鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖吾GB／T27639--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、华中农业大学、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、吴晓薇。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围结核病病原菌实时荧光PCR检测方法GB／T27639--2011本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物、血样、奶样、痰液、组织器官、粪便等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682--2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489--2008实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。DMSo：dimethylsulfoxide，二甲基亚砜。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。PBS：phosphatebuffersolution，磷酸盐缓冲液。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。Taq酶：TaqDNA聚合酶。UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。4原理本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA的引物，和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5’端标记了被称为报告基团的荧光素，3’端标记了淬灭基团。在进行PCR延伸反应时，Taq酶的5’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使其与淬灭基团分离，从而仪器能检测到5’端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测判的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光PCR检测方法(见表1)。其中，结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光PCR方法分别以IS6110、ISl081插入基因序列为模板设计特异扩增引物与探针；结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的实时荧光PcR方法分别以菌种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27639--2011表1荧光PCR引物与探针序列类别核酸序列上游引物：5’GcAGGGTTCGCCTACGTG3’结核分枝杆菌复合下游引物：5’CGGGTCCAGATGGCTTGC3’群(IS6110)探针‘：5LFAM-TGTCACCGACGCCTACGCTCGC3LBHQl上游引物：5’CCAGGAAcGCCTCAACC3’结核分枝杆菌复舍下游引物：5’CGACGAGGCGGATGATC3’群(ISl08D探针‘：5，一FAM-AGAGGTACGCCGAACCGAC—BFIQ-1上游引物：5’CGGTGTAATCAGTTTTGAAGC3’结核分枝杆菌下游引物：5’CGATTGGAACGGCGAAGC3’探针‘：5’一FAM—TAGGTAGTCCAGTAGAGCCCCATAGCCA3’一BHC卜1上游引物：5’ACGCCTTCCTAACCAGAATTG3’牛分枝杆菌下游引物：5’GGCTATTGACCAGCTAAGATATCC3’探针‘：5’一FAM-AATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAA3LBHq-15探针5’端标记的报告荧光基团及3，端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。5材料与试剂5．1仪器与耗材5．1．1接种棒。5．1．2无菌注射器或真空采血管。5．1．3灭菌容器。5．1．4橡胶管。5．1．5刮匙。5．1．6Ⅱ级生物安全柜。5．1．7荧光PCR仪。5．1．8恒温水浴锅(室温至100℃)。5．1．9离心机(最高离心力达15000×g以上)。5．1．10混匀器。5．1．11冰箱(2℃～8℃，一20℃，一80℃)。5．1．12天平(精密度达千分之一以上)。5．1．13微量可调移液器(10pL，100pL，1000pL)。5．1．14微量带滤芯吸嘴(10pL，100pL，1000pL)。5．1．15研钵。5．1．16离心管。5．1．17PCR光学反应管。5．2试剂5．2．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T6682--2008规定的二级水，所用化学试2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载CS／T27639--2011剂均为分析纯。5．2．2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针(序列见表1)配制成100ttmol／L储存液，置--20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10ttmol／L工作液，避免多次冻融。5．2．30．01mol／LPH7．6PBS：配方见A．1。5．2．4柠檬酸钠缓冲液：配方见A．2。5．2．50．5mo[／LEDTA：配方见A．3。5．2．6柠檬酸钠一磷酸缓冲液：配方见A．4。5．2．74％氢氧化钠溶液：配方见A．5。5．2．84％硫酸溶液：配方见A．6。5．2．9TritonX-100。5．2．10DNA提取液：含100mmol／LTris—HCl(pH8．o)，0．01％TritonX-100，200Fg／oL蛋白酶K。也可采用等效商品化试剂。5．2．11灭菌双蒸水。5．2．12三氯甲烷。5．2．13异丙醇。5．2．14无水乙醇。5．2．1570％乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，--20℃预冷。5．2．16荧光PCR反应缓冲液：含50mmol／LKCI，10mmol／LTris-HCl(pH8．3)，2．5mmol／LMgCl。，5％二甲基亚砜(DMsO)，5％甘油。可采用等效商品化试剂。5．2．17dNTP：dATP、dUTP、dCTP和dGTP。5．2．18Taq酶。5．2．19UDG酶。6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB194892008的有关规定。7采样7．1样品采集7．1．1细菌培养物直接取液体培养基培养的菌液}对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量(取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环)菌样，放到0．01mol／LpH7．6PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。7．1．2血样用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清，用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0．5mol／LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。7．1．3奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27639--2017．1．