尼古丁对MPTP致帕金森病小鼠嗅觉障碍的作用研究.pdf 12页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn尼古丁对MPTP致帕金森病小鼠嗅觉障碍的作用研究#杨靓1，刘春风1,2**5（1.苏州大学神经科学研究所，江苏省苏州市215123；2.苏州大学附属第二医院神经内科，江苏省苏州市215004）摘要：嗅觉障碍是帕金森病(Parkinson′sdisease，PD)患者中最常见的早期症状之一。之前的流行病学研究报道不吸烟的PD患者的宾夕法尼亚大学气味鉴别试验的评分要低于吸烟的PD患者，而且PD的发生与吸烟之间存在负相关。但香烟是如何影响PD患者嗅觉障碍的10具体机制仍不清楚。因此研究者使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的PD模型小鼠来观察尼古丁对嗅觉功能的影响。研究者发现与生理盐水组的小鼠相比，MPTP小鼠的嗅觉察觉与分辨能力都出现下降，而尼古丁可以缓解这一现象。但是MPTP对小鼠的嗅觉记忆没有明显的改变。研究者进一步发现在MPTP小鼠的嗅球中乙酰胆碱转移酶的表达水平是明显下降的，而尼15古丁的注射则可以减缓其下降。另外，尼古丁还改善了斜角带水平肢（thehorizontallimbofthediagonalband，HDB)）中乙酰胆碱能神经元和多巴胺能神经纤维的丢失，嗅球中的乙酰胆碱神经纤维来源于HDB中乙酰胆碱能神经元的投射。研究者的结果显示尼古丁是通过保护MPTP小鼠嗅球中的胆碱能系统从而改善其嗅觉障碍的。关键词：神经生物学；帕金森病；嗅觉障碍；尼古丁；胆碱能系统20中图分类号：Q189NicotineImprovedtheOlfactoryFunctioninMPTP-InducedMouseModelofParkinson"sDiseaseYangJing1,LiuChunfeng1,225(1.InstituteofNeuroscience,SoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince215123;2.Departmentofinternalneurology,TheSecondHospitalAffiliatedtoSuzhouUniversity,Suzhou,JiangsuProvince215004)Abstract:OlfactoryimpairmentisafrequentandearlyfeatureofpatientswithParkinson’sdisease(PD).RetrospectiveepidemiologicalstudiesreportedlowerscoresontheUniversityofPennsylvaniaSmell30IdentificationTestinnon-smokersthansmokerswithPD,andshowedaninversecorrelationbetweensusceptibilitytoPDandaperson"shistoryofsmoking.ButthemechanismsbywhichcigarettesaffectolfactioninPDarenotfullyunderstood.Inthisstudyweassessedtheeffectofnicotineontheolfactoryfunctionin1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine(MPTP)-treatedmice.Weobservedthatcomparedtocontrols,nicotineimprovedtheolfactoryfunctioninMPTP-inducedmousemodelofPD35showedadeficitofodordiscriminationandodordetection,whichwerealleviatedbynicotinetreatment.ButnosignificantchangeswerefoundinolfactorymemoryinMPTP-treatedmice.Moreover,wedetectedamarkeddecreaseofcholineacetyltransferaseexpressionintheolfactorybulb(OB)inMPTP-treatedmice,whichwasalsoattenuatedbynicotineadministration.Inaddition,nicotineamelioratedthelossofcholinergicneuronsanddopaminergicinnervationinthehorizontallimbofthe40diagonalband(HDB),whichistheprimaryoriginofcholinergicinputtotheOB.OurresultsindicatethatnicotinecouldimprovetheolfactoryimpairmentbyprotectingcholinergicsystemsintheOBofMPTP-treatedmice.Keywords:Neurobiology;Parkinson’sdisease;olfactorydysfunction;nicotine;cholinergicsystem基金项目：江苏省临床医学科技专项基金（BL2014042）作者简介：杨靓（1991-），女，硕士研究生，帕金森病通信联系人：刘春风（1965-），男，博导，帕金森病.E-mail:liucf20@hotmail.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn450引言帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是常见的神经退行性疾病之一，其主要特征是静止性震颤、肌强直、姿势步态异常等运动症状。但是随着研究的深入，人们逐渐发现PD患者还会表现出一系列的非运动症状，例如抑郁、焦虑、睡眠障碍、嗅觉减退等[1,2]。在这些非运动症状中，嗅觉减退的发生率最高，可达到70%-90%。50从1968年第一次报道吸烟是PD的保护因素以来，近60年已有多篇文章证实了PD与吸烟之间存在负相关[3,4]。并且自从人们开始关注嗅觉减退，也发现了PD的嗅觉与吸烟之间同样存在负相关，即PD患者中不吸烟者的嗅觉阈值高于PD患者中的吸烟者，但是其具体的机制仍不清楚[5]。嗅球中存在多种神经递质，其中乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）在嗅觉信号的传递过55程中发挥重要的作用[6,7]。嗅球中的ACh能神经纤维主要来自斜角带水平肢（Thehorizontallimbofthediagonalband，HDB）中ACh能神经元的投射[8,9]。已有研究发现在PD患者嗅球中的ACh能神经纤维密度与HDB中的ACh能神经元数量都是下降的，这可能是PD嗅觉减退的原因之一[10]。研究发现尼古丁是香烟的主要成分，对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶60（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的PD小鼠模型的DA能神经元的损伤具有保护作用[11-13]。同时也有文献报道在MPTP诱导的猴子模型中，其HDB中的ACh能神经元和DA能神经纤维都是下降的[14]。因此我们提出一种设想，尼古丁是否可以通过调节嗅球中的ACh系统来改善MPTP小鼠的嗅觉障碍。研究者通过行为学观察了尼古丁对MPTP小鼠运动能力及嗅觉功能的影响，结果显示65尼古丁可以改善MPTP模型小鼠的运动能力，保护其中脑DA能神经元，并且可以提高MPTP小鼠的嗅觉功能。同时也发现了尼古丁对嗅球和HDB中的ACh系统的变化发挥着一定的作用。