GBT27635-2011斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法.pdf 9页

'ICS11．220B41蝠亘中华人民共和国国家标准GB／T27635—201斑点叉尾触嗜麦芽寡养单胞茵检测操作方法ProtocolofidentificationofStenotrophomonasmaltophiliafromIctaluruspunctatusRafinsque2011-12-30发布2012-04—01实施丰瞀徽鬻瓣警襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会况10 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖罱GB／T27635--2011本标准按照GB／T1．12009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：薛峰、蒋原、袁芳、王云飞、张睿、易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉、栾军、陈国强、乔华林、谢怀根。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围斑点叉尾触嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法本标准规定了斑点叉尾蛔嗜麦芽寡养单胞菌的分离与鉴定方法。本标准适用于对斑点叉尾鲴的嗜麦芽寡养单胞菌的分离、鉴定。2规范性引用文件GB／T2763512011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件；仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T4789．28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB／T66822008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。NA：nutrientagar，普通营养琼脂。TSA：tryptosesoyaagar，大豆胰蛋白胨琼脂。VIA：amphotericinB；imipenem；vancomycinhydrochloride，含有万古霉素、亚胺培南、两性霉素B的选择性平板。4设备和材料4．1冰箱：0℃～4℃。4．2恒温培养箱：28℃士1℃。4．3铂／铱接种环或玻璃棒。4．4滤纸。4．5发酵管。4．6天平：0g～100g，精确至0．5g。4．7均质器或灭菌乳钵。4．8灭菌广口瓶：500mL。4．9灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。4．10灭菌培养皿：直径90cm。4．11显微镜：10×～100×。5试剂和培养基5．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T668212008规定的二级水，所用化学试剂1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27635—2011均为分析纯。5．2普通营养肉汤、大豆胰蛋白胨琼脂(TSA)、普通营养琼脂(NA)、普通羊血营养琼脂和VIA的配制见附录A(也可按GB／T4789．28—2003中4．7规定)。5．3革兰氏染色液：按GB／T4789．28—2003中2．2规定。5．4氧化酶试剂：按GB／T4789．28--2003中3．18规定。5．5糖发酵管：麦芽糖按GB／T4789．28—2003中3．2规定。5．6DNA酶甲基绿琼脂：按GB／T4789．282003中4．51规定。5．7微量生化反应管：乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、L_苹果酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、2一酮戊二酸盐、丙酮酸盐生化反应，L_丙氨酸、D丙氨酸、L．谷氨酸盐、L_组氨酸和L_脯氨酸，按照GB／T4789．282003中规定。5．8API20E生化鉴定试剂盒。6检验程序斑点叉尾鲴嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图1。图1斑点叉尾蛔嗜麦芽寡养单胞菌检验程序 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7操作步骤GB／T27635--20117．1样品处理液的制备以无菌操作取出有病症鱼体，直接从鱼体肝、肾等组织中采样。如果是体长小于4crfx的幼鱼取整条鱼，如果是体长4cm～6cm的鱼取内脏。将鱼体或内脏25g均质于225mL营养肉汤中，28℃士1℃，需氧培养24h，无菌取培养液作为样品处理液。7．2细菌的分离将24h普通营养肉汤增菌液划线接种于VIA，置于28℃需氧培养24h，显微镜观察，背景未变化的单个优势菌落为可疑菌落。7．3可疑菌落筛选挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大豆胰蛋白胨琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板，置于28℃需氧培养24h。观察菌落的大小、形态。在普通营养琼脂上菌落呈灰白色，圆形，表面光滑，边沿整齐的半透明菌落；在大豆胰蛋白胨琼脂(TsA)平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径0．