DB34T1997-2013食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法.pdf 12页

'ICS67.200.10X14DB34安徽省地方标准DB34/T1997—2013食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法Determinationofoxidizedtriacylglycerol(OX-TG)andoxidizedtriacyldycerolpolymer(TGP)inedibleoilsbyahigh-performancesize-exclusionchromatography2013-12-05发布2014-01-05实施安徽省质量技术监督局发布 DB34/T1997—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽国家农业标准化与监测中心、国家农副加工食品质量监督检验中心、上海市粮食科学研究所。本标准主要起草人：徐彦辉、何俊、房志杰、曹文明、顾亮、聂磊、薛斌、姚彦如。I 龙牛网www.longniu.com下载 DB34/T1997—2013食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法1范围本标准规定了食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法。本标准适用于食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定。本标准的方法检出限为0.2％。本标准适用于风险监控及科学研究。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，neqISO3696：1997）GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义(GB/T6379.1-2004，ISO5725-1：1994，IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)3原理通过自动制备型快速柱层析技术的分离，油脂试样被分为非极性组分和极性组分两部分，其中极性组分用高效空间排阻色谱进行分析，采用面积归一化法进行定量。4试剂4.1除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。4.2乙醚，使用前使其回温至10℃～18℃之间。4.3石油醚，30℃～60℃沸程，使用前使其回温至10℃～18℃之间。4.4三氯甲烷。4.5冰醋酸。4.695％乙醇。4.7磷钼酸。4.8无水硫酸钠。4.9硅胶吸附剂：硅胶60，平均粒径为0.063mm～0.200mm（相当于ASTM规范的70目～230目的2粒径分布）的无定形硅胶，孔径60Å，水分含量7±0.5％，孔体积0.8mL/g，表面积500m/g，pH值7.0,拆封后于玻璃干燥器（5.5）内保存。1 DB34/T1997—20134.10非极性洗脱剂：石油醚（30℃～60℃沸程）+乙醚=87+13，870mL的石油醚（30℃～60℃沸程）（4.2）中加入130mL的乙醚（4.1），充分混匀，现用现配。4.11极性组分洗脱液：丙酮+乙醚=40+60，600mL的乙醚（4.1）中加入400mL的丙酮（4.15），充分混匀，现用现配。4.12薄层色谱展开剂：石油醚（30℃～60℃沸程）+乙醚+冰醋酸=70+30+2，70mL的石油醚（30℃～60℃沸程）（4.2）中加入30mL的乙醚（4.1）和2mL的冰醋酸（4.4），充分混匀，现用现配。4.13薄层色谱显色剂：100克的磷钼酸（4.6）固体先完全溶解于适量的95％乙醇（4.5）中，然后再用95％乙醇稀释至1L，最后分装入喷雾瓶中。4.14薄层色谱层析板：长200mm、宽100mm的玻璃板，上涂一层0.25mm厚的硅胶60（平均粒径为10～12µm，其它性质参数同“4.8”）或其它等效硅胶，且不含任何的荧光指示剂。4.15薄层色谱点样毛细管：长100mm，内径0.3mm。4.16丙酮,使用前使其回温度至10℃～18℃之间。。4.17食用油极性组分FLASH色谱柱（EOPCFLASH）：内填装20g粒径为40μm～60μm的硅胶，柱外壳为聚丙烯制成，铝箔密封包装。4.1810mL一次性使用无菌注射器。5仪器与设备5.1旋转蒸发仪。5.2分析天平：感量为0.1mg。5.3真空恒温干燥箱。5.4恒温干燥箱。5.5玻璃干燥器（内装有变色硅胶干燥剂）。5.6薄层色谱玻璃层析缸，能与薄层色谱板（4.13）配套。5.7食用油极性组分快速制备型柱层析系统（EOPCPFCSYSTEM）：配置二元泵、紫外检测器、自动收集系统、实时监测系统和溶剂温度控制系统。5.8标准磨口500mL圆底烧瓶。5.910mL玻璃烧杯。5.101000mL小口玻璃收集瓶。6分析步骤6.1试样的制备6.1.1除杂质作为试样的样品应为液态、澄清、无沉淀并充分混匀。