1材料与方法1.1实验材料701.1.1实验动物健康雄性6-8周龄C57BL/6小鼠，体重大约25g，由苏州大学实验动物中心提供。实验小鼠放在12小时明暗交替的清洁级动物房中饲养，其温度为24°C，相对湿度50%-60%。小鼠可在饲养笼中自由饮水和饮食，在小鼠适应动物房的环境三天后给予药物的处理。根据苏州大学动物伦理委员会的指导进行实验操作，最大限度的减少小鼠的痛苦。751.1.2主要试剂尼古丁，MPTP，BCA蛋白定量试剂盒，蛋白酶抑制剂，DAB试剂盒，溴酚蓝，磷酸盐缓冲液，TH抗体购自Sigma，ChAT抗体购自Abcam。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2实验方法1.2.1动物分组及药物处理80雄性健康C57BL/6小鼠被随机分为四组:MPTP+Nicotine组、Nicotine组、MPTP组、对照组(生理盐水组),每组均为8只,饲养于清洁级动物房三天后开始给药。实验时将MPTP、尼古丁溶于生理盐水,Nicotine组及MPTP+Nicotine组先行腹腔注射尼古丁1.0mg/kg,每天一次，连续注射7天。MPTP组、对照组(生理盐水组)腹腔注射等容量生理盐水。第8天MPTP+Nicotine组及MPTP组腹腔注射MPTP14mg/kg/次，一共注射4次，每次需要2小85时的间隔时间，要在一天时间内注射完毕（急性模型剂量和给药）。Nicotine组、对照组(生理盐水组)腹腔注射等容量生理盐水。之后Nicotine组及MPTP+Nicotine组继续腹腔注射尼古丁1.0mg/kg,每天一次，连续注射14天。MPTP组、对照组(生理盐水组)腹腔注射等容量生理盐水。在尼古丁总共给药21天之后检测小鼠的各项行为学。1.2.2转棒实验（Rotarodtest）90打开转棒装置，将旋转杠的速度调节到20r/min。然后将小鼠放置在旋转杆上，小鼠从旋转杆上掉落的时间即为潜伏期，记录该时间。并且设定最长的潜伏期为300s。在计算时取3次测试的平均数。1.2.3旷场实验（Openfieldtest）打开旷场装置，小鼠的旷场反应箱高35cm,底边长40cm,内壁和底面均为白色，底面平95均分为16个10cm×10cm小方格，正上方1m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场箱内部。将小鼠轻放到旷场箱的正中格，同时进行摄像和记录下时间。观察10min后停止摄像，记录10min内小鼠在旷场箱内运动的平均速度，用于统计分析。1.2.4埋藏饼干实验（Buriedpellettest）准备一个干净的笼盒（45cm×24cm×20cm），然后将干净的垫料均匀的铺在笼盒的100上面，大约3cm厚。再将实验用饼干埋藏在垫料之下，大约0.5cm。将小鼠放在实验笼盒的正中央，按下计时器开始计时。当小鼠找到饼干并且开始吃的时候按下计时器停止计时，这段时间则是小鼠寻找饼干的时间，记录此数据用于统计分析。若小鼠在300s内都没有找到饼干，则停止计时，并记下时间300s。1.2.5木块实验（Blocktest）105准备好实验用木块（2cm×2cm×2cm），分别装在各自的袋子中，然后从每笼小鼠的笼盒中分别取出8g的垫料填满各自的袋子中过夜。在实验区域放上两个木块，一个木块带有接受测试小鼠自身笼盒垫料的气味，另一个则是带有不同气味的木块。将小鼠放在实验笼盒的正中央，按下计时器开始两分钟的录像。观看录像，分别数出小鼠嗅带有自身笼盒垫料气味的木块时间（ownscent），和嗅带有不同气味垫料的木块时间(novelscent)，用novel110scent/ownscent的比值作为数据进行统计分析。1.2.6嗅觉记忆实验（Olfactorymemorytest）准备好实验用品，一个干净的大纸箱（80cm×80cm×60cm）。四个干净的小盒子（5-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cncm×5cm×5cm），在四个小盒子里分别装满带有不同气味的沙子（水，酒精，辣椒，胡椒），然后把四个盒子放在箱子的四个角落。