GBT27621-2011马鼻肺炎病毒PCR检测方法.pdf 12页

'ICS11．220B41营亘中华人民共和国国家标准GB／T27621—2011马鼻肺炎病毒PCR检测方法ProtocolofPCRforequinerhinopneumonitisvirus2011-12-30发布2012-04-01实施宰瞀鹳鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：新疆农业大学。本标准主要起草人：冉多良、单文鲁、马伟、王传锋、张伟。GB／T27621--2011 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围马鼻肺炎病毒PCR检测方法GB／T27621m2011本标准规定了马鼻肺炎病毒的PCR检测方法。本标准适用于马匹的流通和进出境检疫实施马鼻肺炎的现场检疫和后续监管工作。一步法PCR检测技术适用于实验室细胞毒样品检测；巢式PCR检测技术适用于临床疑似样品及细胞毒样品检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。EHV：equinerhinopneumon{t[s，马传染性鼻肺炎。RNA：ribonucleicacid，核糖核酸。CPE：cytopathiceffect，细胞病变。EB：ethidiumbromide，溴化乙锭。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠。BHK-21：babyhamsterkidneycell，仓鼠幼肾细胞。PBS：phosphatebuffersodium，磷酸盐缓冲液。4试剂和材料(试剂不经注明，均为分析纯)4．1水：符合GB／T6682中一级水的规格。4．2RNA酶A。4．3酚一三氯甲烷，4．42％琼脂糖凝胶：见A．1。4．5溴化乙锭(10b‘g／／zL)：见A．2。4．6DNA聚合酶(5U／pL)。4．750×TAE电泳缓冲液(pH8．5)：见A．3。4．810×PCRBuffer(plusM92+)。4．92．5mmol／mLdNTP。4．10蛋白酶K(20mg／mL)。4．11BHK_21细胞。4．12含2％犊牛血清的MEM维持液。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27621—20114．13O．3mol／L乙酸钠。4．140．01mol／LPBS缓冲液(pH7．2)：见A．4。4．15SDS。4．1610×TE缓冲液(pH8．0)：见A．5。4．17无水乙醇。4．1870％乙醇。4．19Tris饱和酚(pH8．0)。4．20分子质量标准DL2000。5器材和设备5．1低温冷冻高速离心机。5．2倒置显微镜。5．3CO。恒温培养箱。5．4普通冰箱和超低温冰箱。5．5组织研磨器。5．61．5mL离心管。5．7PCR扩增仪。5．8水平电泳槽。5．9微量移液器及吸头。5．10紫外照射仪或凝胶成像仪。6EHV的分离6．1采样取马流产胎儿病料的肺、脾或淋巴组织，疑似病驹呼吸系统的鼻咽拭子3根。6．2样品处理组织样品2g与2mL0．01mol／LPBS缓冲液置于组织研磨器中研磨匀浆，反复冻融3次；鼻咽拭子3根在2mL0．01mol／LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。6．3病毒增殖将毒种接种到单层的BHK一21细胞上，37℃吸附1h，加适量含2％的犊牛血清的MEM维持液，CO。恒温培养箱37℃静置培养，利用倒置显微镜逐日观察CPE，48h后当CPE达85％以上时收毒，冻存于一70℃冰箱备用。7El-IV的PER检测7．1样品处理组织样品2g与2mL0．01mol／LPBS缓冲液研磨匀浆，反复冻融3次；鼻咽拭子3根在2mL0．01mol／LPBS缓冲液中洗脱，反复冻融3次，离心取上清。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7．2核酸抽提GB／T27621—2011取适当病料或细胞毒0．5mL，加入RNA酶A至终浓度为100tLg／mL，37℃作用30rain；加入20mg／mL蛋白酶K至终浓度为100tlg／mL，SDS终浓度为0．5％。在56℃水浴内反应60rain至反应物清亮，期间不断轻摇溶液。加等体积TE饱和酚，轻摇20min，12000r／rain离心7min；取水相加等体积酚一三氯甲烷(1：1)，轻摇20min，12000r／rain离心7min；取水相加等体积三氯甲烷，轻摇15min，12000r／rain离心7min；收集水相。在上述水相中加入2．5倍体积预冷的无水乙醇和终浓度为0．3mol／L乙酸钠，一20℃放置20rain。12000r／rain离心10rain，使核酸沉淀，弃去上清液。立刻加入70％乙醇，将沉淀漂洗2次，以去除残留的盐类。倾去乙醇，倒置在滤纸上干燥，然后加0．5mLTE(pH8．o)，于4℃冰箱内过夜溶解DNA。37℃干燥20rain或抽真空干燥；最后加10pL水溶解后，作为PCR模板。7．3以引物F、引物F1c和引物F4c(参见B．1)为条件的体系含1．5mmol／LMgCl2的10×PCRBuffer5pL；2．5mmol／L的dNTP4pL；引物F、引物F1c和引物F4c(参见B．1)各1pL；模板DNA1pL；DNA聚合酶o．5pL；加双蒸水至50pL，然后将上述成分混合均匀。