GBT28228-2011入出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法.pdf 9页

'Ics07．100．20C51a雪中华人民共和国国家标准GB／T28228--2011入出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法DetectionofListeriamonoc》togenesinballastwaterofentry-exitships2011—12-30发布2012—05—01实施丰瞀鹊鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置GB／T28228—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准修改采用美国食品和药物管理局(FDA)《细菌学检验手册：单核细胞增生李斯特氏菌的检测和计数》(2003年1月)(BAM：DetectionandenumerationofListeriamonocytogenes，January2003)。本标准与FDA方法的主要区别是：——增加了初筛步骤；——明确了计数步骤；——培养箱温度由35℃修改为36℃士1℃。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国检验检疫科学研究院归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张顺合、王林、庞秋艳、张乐、李金有、李俊成、李德昕、聂维忠、陈春田、顾大勇、慈颖、赵彬、韩辉。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围入出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法GB／T28228--2011本标准规定了人出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检测程序和方法。本标准适用于入出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。2设备和材料2．1冰箱：2℃～8℃。2．2恒温培养箱：30℃土1℃，36℃土1℃。2．3显微镜：10×～100×。2．4无菌移液管或无菌量筒：1mL，25mL，精确到0．1mL。2．5锥形瓶：500mL。2．6无菌培养皿：直径90mm。2．7无菌试管：16mm×125mm。2．8接种环。2．9接种针。2．10金黄色葡萄球菌(ATcc25923)。2．11马红球菌(Rhodococcusequi)。2．12伊氏李斯特氏菌。2．13单核细胞增生李斯特氏菌。2．14英诺克李斯特氏菌。3培养基和试剂李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(BLEB)：见A．1。PALCAM琼脂：见A．2。ALOA显色培养基”。含0．6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSAye)：见A．3。SIM动力培养基：见A．4。5％羊血琼脂：见A．5。革兰氏染色液。3％过氧化氢溶液：用于过氧化氢酶试验。生化反应管”：鼠李糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、MR／VP试验。1)由法国AES公司提供的产品的商品名，给出这一信息仅为方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他产品具有相同效果，则可使用这些等效产品。2)建议使用商品化的生化反应管以保证质量稳定，也可使用自动微生物生化鉴定仪完成。1，234567893 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28228--201110盐酸吖啶黄。11萘啶酮酸钠。12放线菌酮。13多粘菌素B。4检验程序2单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序 标准分享网www.bzfxw.com免费下载5操作步骤5．1准备GB／T28228--20”用于进行单核细胞增生李斯特氏菌检测的水样应在2℃～8℃条件下进行处理、储存和运输。以无菌操作分别抽滤1L压舱水样两份，取一份集菌滤膜于2℃～8℃保存，以备计数，另一份备检。5．2增菌以无菌操作取一份集菌滤膜加入到250mL李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(BLEB)中，充分振荡混匀。30℃士1℃下培养4h，加入A．1．3中的选择性试剂，继续在30℃土1℃培养44h。5．3分离挑取培养48h的增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和ALOA李斯特氏菌显色琼脂平板，置于36℃士1℃培养24h～48h，并观察各个平板上菌落的生长状态。在PALCAM琼脂培养基上，典型菌落呈圆形灰绿色小菌落，周围有一个棕黑色水解环，部分菌落有黑色凹陷；在ALOA李斯特氏菌显色琼脂平板上，典型菌落呈圆形蓝绿色小菌落，周围有不透明晕环。5．4初筛从以上选择性琼脂平板上挑取5个或以上的典型菌落分别划线接种于胰酪胨大豆琼脂平板(TSAye)，30℃土1℃培养24h～48h，以纯化培养；同时分别接种于鼠李糖和木糖发酵管，于36℃±1℃下培养24h，选择鼠李糖发酵阳性、木糖发酵阴性的纯培养菌落继续进行鉴定。5．5鉴定5．5．1染色镜检李斯特氏菌为革兰氏阳性细短杆状菌；用无菌生理盐水制成茵悬液，在油镜或相差显微镜下观察，可见轻微旋转或翻滚样的运动。镜检可与标准菌株对照观察。5．5．2生化鉴定挑选典型的纯培养菌落按A．6进行过氧化氢酶试验，选择过氧化氢酶反应阳性的菌落进行其他生化鉴定，包括糖发酵(葡萄糖、麦芽糖、甘露醇)试验、甲基红(MR)试验、VP试验。5．5．3动力试验挑取典型的纯培养菌落穿刺接种于SIM培养基中，于30℃±l℃培养24h～48h，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长或月牙状生长。