再将巧克力任意埋在一种气味的沙子下。将小115鼠从笼盒中拿出，轻轻地放在实验笼盒的正中央，按下计时器开始计时。当小鼠找到巧克力并且开始吃的时候按下计时器停止计时，这段时间则是小鼠第一次寻找巧克力的时间，记为trial1。若小鼠在300s内都没有找到巧克力，则停止计时，并记下时间300s。第二天，将巧克力埋在相同气味的沙子下，然后按照上述方法测试第二次寻找巧克力的时间，记为trial2。使用trial2/trial1的比值作为数据进行统计分析。1201.2.7WesternBlotting需要提取蛋白的样品称重后转移至1.5mlEP管,每个EP管中按照1mg/10l的比例加入相应体积的裂解液，并且放置于冰上。使用超声波破碎仪裂解组织，制成匀浆，离心15min,13200rpm。取上清BCA蛋白定量，计算蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（90V电泳30min后将电压调至110V），110V转膜（硝酸纤维素膜）120min，10%脱脂奶粉封闭12530min，孵育一抗过夜（4°C），PBST缓冲液洗膜3次×10min,室温孵育二抗1h，PBST缓冲液洗膜3次×10min，滴加ECL后暗示曝光。1.2.8免疫组化动物经生理盐水和4%多聚甲醛灌流固定后,取组织在4%多聚甲醛中固定1天,再移入酒精，由低浓度到高浓度脱水。然后将组织放入二甲苯中脱水，最后用石蜡包埋，切取4m130厚的冠状平面的片子。二甲苯脱蜡两次，每次10min。再用酒精梯度水化，依次为100%，100%，95%，85%，75%。用PBS漂洗3次，每次5min，再将玻片放置在柠檬酸缓冲液中微波抗原修复95-98°C，保持时间为20min。自然冷却切片，用PBS漂洗3次，每次5min。使用3%过氧化氢阻断过氧化物酶的作用，孵育时间15min。之后先用PBS漂洗3次，每次5min。每片切片滴加100-200l一抗于组织上，放在4°C冰箱中过夜。第二天，135取出切片。用PBS漂洗3次，每次5min。每片切片滴加100-200lDAB试剂盒中的A液，在室温下孵育60min。孵育完成后，用PBS漂洗3次，每次5min。每片切片滴加100-200lDAB试剂盒中的显色液，室温显色2-3min。使用苏木精染核数秒至十几秒，流水冲洗30min。酒精梯度脱水，依次为75%，85%，95%，100%，100%。再用二甲苯通透两次，每次10min。最后用中性塑胶封片。1401.2.9细胞计数TH阳性细胞的计数在光镜下分析，采取单侧计数，阳性细胞为细胞浆染成棕褐色。从AP-3.16到AP-3.80mm，每个样本连续切片，每隔5张脑片从中挑取一张，每个样本一共取6张脑片染色并计数单侧TH阳性神经元数量，以平均值为每只小鼠的TH阳性神经元数量，每组3-5只小鼠。1451.2.10统计分析用于数据分析的软件主要有：GrapHPadPrism6统计软件进行统计处理。实验数据以均数±标准误表示。方差分析采用双因素(Two-wayANOVA)进行显著性检验。当P<0.05为有统计学意义。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2结果1502.1尼古丁提高了MPTP小鼠的运动能力并减少了中脑DA能神经元的丢失。2.1.1尼古丁对MPTP小鼠运动能力的影响尼古丁腹腔注射21天后，我们对各组小鼠进行转棒实验和旷场实验的测定。转棒实验可以检测小鼠的运动协调功能，而旷场实验则用来检测小鼠随意自由运动的能力。这两种运动学的测定需要使用特定的仪器来进行，如图1-A用于转棒实验的转棒仪和图1-B用于旷场155实验的旷场实验箱。其中MPTP组的小鼠在转棒试验中的运动协调表现明显弱于腹腔注射生理盐水的对照组小鼠，表现为在转棒上的潜伏时间缩短，类似于PD患者的运动协调障碍，而这种较差的运动协调能力可通过尼古丁的慢性注射得以改善（图1-C）。但是从旷场实验的结果来看，各组小鼠的平均速度并没有显示出差异，也就是说MPTP、尼古丁都没有对小鼠的随意自由运动产生影响（图1-D）。