在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应条件为94℃预变性4min，30次如下循环：94℃1rain，56℃1rain，72℃1rain，最后72℃延伸7min。取10pLPCR扩增产物，加2pL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳30rain，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较：EHV一1会出现311bp的DNA片段，EHV-4会出现468bp的DNA片段。空白对照在311bp和468bp没有核酸带(参见附录C)。7．4巢式PCR扩增方法7．4．1以引物Fz和引物Fc[-参见B．Za)3为条件的体系如下：——含1．5mmol／LMgC12的10×PCRBuffer5弘L；2．5mmol／L的dNTP4弘L；引物Fz和引物Fc[参见B．2a)]各1pL；模板DNA1pL；2．5UDNA聚合酶0．5pL；加双蒸水至50pL，混合均匀，瞬时离心后，放入PCR仪中。PCR反应程序为94℃预变性4min，25次循环(94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸7rain)，取出PCR反应产物；——取10pLPCR扩增产物，加2pL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1和EHV-4会出现747bp的DNA片段，空白对照在747bp没有DNA片段，参见图D．1)。7．4．2巢式PCR第二次反应：待扩增病毒DNA为100倍稀释的一次扩增PCR产物作为二次扩增模板。以引物F1和引物F1c[参见B．2b)]为条件的体系如下：——含1．5mmol／LMgCl2的10×PCRBuffer5pL；2．5mmoI／L的dNTP4pL；引物F1和引物Flee参见B．2b)]各1pL；模板DNA1pL；2．5UDNA聚合酶0．5pL；加双蒸水至50pL。然后，将以上各成分混合均匀放人PCR仪中。PCR反应条件为94℃预变性4min，25次循环(94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸1min，最后72℃延伸7rain)；——取10pLPCR扩增产物，加2pL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1出现404bp的DNA片段，空白对照在404bp没有DNA片段，参见图D．2)。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27621—20117．4．3以引物F4和引物F4e[参见B．2c)]为条件的体系如下：——含1．5mmol／LMgCl2的10×PERBuffer5laL；2．5mmol／L的dNTP4pL；引物F4和引物F4c[参见B．2c)]各1pL；模板DNA1pL；2．5UDNA聚合酶0．5pL；加双蒸水至50pL，然后将以上各成分混合均匀放人PCR仪中。PCR反应程序为94℃预变性4min，25次循环(94℃变性1min，56℃退火lmin，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min)；——取10PLPCR扩增产物，加2pL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳30min，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较(标准EHV-1出现334bp的DNA片段，空白对照在334bp没有DNA片段，参见图D．3)。7．4．4以引物F和引物Flc、F4c[参见B．2d)]为条件的体系如下：——含1．5mmol／LMgCl2的10×PCRBuffer5pL；2．5mmol／L的dNTP4／IL；引物F、引物F1c和引物F4c[参见B．2d)]各1pL；模板DNA1pL；2．5UDNA聚合酶0．5pL；加双蒸水至50pL，然后将以上各成分混合均匀放人PCR仪中。反应程序为94℃预变性4min，25次循环(94℃变性1rain，50℃退火1rain，72℃延伸1rain，最后72℃延伸7rain)；——取10pLPCR扩增产物，加2pL6×加样缓冲液，在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳30rain，在紫外照射仪或凝胶成像仪上观察产物荧光带位置，以DNA2000Marker作分子质量标准比较(在311bp位置上有核酸带，判定为EHV-1型阳性样品；在468bp位置上有核酸带，判定为EHV-4型阳性样品；在311bp和468bp位置上都有核酸带，可判为EHV-1和EHV-4型混合感染，参见图D．4)。7．5设立对照7．5．1在7．1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。7．5．2取含有已知EHV的病毒标准株的组织悬液作为阳性对照。7．5．3采用未接种病毒的正常BHK-21细胞抽提核酸作为阴性对照。7．5．4取等体积的水代替模板作为空白对照。7．6琼脂糖电泳用TAE电泳缓冲液配制2％的琼脂糖(含1pg／mLEB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6pLPCR扩增产物和2pL溴酚蓝指示剂溶液混匀后加入孔内。在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照。