GBT28230-2011膜过滤法测定入出境船舶压舱水中大肠菌群.pdf 6页

'ICS07．100．20C51缮圄中华人民共和国国家标准GB／T28230--2011膜过滤法测定入出境船舶2011—12—30发布压舱水中大肠菌群Enumerationofcoliformsinballastwaterofentry-exitshipsbymembranefiltration2012-05-01实施宰瞀鹊紫瓣警襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB／T28230--201本标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准修改采用美国环境保护局(EPA)《方法1604：膜过滤法联合测定水中总大肠菌群和大肠杆菌》(2002年9月)[Method1604：TotalcoliformsandEscherichiacoliinwaterbymembranefiltrationusingasimultaneousdetectiontechnique(MImedium)，septemberzooz3。本标准与EPA方法的主要区别是：——删除了大肠杆菌计数的内容；——培养箱温度由35℃土0．5℃修改为36℃士1℃；——增加将水样梯度稀释的步骤。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国检验检疫科学研究院归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广州出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王林、张顺合、张乐、李俊成、李金有、聂维忠、廖如燕、陈春田、常林、慈颖、庞秋艳、杨晨光、韩辉。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围膜过滤法测定入出境船舶压舱水中大肠菌群GB／T28230--2011本标准规定了采用膜过滤法测定入出境船舶压舱水中大肠菌群(coliforms)的程序和方法。本标准适用于对人出境船舶压舱水中的大肠菌群进行计数。2设备和材料2．1恒温培养箱：36℃±1℃。2．2冰箱：2℃～8℃。2．3100rnL量筒：灭菌。2．4膜过滤装置”：见4．1．2。2．5无菌纤维素酯滤膜，白色，带格栅，直径47mm，孔径0．45pm。2．6无菌移液管：10mL，精确到0．1mL。2．7无菌生理盐水。2．8锥形瓶：150mL。2．9紫外线灯：波长366nm。2．10无菌培养皿：直径50mnl，2．11无菌滤器：孔径0．22pm。2．12MI培养基：见附录A。3检测程序大肠菌群检测程序见图1。4操作步骤4．1准备4．1．1制备MI琼脂培养基，4℃保存的培养基应待温度恢复至室温备用。4，1．2装配过滤装置：用消毒镊子夹取无菌滤膜置于滤器多孔盘上，格栅面向上，装配滤杯与滤器基座，连接缓冲瓶、真空泵(无真空泵可用注射器代替)。过滤装置示意见图2。1)可使用等效的膜过滤装置。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28230--2011图1大肠菌群检测程序4．1．3样品稀释：用无菌移液管移取10mL水样至盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶内，充分混匀，根据对样品污染状况的估计，按上述操作依次制成10倍系列等比稀释的样品匀液备检。每份样品选取3个适宜的连续稀释度分别进行检测。4．2抽滤4．2．1加30mL无菌水于滤杯中，充分浸湿滤膜。4．2．2用无菌量筒量取100mL水样或稀释液，倒人滤杯，开启真空泵，抽滤完100mL水样后分别用30mL无菌水冲洗滤杯两次。4．2．3关闭真空泵，移去滤杯，用消毒镊子轻轻夹取滤膜边缘，将滤膜格栅面向上覆于MI琼脂培养基上，用镊子轻压或滑动滤膜，使其贴紧培养基，防止滤膜边缘翘起或与琼脂之问形成气泡。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28230--201说明：1——滤杯；2——滤膜；3——多孔盘；4——抽滤瓶；5——缓冲瓶；6——真空泵(或注射器)。图2膜过滤装置示意图4．3培养将培养皿滤膜面向上，置于36℃土1℃培养箱培养24h。4．4计数4．4．1在暗室或紫外操作室中于366nm紫外线下计数所有发荧光的菌落数a(包括蓝绿色荧光菌落和蓝白色荧光菌落)。4．4．2计数在自然光下呈蓝色但在366nm紫外线下不发荧光的菌落数b。4．4．3选择总菌落数≤200，且n+6≤100的稀释度平板进行计数，如有多个稀释度平板符合计数要求，则选择目标菌落数较多的平板进行计数。4．5计算与报告结果检样中的大肠菌群数为n+b，根据检样的稀释度计算并报告每100mL压舱水样中的大肠菌群数。B一 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28230--2011A．1成分蛋白胨酵母浸膏口一D-$L糖4一甲基伞形酮币一半乳糖苷(MUGal)(终浓度100tLg／mL)羟基吲哚-卢一D葡萄糖苷酸(IBDG)(终浓度320ttg／mL)氯化钠(Nacl)磷酸氢二钾(K：HPO。)磷酸二氢钾(KH。PO。)十二烷基硫酸钠(SLS)脱氧胆酸钠琼脂蒸馏水A．2头孢磺啶溶液附录A(规范性附录)MI琼脂培养基5g3g1g0．1g0．32g7．5g3．3g1．0g0．2g0．1g15g1000ITIL将0．02g头孢磺啶溶于20mL蒸馏水中，用0．22btm滤器过滤除菌，现配现用。A．3配制将A．1中成分加热搅拌溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至45℃～50℃后，每升加入5mL新制备的头孢磺啶溶液(终浓度为5ttg／mL)，倾倒50mm培养皿，每皿约5mL，2℃～8℃冰箱保存。'