5．5．4溶血试验将5％羊血琼脂平板底面划分20个～25个小格，挑取典型的纯培养菌落刺种血平板，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(伊氏李斯特氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)。穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，防止琼脂破裂，30℃土1℃培养24h～48h。在亮光下观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌在刺种点周围产生微小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，而伊氏李斯特氏菌在接种点周围产生大的透明溶血环。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28228--20115．5．5协同溶血试验(CAMP)在羊血琼脂平板上划两条平行线，分别接种金黄色葡萄球菌和马红球菌。挑取典型的纯培养菌落在两平行线之间垂直划线接种，垂直线与两平行线相近但不相交，于30℃土1℃培养24h～48h，观察培养板上的溶血情况。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌接种的区域内溶血反应增强，且通常在24h溶血现象比在48h更明显；而在靠近马红球菌接种的区域溶血反应无增强或增强不明显。5．5．6鉴定特征单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定特征见表1。表1单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定特征鼠李糖木糖过氧化氢酶葡萄糖麦芽糖+协同溶血试验甘露醇MR／VP试验动力试验溶血试验金葡菌／马红球菌七|斗++／一注：+阳性；一阴性。5．6计数5．6．1如果样品经试验确定单核细胞增生李斯特氏菌阳性，则将另一份集菌滤膜用于计数。5．6．2以无菌操作取集菌滤膜加入10mL蛋白胨缓冲液，充分洗涤后于20℃土1℃复苏1h，移取0．1mL涂布ALOA平板，36℃士l℃培养24h，计数周围有不透明晕环的圆形蓝绿色小菌落数，平行计数两个平板，取平均值n。5．6．3每升水样中单核细胞增生李斯特氏菌估算数为100n。5．7结果报告综合以上检测试验结果，报告每升水样中未检出或报出每升水样中单核细胞增生李斯特氏菌估算数。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(BLEB)附录A(规范性附录)培养基和试剂A．1．1成分胰酪胨大豆粉3．0g酵母膏6．0g磷酸氢二钾1．4g磷酸氢二钠9．6gA．1．2制法将各组分混合，不加入抗生素，调节pH到7．3土0．2，121℃高压灭菌15min。A．1．3选择性试剂GB／T28228--201萘啶酮酸40．0mg／L放线菌酮50．0mg／L盐酸吖啶黄15．0mg／L用无菌水分别制备0．5％(质量浓度)的吖啶黄素溶液和萘啶酮酸溶液，用40％(体积分数)的酒精制备1％(质量浓度)的放线菌酮溶液，过滤除菌后。使用时每1000mL培养基分别加3mL吖啶黄素溶液、8mL萘啶酮酸溶液和5mL放线菌酮溶液。A．2PALCAM琼脂A．2．1成分酵母膏葡萄糖七叶苷柠檬酸铁铵甘露醇酚红氯化锂酪蛋白胰酶消化物心胰酶消化物玉米淀粉肉胃酶消化物氯化钠琼脂蒸馏水gg●g0g0OgOⅪO585．1．．00．X．．O．50．．5(801013151 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28228--2011A．2．2PALCAM选择性添加剂多粘菌素B盐酸吖啶黄头孢他啶无菌蒸馏水A．2．3制法5．0mg2．5mg10．0mg500mL将A．2．1中成分加热溶解，调pH至7．2～7．4，121℃高压灭菌15rain，冷却至50℃，加入2mLPALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒无菌平皿，备用。A．3含0．6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼J][(TSAye)A．3．1成分胰胨脲胨酵母膏氯化钠磷酸氢二钾葡萄糖琼脂蒸馏水A．3．2制法17．0g3．0g6．0g5．0g2．5g2．5g15．0g1000mL将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7．2～7．4，分装，121℃高压灭菌15min，备用。A．4SIM动力培养基A．4．1成分胰胨多价胨硫酸铁铵硫代硫酸钠琼脂蒸馏水A．4．2制法20．0g6．0g0．2g0．2g3．5g1000mL将上述各成分加热混匀，调pH至7．2，分装小试管，121℃高压灭菌15min，备用。A．55％羊血琼脂A．5．1成分蛋白胨1．0g 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28228--2011牛肉膏0．3g氯化钠0．5g琼脂1．5g蒸馏水1000mLA．5．2制法加热熔化上述各组分，121℃高压灭菌15rain，冷却到50℃，以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血5mL，摇匀，倾注平板。乱6过氧化氢酶试验丸6．1试剂3％过氧化氢溶液：现配现用。A．6．2试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净试管内，滴加3％过氧化氢溶液2mL，观察结果。A．6．3结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。A．7蛋白胨缓冲液A．7．1成分蛋白胨氯化钠十二水磷酸氢二钠磷酸二氢钾蒸馏水A．7．2制法10．0g5．0g9．0g1．5g1000mL调节pH至6．7，121℃高压灭菌15min，备用。'