5V／cm电泳约0．5h，当溴酚兰到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7．7结果判定7．7．1一步法PCR扩增结果判定如下(以DNA2000Marker作分子质量标准比较)：a)EHv-1会出现311bp的DNA片段，EHV-4会出现468bp的DNA片段。空白对照在311bp和468bp没有核酸带。对照成立才能进行判定。b)在311bp位置上有核酸带，判定为EHV-1型阳性样品；若在311bp位置上无核酸带，判定为EHV-1型阴性样品。在468bp位置上有核酸带，判定为EHV一4型阳性样品；若在468bp位置上无核酸带，判定为EHv-4型阴性样品。7．7．2巢式PCR结果判定如下(以DNA2000Marker作分子质量标准比较)：a)一次PCR扩增结果：标准EHv_1／4会出现747bp的DNA片段。空白对照在747bp没有DNA片段。二次PCR扩增结果：标准EHV-1出现311bp或404bp的DNA片段。空白对照在311bp或404bp没有DNA片段。标准EHV-4出现334bp或468bp的DNA片段。空白对照在334bp或468bp没有DNA片段。两次结果对照成立才能进行判定。4 GB／T27621—2011b)若一次扩增后在747bp位置上有核酸带，判定为阳性样品；无核酸带或条带的大小不在747bp位置上，判为阴性样品。若二次扩增后在311bp或404bp位置上有核酸带，判为EHV-I型阳性样品；无核酸带或条带的大小不在311bp或404hp位置上，判定为非EHV-I型阳性样品。若二次扩增后在334bp或468bp位置上有核酸带，判为EHV一4型阳性样品；无核酸带或条带大小不在334bp或468bp位置上，判为非EHV-4型阳性样品。若二次扩增后在311bp和468bp位置上有两条核酸带，可判为EHV-I／4型混合感染。 GB／T27621—2011A．12％琼脂糖凝胶附录A(规范性附录)试剂的配制琼脂糖2g1×TAE电泳缓冲液100mL微波炉中完全融化，待冷至50℃时，加溴化乙锭(EB)溶液5pL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A．2溴化乙锭(EB)溶液(10mg／mL)溴化乙锭灭菌双蒸水A．350xTAE电泳缓冲液(pn8．5)1g100mL羟基甲基氨基甲烷(Tris)242gEDTA·2H2037．2g冰乙酸57．1mL灭菌双蒸水加至1000mL，用时用灭菌双蒸水稀释使用。A．40．01m01]LPBS缓冲液(pH7．2)Na2HP04KH2P04NaClKCl灭菌双蒸水加至1A．510×TE缓冲液61．42g0．27g8g0．29000mL，高压灭菌。1tool／Ltris—HCIBuffer100mL0．5mol／LEDTA(pH8．O)20mL灭菌双蒸水加至1000mL，高压灭菌。 B．1一步法PCR引物附录B(资料性附录)引物序列及其特性GB／T27621—2011引物合成参照GeneBank中的EHV-I和EHV-4的部分gB基因序列，用Primerpremier5．0软件设计特异性引物，其浓度为10pmol／mL，序列如下：F：5’GATGCcATGGAGGCACTAcAC3’EHV-1和EHV一4共有Flc：5’CTCGACTTTCTTCTCTCGGTCC3’EHV-1特有F4c：5’TTGAcAcACAGTcGGTGAGT3’EHV-4特有B．2巢氏PCR引物引物合成参照GeneBank中的EH、，_1和EHV-4的部分gB基因序列，用Primerpremier5．0软件设计特异性引物，其浓度为10pmol／mL，序列如下：a)巢式PCR第一次反应的引物Fz：5’GGAAAGGATACAGCCATACGTC3’EHv_1和EHV一4共有Fc：5’GTATATCGAGTCTATGGCTTC3’EHV一1和EHV一4共有h)巢式PCR第二次反应扩增EHV一1的引物Fl：5’GAGGTGGAGCTTGATTTGTG3’EHV一1特有Flc：5’CTCGACTTTCTTCTCTCGGTCC3’EHv-1特有c)巢式PCR第二次反应扩增EHV一4的引物F4：5’TCGGTCAGcTGCTcAGTTAG3’EHv一4特有F4e：5’TTGACACACAGTCGGTGAGT3’EHV-4特有d)巢式PCR第二次反应同时扩增EHV-I和EHV-4的引物F：5’GATGCCATGGAGGcAcTACAc3’EHV一1和EHV一4共有Fle：5’CTCGACTTTCTTCTCTCGGTCC3’EHv-1特有F4c：5’TTGACACACAGTCGGTGAGT37EHv_4特有7 附录c(资料性附录)一步法PCR反应结果FM—DNAMarker(DL2000)l1——标$EHV1a标＆EHv_4混合DNA，2——田性NM；3--标准EHV-4DNA；4——标准EHVIDNA。囤C1以F／F1pF4c为引物的一步法PCR反应结果 国n附录D(资料性附录)翼式法PeR反应结果m”且以Fz／Fc为引物的第一次PCR反应结果32M。●M——DNAMarker(DL2000)；1——标$EFIV-1DNA；2——标EEHV-4DNA；3——目性肘月。图D2以F1／Vlc为引物的套式PCR反应结果 目D3M——DNAMarker(DL200051——目性对Ⅲ；2——#№EHv_1自标＆EHv_4*☆DNA；3——#％EHv_4DNA，4——#EEHV-1DNA。固D4以F／F1PF4c为引物的套式PCR反应结果_||i■'