因为我们后续检测小鼠的嗅觉试验中需要小鼠160随意自由地去寻找埋藏的饼干，所以各组小鼠在这个方面没有差异也使得我们在嗅觉检测过程中排除了一个潜在的干扰因素。图1：小鼠运动行为学的检测165A图和图B为小鼠转棒实验和旷场实验的检测装置；C图是小鼠进行转棒试验时在转棒上的潜伏时间的统计图；D图为小鼠在旷场实验中运动的平均速度统计图。各组小鼠n=7。***p<0.001，与生理盐水组比较；##p<0.01，与MPTP+Nicotine组比较。2.1.2尼古丁提高了MPTP小鼠黒质纹状体中TH蛋白水平的表达MPTP可以损伤中脑DA能神经元，使之大量的丢失。为了研究尼古丁对中脑的DA能170神经元是否具有保护作用。我们利用Westernblot的方法分别了检测黒质和纹状体中TH蛋白水平的表达。如图2所示，在MPTP小鼠的黒质和纹状体中TH蛋白的表达水平明显出现-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn下降，与模型组相比，给予尼古丁注射的MPTP小鼠的TH蛋白水平在黒质和纹状体中都表现出显著的增加。这说明尼古丁对MPTP诱导的中脑DA能神经元的损伤具有保护作用。175图2：小鼠纹状体和黒质中TH蛋白水平的表达A图和C图分别是纹状体和黒质中TH蛋白表达的免疫印迹图；B图和D图分别是相对应的TH蛋白表达量的统计图。各组小鼠n=3。***p<0.001，与生理盐水组比较；#p<0.05，##p<0.01，与MPTP+Nicotine组比较。1802.1.3尼古丁增加了MPTP小鼠中脑DA能神经元的数量为了进一步的验证尼古丁是否减弱MPTP对中脑DA能神经元的损伤作用，我们利用免疫组化实验更加直观的观察了中脑DA能神经元数量的变化。由于纹状体中的DA能神经纤维主要来自于中脑黒质DA能神经元的投射，因此我们同时对纹状体、黒质和VTA进行了TH免疫活性的检测（图3-A,B）。结果显示MPTP鼠纹状体中的DA能神经纤维密度明显185低于腹腔注射生理盐水的对照组小鼠，而尼古丁可以改善这一现象（图3-A）。图3-C和图3-D分别是对小鼠SNpc和VTA的TH免疫反应阳性的神经元计数的统计，其结果表明MPTP严重诱导了小鼠SNpc和VTA部位的DA能神经元损伤，而尼古丁的注射缓解了这种DA能神经元的丢失，对其起到了保护的作用。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn190图3：小鼠纹状体和黒质中TH免疫组化A图和B图分别是纹状体和黒质部位冠状切片进行TH免疫组化后的图片，Scalebar分别是500m和200m；C图和D图分别是对VTA和SNpc部位TH阳性神经元的计数。各组小鼠n=3-5。**p<0.01，***p<0.001，与生理盐水组比较；#p<0.05，与MPTP+Nicotine组比较。2.2尼古丁改善了MPTP小鼠的嗅觉损伤1952.2.1尼古丁提高了MPTP小鼠的嗅觉察觉能力PD患者的嗅觉障碍表现在嗅觉察觉、嗅觉辨别等各个方面，同样，MPTP小鼠也存在几个方面的嗅觉障碍。我们利用不同的行为学来检测小鼠不同方面的嗅觉障碍。图4显示的是小鼠寻找饼干的行为学实验，这个实验用来检测小鼠嗅觉察觉方面的障碍。这个行为学应用最为广泛，也最为简单，我们只需要让小鼠去寻找埋藏在垫料下的饼干即可。由于饼干是200完全埋藏在垫料里，所以小鼠只能利用它的嗅觉来去寻找饼干。我们认为小鼠越快的寻找到饼干，其嗅觉的察觉能力越强，反之越差。从结果可以看出MPTP组的小鼠比对照组的小鼠多花了一倍左右的时间去寻找饼干，而给予尼古丁注射的MPTP小鼠则明显的缩短了寻找饼干的时间。因此，我们可以认为尼古丁对改善MPTP小鼠的嗅觉察觉能力发挥了一定的作用。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn205图4：小鼠嗅觉察觉能力的检测小鼠在埋藏饼干试验中小鼠寻找饼干所花时间的统计图。各组小鼠n=7。***p<0.001，与生理盐水组比较；#p<0.05，与MPTP+Nicotine组比较。