4痰液动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸人至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集：采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检。7．1．5组织器官采集动物下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官如肝、睥、肺等。7．1．6粪便采集混有粘液、血液、粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。7．2样品的保存和运输待检样品在2℃--8℃保存不应超过24h；一20℃保存不超过三个月；一80℃以下长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。8荧光PCR操作方法8．1样品前处理8．1．1血样、细菌培养物(蓖液)前处理取1mL～2mL全血样品，15000Xg离心10min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分振荡，15000×g离心10rain；弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。取1mL～2mL血清、菌液样品，15000×g离心10rain，弃上清，加1mL0．01mol／LpH7．6PBS，充分振荡混匀，15000×g离心10rain；弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置--20℃贮存备用。8．1．2奶样前处理取10mL奶液，加100pLTritonX一100，振荡混匀，2500×g离心20rain；弃上清，取沉淀，加1mL0．01mol／LpH7．6PBS，充分振荡混匀；将沉淀悬浮液移入微量离心管，15000×g离心10rain；弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置--20℃贮存备用。8．1．3痰液前处理在痰液样品中加入2倍～4倍体积4％氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置30rain，问或振荡混匀，使其充分液化(无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4％氢氧化钠溶液直至液化完全)；15000×g离心10min；弃上清，加lmL0．01mol／LpH7．6PBS，充分振荡混匀，15000Xg离心10rain，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置--20℃贮存备用。8．1．4组织器官前处理取适量组织样品(剔除脂肪、被膜)，剪碎，按1：5的比例加入柠檬酸钠一磷酸缓冲液(例如，1g组织样品，加入5mL缓冲液)，充分研磨；加等量4％氢氧化钠溶液，继续研磨5min～10rain，使组织液化；4 GB／T27639--2011移人离心管，充分振荡，75℃温浴0．5h～1h；取上清(避免吸取粗渣)，15000Xg离心10rain；弃上清，加等量O．01moi／LpH7．6PBS，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000×g离心10min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置--20℃贮存备用。8．1．5粪样前处理取粪样1g～2g，按1：5的比例加入4％硫酸溶液(例如lg粪样，加5mL液体)充分振荡混匀，室温静置0．5h～1h；取上层约3mL液体(避免吸取粗渣)，5000×g离心1rain，取上清，15000Xg离心10rain!弃上清，加等量0．01mol／LpH7．6PBS，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000×g离心10rain，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置--20℃贮存备用。8．2核酸提取在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加入50pL～100pLDNA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴30min，98℃～100℃加热10rain，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000Xg离心5rain，取上清，直接用于PCR或贮存于～80℃备用(适用于除粪样外的其他样品)。其中粪样样品还需进行以下步骤：加入等体积异丙醇(一20℃预冷)，颠倒混匀，放置5min～10rain；4℃，15000×g离心10rain，弃上清，加3倍体积70％乙醇(4℃预冷)，振荡洗涤；4℃，15000Xg离心10min，弃上清，室温干燥5rain；加入50pL无DNA酶、无RNA酶水，混匀、溶解核酸，直接用于PCR或贮存于～80℃备用。可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8．3荧光PCR扩增反应8．3．1对照设立从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活病原菌添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。8．3．2扩增试剂准备采用25pL反应体系，含以下成分：10mmol／LTris-HCl(pH8．3)，50mmol／LKCl，2．5mmol／LMgClz，0．2mmol／LdNTP，上、下游引物各0．2tLmol／I．，探针0．1#mol／L，5％DMSO，5％甘油，0．4U尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，1UTaqDNA聚合酶(Taq酶)，5pL模板。取出荧光PCR反应缓冲液等试剂，室温融化(Taq酶、UDG酶除外)，瞬时离心后置冰上，根据上述体系、按每个反应20pL的用量配制荧光PCR预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水补足，需配制的荧光PCR预混反应液数量等于样品个数加上对照个数再加一。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后在每个PCR光学管中分装20pL。8．3．3加模板在已分装有荧光PCR预混反应液的PCR光学管中每管分别加入5pL样品或对照的核酸模板，混匀，盖上管盖，放人荧光PCR检测仪内，记录样品放置顺序。8．3．4荧光PCR扩增反应反应条件设定：第一阶段：50℃2rain，95℃4min，1个循环；第二阶段：95℃10s，60℃45s，5 GB／T27639--201140个循环，荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。荧光素设定：报告荧光(reportdye)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定)，淬灭荧光(quenchdye)设定为None，校准荧光(referencedye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。9分析条件设定和结果判定9．1阈值设定综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。9．2质控阴性对照和空白对照应无ct值，阳性对照的ct值应≤30，且呈现s型典型扩增曲线。否则，此次实验视为无效。9．3荧光PCR结果分析殛判定阴性反应结果判定：检测结果呈现无ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应。阳性反应结果判定：检测结果呈现ct值≤35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应。对于35