如果样品不澄清、有沉淀，则须将油脂置于50℃的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂的温度加热至50℃并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若此时油脂样品变为澄清、无沉淀，则可作为试样，否则应将油脂置于50℃的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。对于凝固点高于50℃或含有凝固点高于50℃油脂成分的样品，则须将油脂置于比其凝固点高10℃左右的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂加热并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若还需过滤，则将油脂置于比其凝固点高10℃左右的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。2龙牛网www.longniu.com下载 DB34/T1997—20136.1.2干燥脱水若油脂中含有水分，则通过“5.1.1”的处理后仍旧无法达到澄清，须进行干燥脱水。对于室温下为液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后为液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，可按每10g油脂加入1～2g无水硫酸钠（4.7）的比例加入无水硫酸钠，并充分搅拌混合吸附脱水，然后用滤纸过滤，取过滤后的澄清液体油脂作为试样。对于室温下有结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后有明显结晶或凝固现象的油脂，可将油脂样品用适量的石油醚（4.2）完全溶解后再用无水硫酸钠吸附脱水，然后滤纸过滤收集滤液，将滤液置于水浴温度为45℃的旋转蒸发仪（5.1）内，负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸干，取残留的澄清液体油脂作为试样。6.2FLASH色谱柱的活化以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相对EOPCPFCSYSTEM层析系统（5.7）的流动相管路进行润洗，排尽流动相管路内的气体。取1支EOPCFLASH色谱柱（4.16），连接入EOPC快速制备型柱层析系统的流动相管路，以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相，25mL/min的流速冲洗FLASH色谱柱10min，使FLASH色谱柱完全被溶剂所浸润。6.3非极性组分的分离取1只干净的10mL玻璃烧杯（5.9），准确称取1g（精确到0.001g）的油脂样品（m），然后用5mL的石油醚（30℃～60℃沸程）（4.2）将油脂样品充分溶解，成为上样液。将FLASH色谱柱的上端与流动相管路断开，用1支干净的10mL一次性塑料注射器（4.17）吸取全部的上样液后，快速注射入FLASH色谱柱的上端入口处，再用3mL的石油醚（30℃～60℃沸程）洗涤10mL玻璃烧杯内残留的上样液，洗涤液也用同一支10mL一次性塑料注射器全部吸取后，注射入FLASH色谱柱的上端入口处，再将FLASH色谱柱的上端与流动相管路连接，按以下参数进行非极性组分的分离：a)流动相：非极性组分洗脱液（4.9）；b)流动相流速：25mL/min；c)部分收集器：以1000mL小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进行收集；d)紫外检测器监测波长：200nm；e)启用实时监测系统，获得洗脱色谱图；f)溶剂温度控制系统温度：10℃；g)洗脱时间：11min。注：进行分离操作时，实验的环境温度应控制在10℃～25℃间。6.4极性组分的洗脱取1个干净的500mL圆底烧瓶（5.8）放入（103±2）℃的恒温干燥箱（5.4）内，烘1h左右，然后取出立即放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，然后称重（M1）。在完成“6.3”的操作后，立即对吸附有极性组分的FLASH色谱柱进行进一步的洗脱处理，具体参数如下：a)流动相：极性组分洗脱液（4.10）；b)流动相流速：25mL/min；c)部分收集器：以另一个干净的1000mL小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进行收集；d)紫外检测器监测波长：200nm；3 DB34/T1997—2013e)启用实时监测系统，获得洗脱色谱图；f)溶剂温度控制系统温度：10℃；g)洗脱时间：20min。