2.2.2尼古丁提高了MPTP小鼠的嗅觉分辨能力210埋藏饼干的实验只能检测小鼠的嗅觉察觉能力，我们主要通过木块实验来考察小鼠的嗅觉分辨能力。小鼠对不熟悉的气味会有一种好奇的心理，我们利用小鼠的这一特点设计了木块实验。木块实验中，我们会让小鼠接触两种带有不同气味的木块：自己笼盒垫料的气味和其他鼠笼盒垫料的气味。如图5-A所示，我们发现小鼠会同时去嗅两中不同气味的木块，但是它对不熟悉的气味则更有兴趣，所以去嗅这种木块的时间就会比嗅熟悉气味的木块时间长。215因此我们认为当小鼠的嗅觉辨别能力变差时，它就不能很好的分辨出两种木块所具有的气味的差别，这样它嗅两种木块的时间就不会相差很大。我们利用小鼠嗅不熟悉气味木块的时间与嗅熟悉气味木块的时间的比值作为评定嗅觉辨别能力的标准。如图5-B，MPTP小鼠的嗅觉辨别能力明显下降，尼古丁却可以很好的恢复这一能力。220图5：小鼠嗅觉分辨能力的检测A图为小鼠嗅两种带有不同垫料气味的木块所花的时间的统计图；B图是小鼠嗅带有自己笼盒垫料气味和带有其他鼠笼盒垫料的气味的木块所花时间的比值的统计图。各组小鼠n=7。**p<0.01，与生理盐水组比较；#p<0.05，与MPTP+Nicotine组比较。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.2.3尼古丁对MPTP小鼠嗅觉记忆的影响225某些PD患者的嗅觉记忆也是出现损伤的，我们利用嗅觉记忆实验来观察是否MPTP小鼠也会表现出相似的症状。在试验中，将巧克力埋藏在沙子里，但是有四种不同气味的沙子，各种气味互不干扰。我们让小鼠分两次去寻找巧克力，时间间隔为24小时。由于沙子的气味不同，而两次巧克力是埋藏在同一种气味的沙子里，所以当小鼠第一次寻找到巧克力以后，会产生对含有这种气味沙子的嗅觉记忆。当它第二天去寻找巧克力的时候，由于存在嗅觉记230忆便会缩短寻找的时间。我们利用第二天与第一天寻找巧克力时间的比值作为评定小鼠嗅觉记忆的标准。图6-A和图6-B分别是小鼠两次寻找巧克力的时间，图6-C则是第二天与第一天寻找巧克力时间的比值。但是从结果的分析中，我们发现MPTP小鼠的嗅觉记忆只有下降的趋势，并无统计学差异，而尼古丁对MPTP造成小鼠轻微的嗅觉记忆减退的影响则表现的很弱。我们分析如果增加实验的样本量以及更好的完善实验方法，可能可以发现MPTP235和尼古丁在嗅觉记忆中的影响。图6：小鼠嗅觉记忆能力的检测图A和图B分别是小鼠前后两次寻找巧克力所花费的时间的统计图；C图是小鼠第二次与第一次寻找巧克力花费时间的比值的统计图。各组小鼠n=7。各组间均没有统计学意义。2402.3尼古丁减缓了MPTP小鼠嗅球和HDB中ChAT蛋白水平的下降，并且保护了MPTP小鼠的HDB中的DA能神经纤维2.3.1尼古丁对MPTP小鼠嗅球和HDB中ChAT水平变化的影响文献报道ACh在嗅觉信号的传递过程中发挥着重要的作用，而嗅球的各个层面又广泛分布着ACh能神经纤维。所以我们想通过检测ChAT蛋白的表达水平来解释MPTP和尼古245丁对于小鼠嗅觉功能的影响。从图7-A中可以看到MPTP小鼠嗅球中的ChAT蛋白水平明显下降，而尼古丁可以很好的缓解这种现象。图7-C显示的是HDB中ChAT的变化，得到与嗅球中类似的结果。-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图7：小鼠嗅球和HDB中ChAT蛋白水平的表达250A图和C图分别是嗅球和HDB中ChAT蛋白表达的免疫印迹图；B图和D图分别是相对应的ChAT蛋白表达量的统计图。各组小鼠n=3。***p<0.001，与生理盐水组比较；#p<0.05，与MPTP+Nicotine组比较。2.3.2尼古丁提高了MPTP小鼠HDB中TH的水平HDB中除了存在ACh能神经元，还分布着DA能神经纤维。因此我们检测了HDB中255TH蛋白的表达水平，结果显示与对照组相比，MPTP小鼠的TH蛋白水平明显下降，但是给予尼古丁的小鼠的TH蛋白水平却显著提高。图8：小鼠嗅球和HDB中ChAT蛋白水平的表达A图是HDB中TH蛋白表达的免疫印迹图；B图是相对应的TH蛋白表达量的统计图。