GBT27634-2011传染性囊病病毒核酸检测方法.pdf 12页

'ICS11．220B41a雪中华人民共和国国家标准GB／T27634—201传染性囊病病毒核酸检测方法Protocolofnucleicaciddetectionforinfectiousbursaldisease(gumborodisease)virus2011-12-30发布2012-04-01实施宰瞀徽紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚茜GB／T27634--2011本标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、北京盈九思科技有限公司。本标准主要起草人：秦智锋、孙洁、卢体康、花群义、陈书琨、吕建强、杨素、方兴旺、曾少灵、詹爱军、毕英佐、陈兵、阮周曦、朱玉兰。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围传染性囊病病毒核酸检测方法GB／T27634--201本标准规定了传染性囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT—PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于传染性囊病病毒感染的快速诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。IBD：in[ectiousbursaldisease，传染性囊病。IBDV：infectiousbursaldiseasevirus，传染性囊病病毒。SPF：specificpathogenfree，无特定病原体。4材料与试剂4．1仪器与耗材4．1．1核酸电泳仪。4．1．2凝胶成像仪。4．1．3冷冻离心机(最高离心力达150009以上)。4．1．4混匀器。4．1．5冰箱(z℃～8℃，一20℃，--80℃)。4．1．6微量可调移液器(i0pL，100pL，1000pL)。4．1．7微量带滤芯吸嘴(10pL，100pL，1000pL)。4．1．8灭菌研钵。4．1．9离心管。4．1．10PCR光学反应管。4．1．11PCR仪。4．1．12实时荧光PCR仪。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27634--20114．2试剂4．2．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。4．2．2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100pmol／L储存液，置--20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10t-mol／L工作液，避免多次冻融。4．2．3灭菌双蒸水。4．2．4三氯甲烷。4．2．5异丙醇。4．2．6无水乙醇。4．2．775％乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，--20℃预冷。4．2．8DL2000DNAMarker。4．2．9一步法RT-PCR检测试剂盒。4．2．10一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。5生物安全要求5．1采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。5．2IBDV核酸检测方法的实验室规范(参见附录A)。6样品的采集6．1按照GB／T18088的要求进行样品的采集。6．2样品包括各种病料、用于IBDV监测和检测的禽组织、IBDV的细胞培养液、IBDV接种鸡胚的尿囊液等。7核酸抽提7．1酚三氯甲烷抽提法7．1．1取灭菌的1．5mL离心管，做好标识。7．1．2每管加入600pL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照(SPF鸡的法氏囊组织PBS研磨上清液)、阳性对照(标准的IBDV毒株)各200pL，再加入200pL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s，于4℃120009离心15rain。7．1．3取无RNA酶的1．5mL离心管，加入--20℃预冷400pL异丙醇，吸取本标准7．1．2各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。7．1．4于4℃120009离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600pL75％预冷乙醇，洗涤。7．1．5于4℃120009离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。7．1．6100009离心10s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min～10min。7．1．7加入15pL无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，50009离心5s，冰上保存备用。若需长期保存应放置一70℃冰箱。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27634—20117．2其他核酸抽提法核酸提取可以采用等效RNA提取试剂及方法，如采用自动化核酸抽提工作站来抽提核酸。8RT-PCR检测8．1引物8．1．1针对A片段VP2基因的引物上游U3：5’-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT_A了Y>TGA—GGC-TTG-GT(}AC-3’下游L3：5’-CAG-GAA-ACA-GCr-ATG-ACC-GAA—TTC_GAT_ccT-GTT-GcDAc■cTT-Tc一3’8．1．2针对B片段VPl基因的引物上游+290：5"-TGT-AAA-A(]G-ACG-GCC-AGr-GAA—TTC-AGA-TTC-TGC-AGC-CAC-GGT-CTC-T-3’下游--861：5"-CAG-GAA-ACA-C,CT-ATG—AOc-口BCADTTG-ATG_ACpTGA-GGT-粥小nTTG-3’8．1．3引物组成的说明8．1．3．1通用引物M13或R13(黑体部分)序列。M13或R13序列为多数测序反应中的测序引物，便于对PCR扩增产物测序。8．1．3．2限制性内切酶位点(下划线部分)。限制性内切酶位点的引入，使得IBDV经RT-PCR扩增后的产物可用限制性内切酶SphI(gI物U3)、EcoRI(引物L3和+290)、PstI(引物一861)进行酶切后加入质粒中。引物U3和L3分别对应AceNoX84034毒株序列片段A的657～676和1193—1212位置，引物+226和--793分别对应AccNoAF240687毒株序列片段B中的290--311和861--883位置。8．1．3．3IBDV特异性序列(斜体部分)。A片段扩增产物为604bp，B片段扩增产物为642bp，引物扩增片段适合进行IBDV分子分析和分子流行病学研究。8．2反应液的配制按照商业化的一步法RT-PCR试剂盒推荐说明书，进行IBDVRT-PCR反应液的配制(参见附录B)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。8．3加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5pL，混匀后瞬时离心，将PCR管放人PCR检测仪内，记录样本放置顺序。8．4PCR扩增检测8．4．1在扩增检测区进行。8．4．2PCR反应条件为：第一步：反转录50℃45min；第二步：94℃5min(女n果为热启动一步法RT—PCR试剂盒，则需要95℃15min)；第三步：94℃30s，54℃45s，72℃1rain30S，5个循环；第四步：94℃30s，64℃45S，72℃1rain30s，30个循环；第五步：72℃延伸10rain。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27634—20118．5上样和电泳配制凝胶(见附录c)。将样品的扩增产物按编号加入对应的1％琼脂糖凝胶的各孔中，其中一个上样孔中加入标准阳性对照扩增产物，一个上样孔中加入标准阴性对照扩增产物。在凝胶的边孔中加入标准分子质量的DNAMarker。将凝胶在80V恒定电压下电泳60rnin。将凝胶置紫外灯或凝胶成像仪中进行检查。8．6结果判定8．6．1阳性出现一条分子质量为604bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段A核酸阳性。出现一条分子质量为642bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段B核酸阳性。片段A和片段B同时出现核酸阳性，可以判定IBDV阳性。8．6．2阴性片段A和片段B同时出现核酸阴性，IBDV判为阴性。8．6．3可疑在片段A和片段B的核酸检测中，只出现其中一个片段为阳性，另一个片段为阴性，则判定为IBDV可疑。结果可疑应进行实时荧光RT—PCR检测；或重复进行RT-PCR检测，出现A和B两个片段中任何一个片段判定为阳性，否则判定为阴性。9实时荧光RT-PCR检测9．1引物和探针9．1．1针对A片段VP2基因的引物上游引物：5’TTCATAcGGAGCcTTCTGAT3’；下游引物：5’AcAATTAGCCCTGAcCCT3’。9．1．2TaqMan探针：5’FAM-CAACCGGACCGGCGTCCATTC-BHQ3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ。9．2扩增检测9．2．1扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。按照商业化的一步法实时荧光RT-PcR(realtimeRT-PCR)试剂盒推荐说明书，进行IBDVrealtimeRT—PCR反应液的配制(参见附录D)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。9．2．2加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5pL，混匀后瞬时离心，将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。9．2．3PCR扩增检测(扩增检测区)9．2．3．1反应条件设定第一步：反转录45℃30min；4 GB／T27634—20”第二步：热启动95℃15min(不同的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行)第三步：95℃15S，60℃45s，40个循环，60℃时设置采集荧光。9．2．3．2荧光素设定报告荧光(reportdye)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定)，淬灭荧光(quenchdye)设定为None，校准荧光(referencedye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。9．3分析条件设定和结果判定9．3．1闭值设定综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行分析。9．3．2质控阴性对照应无ct值，阳性对照的ct值应≤30，且呈现s型典型扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效。9．3．3荧光PCR结果分析及判定9．3．3．1阳性反应结果判定在试验成立的条件下，检测结果呈现ct值≤35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应，表明IBDV核酸阳性。9．3．3．2阴性反应结果判定检测结果呈现无ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应，表明IBDV核酸阴性。9．3．3．3可疑反应结果判定检测结果35