将1000mL小口玻璃收集瓶内所有收集的洗脱液倒入500mL圆底烧瓶中，然后将此装有收集洗脱液的500mL圆底烧瓶置于水浴温度为60℃的旋转蒸发仪（5.1）内，先在非真空条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至一半，再在负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至近干。然后将此500mL圆底烧瓶放入40℃的真空恒温干燥箱（5.3），在0.1MPa的负压条件下，烘20min～30min后放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，其中的残留物即为极性组分。然后称重（M2）,（M2-M1）即为极性组分的质量。用100mL的四氢呋喃溶解极性组分，待上机分离检测。获得的非极性组分和极性组分的分离效果须按照附录C进行验证。注1：若洗脱液的量太大，可分多次收集并浓缩，即先收集部分洗脱液于500mL的圆底烧瓶中，旋转蒸干这部分溶剂后，再用同一个500mL的圆底烧瓶继续收集剩余的洗脱液，并旋转蒸干。注2：一般情况下，油脂的极性组分中含有甘油三酯氧化裂解产生的小分子挥发性物质，很难避免这类物质在真空干燥过程中的损失，致使本标准测得的极性组分含量会比真实的极性组分含量略低。6.5平行试验按试样处理步骤，对同一样品进行平行试验测定。6.6测定6.6.1空间排阻色谱分析条件a)色谱柱：Styragel凝胶色谱保护柱+StyragelHR1TH(φ7.8mm×300mm)+StyragelHR0.5TH(φ7.8mm×300mm)或柱效相当的串联空间排阻色谱柱；b)柱温：35℃；c)进样量：10μL；d)流速：0.7mL/min；e)流动相：四氢呋喃；f)检测器：示差折光检测器（检测池温度35℃）。6.6.2定性测定依据聚苯乙烯标准相对分子质量进行定性，油样极性组分典型的色谱分离图见附录B。各组分依分子量大小顺序出峰，对应的色谱峰依次为氧化甘油三酯寡聚物(TGO)、氧化甘油三酯二聚物(TGD)、氧化甘油三酯单体(OX-TG)、甘油二酯(DG)、游离脂肪酸(FFA)等。6.6.3定量测定假设所有洗脱出的样品组分具有相同的响应系数，采用峰面积归一化法进行定量测定。6.7结果计算氧化甘油三酯按式（1）计算：SOXTGMpX1100%.................(1)(STGOSTGDSOXTGSDGSOTH)M4龙牛网www.longniu.com下载 DB34/T1997—2013氧化甘油三酯聚合物含量按式（2）计算：(STGOSTGD)MpX2100%.................(2)(STGOSTGDSOXTGSDGSOTH)M式中：X1——油样中氧化甘油三酯的含量，％；X2——油样中氧化甘油三酯聚合物的含量，％；STGO——氧化甘油三酯寡聚物(TGO)的峰面积；STGD——氧化甘油三酯二聚物(TGD)的峰面积；SOX-TG——氧化甘油三酯单体(OX-TG)的峰面积；SDG——甘油二酯单体(DG)的峰面积；SOTH——其它洗脱组分的峰面积（包括游离脂肪酸和甾醇等）；MP――油样中极性物质量,g；M――油样质量,g。注：结果保留至小数点后两位。7检测方法灵敏度和精密度7.1灵敏度氧化甘油三酯及其聚合物含量在油脂中的检测限为0.2％。7.2精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值应不超过算术平均值的15％。5 DB34/T1997—2013AA附录A（资料性附录）极性组分和非极性组分自动快速制备型柱层析分离的典型色谱图图A.1非极性组分和极性组分自动快速制备型柱层析分离的典型色谱图6龙牛网www.longniu.com下载 DB34/T1997—2013BB附录B（资料性附录）极性物在空间排阻色谱上的典型空间排阻分离色谱图图B.1极性物含量较高的典型空间排阻色谱图图B.2极性物含量较低的典型色谱图7 DB34/T1997—2013CC附录C（资料性附录）非极性组分和极性组分洗脱分离效果的薄层色谱验证用三氯甲烷（4.3）分别将分离制备的极性组分和非极性组分配制成质量体积浓度为10％左右的溶液。用2根点样毛细管（4.14）分别吸取各2μL左右的极性组分溶液和非极性组溶液，在距离薄层色谱层析板（4.13）下沿3cm左右处，分别点样并挥干溶剂。薄层色谱玻璃层析缸（5.6）内加入适量的薄层色谱展开剂（4.11），放入点有样的薄层色谱层析板（注：展开剂的液面不得高于点样点的高度）进行展开。约35min后，当展开剂的液面展开至薄层色谱层析板上端17cm左右的距离时，取出薄层色谱层析板，并在室温下挥干溶剂。以喷雾的方式，将薄层色谱显色剂（4.12）均匀地喷涂在薄层色谱层析板的硅胶涂层的表面，并在室温下挥干溶剂。然后将此薄层色谱层析板放入120℃～130℃的恒温干燥箱（5.4）内加热至斑点显色。根据薄层色谱层析板上极性组分与非极性组分的分离程度来验证分离效果，如图C.1。图中：1——非极性组分2——极性组分图C.1极性组分和非极性组分的薄层色谱图_________________________________8龙牛网www.longniu.com下载'