GBT27640-2011马痘诊断技术.pdf 10页

'ICS11．220B41a国中华人民共和国国家标准GB／T27640—20112011-12-30发布马痘诊断技术Diagnostictechniquesforhorsepoxdisease2012—04—01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学龠中国国家标准化管理委员会及111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB／T27640--201本标准按照GB／TL1—2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／Tc181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、肖西志、郑小龙、邓明俊、岳志芹、毕道荣、粱君妮、徐彪。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围马痘诊断技术本标准规定了马痘临床诊断、病毒分离与鉴定等诊断技术要求。本标准适用于马痘的诊断。2临床检查GB／T27640--20112．1临床特征病马于系部和球节处的皮肤上出现丘疹，随后变为水疱，最后为脓疱，并干涸而结痂。由于局部疼痛，可引起跛行，病马一般不显全身症状；有的病马于唇内侧、齿龈、舌、舌系带、颊部等粘膜上发生痘疹，也是先发丘疹，继而水疱和脓疱，脓疱破裂形成浅的溃疡；母畜外生殖器水肿，并在皮肤和粘膜上形成水疱、脓疱和溃疡，公畜的病变表现为阴茎、包皮和龟头上的痘疹样病变。2．2初步判定2．2．1根据临床特征可作出病马感染马痘的初步判定。2．2．2最终判定应进行病毒分离鉴定。3病毒分离3．1样品采集和运送要求采取病变部位的渗出液、水疱液和溃疡部位组织作为采集对象，尽量无菌采集，采集后低温送实验室进行病毒分离。3．2病毒分离试验3．2．1所需仪器、设备3．2．1．1CO。培养箱。3．2．1．2Ⅱ级生物安全柜。3．2．1．3倒置显微镜。3．2．1．4带冷冻功能的离心机。3．2．2材料准备3．2．2．1细胞培养基DMEM。3．2．2．2Hela细胞。3．2．2．3Hanks液(Hanks液，见A．1；含抗生素，见A．4)。3．2．2．4小牛血清。3．2．2．5待检马组织：采取病变部渗出液、水疱液或丘疹和溃疡部组织作为标本，用Hanks液配制成1：10悬液，以1500r／rain离心10min，取上清备用。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27640--20113．2．2．6接种方法：用含lO％d,牛血清的DMEM培养液培养Hela细胞，待细胞长成单层后弃去培养液。将3．2．2．5中的待检组织接种Hela细胞，然后加入含5％小牛血清的DMEM培养液。CO：培养箱内37℃，48h后观察细胞病变。3．3判定如果48h后出现明显的细胞病变，如细胞圆缩、聚集，可进一步做病毒鉴定。正常的Hela细胞为多角形，贴壁生长。4电子显微镜检查4．1材料准备4．1．1戊二醛，碳网膜，三羟甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸(Tris—EDTA)，磷钨酸(pH7．2)，滤纸，载玻片。4．1．2病毒液或待检病料，如病变部位的渗出液或水疱液。4．2负染操作方法4．2．1用戊二醛固定待检病料。4．2．2负染方法为：取一滴待检病料于载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴上1min，再置于一滴三羟甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸(Tris—EDTA)缓冲液中浸泡20S，然后用一滴1％的磷钨酸(pH7．2)染色lOS。取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。4．3判定电镜下见到砖形或大卵圆形，有一个双凹面的核心体，同时具有包膜。观察到上述结果，可判定为马痘感染。5分子生物学检测5．1材料准备5．1．1待检样品材料分离的病毒、病毒感染的细胞或所采集的病料，如病变部位的渗出液或水疱液。5．1．2仪器设备PCR仪，恒温水浴锅，电泳仪，冷冻离心机，凝胶成像系统或其他类似设备(观察电泳结果)，微波炉或相关仪器(琼脂糖凝胶的制备)，超声波破碎仪，一20℃冰箱。5．1．3试剂o．25％胰蛋白酶溶液(见A．2)，RNase，70％乙醇，TaqDNA聚合酶，PBS缓冲液，酚三氯甲烷，引物，dNTPs，去离子水，加样缓冲液，电泳缓冲液，溴化乙锭溶液(见B．3)或相关染料(现在已经有溴化乙锭的替代产品，而且无致癌性，如GelRed)。缓冲液的配方见附录B。5．2病毒基因组DNA的制备用0．25％的胰酶消化感染病毒的Hela细胞，3000r／rain离心5min，收集的细胞沉淀用PBS缓冲2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27640--2011液重悬，于95℃水浴灭活30min。重复离心，收集沉淀。再用2mLPBS缓冲液重悬细胞。将细胞至于冰浴，超声波粉碎，输出功率为40w，时间3min，每5S暂停5S。细胞经破碎后加人10pLRNase，37℃反应30min。待溶液温度降至室温后，加入400pL酚三氯甲烷，混匀后于冰浴中放置5min，然后13000r／rain离心5min，收集DNA沉淀。用70％乙醇洗沉淀一次。空气干燥沉淀，加入i00pL去离子水溶解DNA，分装保存于一20℃冰箱中备用。本步骤也可采取相关商品化的病毒DNA提取试剂盒。采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒DNA的提取。5．3痘苗病毒血细胞凝集素HA(Hemagglutinin，HA)基因的PCR扩增5．3．1引物序列上游引物：5’一ATGACACGATTGCCAATAC-3’；下游引物：5’-CTAGACTTTGTTTTCTG-3’。5．3．2各反应物浓度引物25pmol／／-L，dNTPs2．5mmol／pL，TaqDNA聚合酶5u／pL，反应体系为25pL。5．3．3扩增条件93℃，5rain，92℃，30S；55℃，30S；72℃，1min。共35个循环。预扩增片段大小为940bp。5．3．4电泳制备1％琼脂糖凝胶板，加样6pL～8pL，电压80V～100V，电流40mA～50mA，电泳30min～40rain。5．4马痘病毒的PCR检测5．4．1引物序列上游引物：5"-GAAAATCcAGATACAGCCACC>3’；下游引物：5’-ACGCTGAAACGGAACCTGTAT一3’。5．4．2各反应物浓度引物25pmol／pL，dNTPs2．5mmol／／』L，TaqDNA聚合酶5u／pL，反应体系为25pL。5．4．3扩增条件93℃，5rain，93℃，30S，53℃，30S，72℃，30s，35个循环。预片段大小为637bp。5．4．4电泳制备1％琼脂糖凝胶板，加样6pL～8pL，电压80V～100V，电流40mA～50mA，电泳30rain40min。5．4．5结果判定如果不出现940bp和637bp大小的片段，判定为阴性；如果出现940bp和637bp中的任何一个片段则判定为阳性，并对PCR产物进行测序，与参考毒株进行序列比对。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27640—20116结果的综合判定根据2．2，可作出初步判定。确诊需要根据4．3、5．4．5进行最终判定，如果电子显微镜检查发现特征性病毒粒子可判为马痘阳性，否则为阴性；如果PCR检测结果为阳性，可判为马痘阳性，否则为马痘阴性。当4．3和5．4．5结果不一致时，以5．4．5结果为准。4 A．1汉克液(Hanks)(10倍浓缩液)A．1．1成分A．1．1．1成分甲氯化钠氯化钾氯化钙硫酸镁(MgSOt·7HzO)A．1．1．2成分乙磷酸氢二钠(Na。HPO。·12H。O)磷酸二氢钾葡萄糖1％酚红A．1．2配制方法附录A(规范性附录)细胞培养用试剂的配制80．0g4．0g1．4g2．0g1．52g0．6g10．0g16mLGB／T27640--2011按顺序将上述成分分别溶于双蒸水450mL中，即配成甲液和乙液，然后将乙液缓缓加入甲液，边加边搅拌。补足双蒸水至1000mL。用滤纸过滤后，加入三氯甲烷2mL，置2℃～8℃保存。A．1．3使用方法使用时，用双蒸水稀释10倍，107．6kPa灭菌15min，置4℃保存备用。用前以7．5％碳酸氢钠溶液调pH为7．2～7．4。A．20．25％胰蛋白酶溶液A．2．1成分氯化钠氯化钾柠檬酸钠(Na。C。H。O，·5H：O)磷酸二氢钠(NaHzPO。·2Hz0)碳酸氢钠胰蛋白酶(1：250)双蒸水8．0g0．2g1．12g0．056g1．0g2．5g加至1000mLA．2．2配制方法放2℃～8℃冰箱过夜，待胰酶充分溶解后，用碳酸氢钠溶液调pH为7．4～7．6。用0．2pm的微5 GB／T27640—2011孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装于小瓶中，--20℃保存。A．3EDTA-胰蛋白酶分散液(10倍浓缩液)A．3．1成分氯化钠80．0g氯化钾4．0g葡萄糖10．0g碳酸氢钠5．8g胰蛋白酶(1：250)5．0g乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)2．0g按顺序溶于双蒸水900mL中，然后加入下列各液：1％酚红溶液2．0mL青霉素(10万IU／mL)10．0mL链霉素(10万btg／mL)10．0mL补足双蒸水至1000mLA．3．2过滤除菌用0．2btm的微孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装小瓶，--20℃保存。A．3．3分装临用前，用双蒸水稀释10倍，适量分装于试管中，--20℃冻存备用。A．3．4使用方法分散细胞时，将细胞分散液取出融化后，再置35℃～37℃热水中预热，并用7．5％碳酸氢钠调pH为7．6～8．0。A．4抗生素溶液(1万IU／mL)A．4．110倍浓缩液青霉素400万IU(80万单位／瓶×5瓶)链霉素400万pg(100万单位／瓶×4瓶)双蒸水40mL溶液充分混合后，分装小瓶，放--20℃保存。A．4．2工作溶液取上述浓缩液适量，用双蒸水稀释10倍，分装后放于--20℃保存备用。A．5Tris-EDTA缓冲液10mmol／LTris·C1，pH7．51mmol／LEDTA，pH8．0 A．65％乳汉液GD／T27640--2011水解乳蛋白5g汉克氏液1000mL完全溶解后适量分装，经107．6kPa灭菌15rain，放2℃～8℃保存备用，用时以7．5％碳酸氢钠溶液调pH到7．2～7．4。 GB／T27640--2011B．110×加样缓冲液20％(质量浓度)Fieoll4000．1mol／LNazEDTA，pH8．01．0％(质量浓度)SDS0．25％(质量浓度)溴酚蓝0．25％(质量浓度)二甲苯青B．250XTAE电泳缓冲液Tris碱冰乙酸Na2EDTA·2H20加H：0至1L。B．31000x溴化乙锭溶液附录B(规范性附录)电泳用试剂的配制242g57．1mL37．2g溴化乙锭50tagH20100mL按1：1000稀释配制凝胶和染色液，溶液应避光。小心：溴化乙锭是一种诱变剂，必须小心操作。B．4PBS缓冲液NaCl8gKCl0．2gNa2HP041．42gKH2P040．27g溶于1L去离子水中，调节pH至7．4。高温高压灭菌，室温保存。'