各组小鼠n=3。260**p<0.01，与生理盐水组比较；#p<0.05，与MPTP+Nicotine组比较。3讨论研究者观察到MPTP模型小鼠具有严重的嗅觉障碍，在转棒实验中出现明显的运动损伤，同时SNpc和VTA部位的DA能神经元出现明显丢失及纹状体部位的DA含量下降。给予尼古丁治疗3周后，我们发现与MPTP造模组相比，小鼠嗅觉功能有所改善，且减少265了中脑黑质DA能神经元丢失。而且，尼古丁缓解了MPTP引起的HDB和嗅球中ChAT蛋-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn白表达水平的降低，这对改善MPTP小鼠嗅觉障碍十分重要。PD的嗅觉障碍主要表现在气味识别、气味辨别、气味记忆等各个方面，但每个方面在不同的PD患者中又存在着差异[15]。对PD患者的嗅觉检查主要有嗅觉识别、嗅觉察觉阈值、嗅觉记忆和嗅觉辨别四个指标[16]。研究者利用木块实验来考察小鼠对气味辨别的能力。我270们发现除了MPTP组的小鼠，其他各组的小鼠都明显更加喜爱去嗅沾染了不同于自己笼盒内垫料气味的木块，即这些小鼠具有较强的嗅觉分辨能力。早在20世纪70年代，Ansari和Johnson就通过对22例帕金森病患者进行研究后首次提出PD患者存在嗅觉障碍[17]。随后研究人员就发现PD患者存在嗅觉察觉阈值的改变。研究者采用了一种十分普遍且简单的方法，即埋藏饼干实验来检测小鼠的嗅觉察觉能力。我们275的结果显示MPTP组的小鼠需要比对照组花费更多的时间来寻找埋藏的饼干,而给予尼古丁的MPTP的小鼠，则明显缩短了时间。这表明MPTP小鼠嗅觉察觉阈值升高了，而尼古丁则可以发挥降低其阈值的作用。嗅觉记忆是评估嗅觉能力的另一个指标，可以将其划分为两种不同的记忆方式：长期记忆和短期记忆。研究者利用小鼠前后两天寻找埋藏在相同气味沙子下的巧克力时间的比值来280作为评估小鼠嗅觉记忆的标准。结果发现MPTP小鼠的嗅觉记忆只有轻微的下降，而尼古丁并没有在此处发挥作用。嗅球在嗅球系统中是十分重要的。我们知道嗅球的结构十分复杂，它含有多种神经递质[18]。其中ACh在嗅觉信号的传递过程中发挥十分重要的作用[19,20]。嗅球中胆碱能神经系统的紊乱可能是PD出现嗅觉障碍的原因之一。嗅球中分布的ACh能神经纤维主要是来自于285位于基底前脑的HDB中ACh能神经元的投射[21,22]。研究者的结果显示MPTP小鼠的嗅球与HDB中的ChAT蛋白表达都出现下降的趋势，也就是说MPTP损伤了小鼠嗅球中的ACh能神经纤维和HDB中的ACh能神经元。但是ACh能神经元丢失的机制还有待进一步的研究。已有的文献报道在MPTP对待的猴子中，其HDB不仅出现了ACh能神经元的丢失，290还发现了DA能神经纤维密度的下降[23]。研究者在MPTP小鼠的HDB组织中也看到了相同的结果。尽管之前的研究表明MPTP可以选择性的损伤中脑DA能神经元，但是研究者及其他的研究结果都证明了在HDB中DA能神经纤维密度的减少可能也会导致ACh能神经元的退化与丢失[24]。并且研究者还发现在MPTP模型鼠中尼古丁可以减缓HDB的DA能神经纤维密度的下降和ACh能神经元的丢失。除此之外，研究者还发现尼古丁保护了MPTP小鼠295VTA的DA能神经元的丢失，这与之前的研究结果是一致的。而且文献报道HDB的DA能神经纤维主要来自于VTA的DA能神经元的投射[25]。研究者在试验中证实了尼古丁可以改善MPTP小鼠的运动能力和嗅觉障碍，同时对中脑DA能神经元的丢失起到了保护作用。而进一步的研究发现尼古丁改善MPTP小鼠的嗅觉障碍是由于其提高了基底前脑的ACh能的水平。并且中脑DA能神经元存活的增多的可能对ACh水平的上升发挥一定的作用。3004结论尼古丁可以通过保护嗅球中的胆碱能系统来改善MPTP小鼠的嗅觉障碍。而且尼古丁提高MPTP小鼠嗅球中的胆碱能系统与缓解中脑DA能神经元的丢失相关。-11- 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