18mm～1．12mm的透明的无色菌落；在普通羊血琼脂平板上出现明显的口溶血环，且溶血环呈草绿色，有强烈的氨味。符合以上菌落特征的为可疑菌株。7．4嗜麦芽寡养单胞菌的鉴定7．4．1革兰氏染色对可疑茵落进行革兰氏染色，嗜麦芽寡养单胞菌为G杆菌，无荚膜，无芽孢，极生端鞭毛，鞭毛数不小于2。7．4．2氧化酶实验使用铂／铱接种环或玻璃棒，挑取单个可疑菌落，然后接种到用氧化酶试剂澜湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性，不变色为阴性，嗜麦芽寡养单胞菌为阴性。7．4．3麦芽糖氧化实验将可疑菌落无菌挑取到麦芽糖发酵管，28℃士1℃培养2h～3h，观察结果。嗜麦芽寡养单胞菌为氧化麦芽糖强阳性。7．4．4DNA酶反应实验在以甲基绿为指示剂的DNA酶培养基的试管或平皿上检测DNA酶活性，在该培养基上，围绕DNA酶阳性的细菌菌落的周围有一个清亮的环。将可疑菌落接种到上述DNA酶反应培养基中，28℃需氧条件下培养72h，观察结果。嗜麦芽寡养单胞菌为DNA酶反应阳性。7．4．5其他生化反应7．4．5．1API20E鉴定对上述均符合的可疑菌株用API20E生化鉴定试剂条鉴定，具体操作按照产品说明书进行。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27635—20117．4．5．2微量反应生化管实验除API20E鉴定方法外，也可以利用微量反应生化管，做乳糖、水杨苷、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、L-苹果酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、2一酮戊二酸盐、丙酮酸盐、L_丙氨酸、p丙氨酸、L-谷氨酸盐、L．组氨酸和L，脯氨酸生化实验。嗜麦芽寡养单胞菌均可以利用上述有机物，反应均为阳性。8结果报告可疑菌落全部符合7．4中的报告阳性结果：“检出嗜麦芽寡养单胞菌”，否则报告阴性结果：“未检出嗜麦芽寡养单胞菌”。4 A．1普通营养肉汤A．1．1基础培养基成分蛋白胨牛肉膏氯化钠蒸馏水A．1．2制备附录A(规范性附录)培养基与试剂6B／T27635--2011用蒸馏水溶解培养基基础成分，调节pH7．4，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121℃15min高压灭菌。A．2大豆胰蛋白胨琼脂(TSA)A．2．1基础培养基成分胰胨植物蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水A．2．2配制用蒸馏水溶解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7三角瓶分装此基础培养基，121℃15min高压灭菌。A．2．3制备2±0．2(25℃)，选取合适大小的当基础培养基的温度降至47℃～50℃时，混匀。倾注15mL基础培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。A．3普通营养琼脂培养基(NA)A．3．1基础培养基成分蛋白胨氯化钠牛肉膏粉酵母膏粉12g5g3g3g【mg∞0gOl351gro垤oo∞n叭姐氓¨ GB／T27635--2011琼脂蒸馏水A．3．2配制5g1000mL用蒸馏水溶解培养基基础成分，调节pH，以确保灭菌后pH为7．2士0．2(25℃)，选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基，121℃15min高压灭菌。A．3．3制备当基础培养基的温度降至47℃～50℃时，混匀。倾注15mL基础培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。A．4普通羊血琼脂A．4．1基础培养基A．4．1．1成分动物组织酶解物淀粉氯化钠琼脂水A．4．1．2配制23．0g1．0g4．0g8．0g～18．0g1000mL将基础组分溶于水，加热以促进溶解。调节pH，使培养基在高压灭菌后，在24℃时的pH为7．3士o．2，选取适当三角瓶进行分装。121℃15min高压灭菌。A．4．2合成培养基A．4．2．1组分basicmedium(基础培养基，见A．4．1)steriledefibrinatedhorse／sheepblood(无菌脱纤维马／羊血)A．4．2．2制备1000122L50mL当基础培养基的温度降至47℃～50℃时，加入无菌脱纤维马／羊血5mL／100mL，混匀。倾注15mL合成培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。A．5VIAA．5．1基础培养基A．5．1．1成分蛋白胨牛肉浸膏D一甘露醇10．0g1．0g10．0g 氯化钠琼脂溴百里酚蓝A．5．1．2配制5．0g15．0g0．06gGB／T27635--2011将基础培养基组分溶于水，加热以促进溶解。调节pH，使培养基在高压灭菌后，在25℃时的pH为7．34-0．2，选取适当三角瓶进行分装。121℃15min高压灭菌。A．5．2抗生素溶液A．5．2．1成分vancomycinhydrochloride()j"古霉素)5mg／Limipenem(亚胺培南)32mg／LamphotericinB(两性霉素B)2．5mg／LA．5．2．2制备用水溶解上述成分并且过滤除茵。A．5．3合成培养基A．5．3．1成分基础培养基(见A．5．1)，抗生素溶液(见A．5．2)。A．5．3．2制备当基础培养基的温度降至47℃～50℃时，加入抗生素溶液，混匀，形成合成培养基。倾注15mL此合成培养基于灭菌平皿中，静置使凝固。'