GBT28229-2011入出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检验方法.pdf 10页

'Ics07．100．20C51雷园中华人民共和国国家标准GB／T28229--2011入出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检验方法DetectionofdiarrheagenicEscherichiacoliinballastwaterofentry-exitships2011-12-30发布2012—05—01实施丰瞀鹊紫瓣警辫瞥叁发布中国国家标准化管理委员会议19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB／T28229--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准修改采用美国食品和药物管理局(FDA)《细菌学检验手册：致泻大肠埃希氏菌》(2009年7月)(BAM：DiarrheagenicEscherichiacoli，July2009)。本标准与FDA方法的主要区别是：——删除部分毒力因子检测步骤；——删除实时定量PCR初筛步骤；——培养温度由35℃士0．5℃修改为36℃士1℃。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国检验检疫科学院归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广州出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王林、张顺合、常林、李俊成、张乐、李金有、李德昕、聂维忠、廖如燕、陈春田、慈颖、刘恩东、韩辉。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围入出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检验方法GB／T28229--2011本标准规定了人出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenicEscherlchiacoli)的检测程序和方法。本标准适用于人出境船舶压舱水中致泻大肠埃希氏菌的检测。2定义下列术语和定义适用于本文件。2．1致泻大肠埃希氏菌diarrheagenicEscherichiacoli大肠埃希氏菌属中一部分致病性强、能导致腹泻、与人类疾病有关的菌株统称，通常包括肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)等。‘3设备和材料3．1冰箱：2℃～8℃。3．2恒温培养箱：36℃±1℃，44℃±1℃。3．3过滤集菌装置。8．4紫外灯：波长365nm。3．5无菌锥形瓶：500mL。3．6无菌移液管：25mL，精确到0．1mL。3．7移液器：0．1mL，精确到0．01mL。3．8接种环。3．9接种针。3．10无菌培养皿：90mm。4培养基和试剂4．1脑心浸液肉汤(BHI)。4．2双倍胰蛋白胨磷酸盐肉汤(dTP)：见A．1。4．3EHEC增菌肉汤(EEB)：见A．2。4．4伊红美蓝琼脂(EMB)：见A．3。4．5麦康凯琼脂(MAc)：见A．4。1)建议使用商品化培养基和生化反应管以保证质量稳定，生化反应也可使用微生物自动生化鉴定设备完成 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／"r28229--2014．6改良山梨醇麦康凯培养基(TC-sMAC)：见A．5。4．7月桂基硫酸盐胰蛋白胨MUG肉汤(Ls-MuG)：见A．6。4．8三糖铁琼脂(TSI)：见A．7或A．8。4．9生化反应管：阿拉伯糖、尿素、吲噪(靛基质)、MP／VP、柠檬酸盐、半乳糖苷(ONPG)。4．10肠致病性大肠埃希氏菌诊断血清。4．11肠出血性大肠埃希氏菌诊断血清。4．12肠侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清。4．13肠产毒性大肠埃希氏菌诊断血清。5检测程序致泻大肠埃希氏菌检测程序见图1。图1致泻大肠埃希氏菌检测程序 标准分享网www.bzfxw.com免费下载6操作步骤6．1准备以无菌操作分别抽滤1L压舱水样两份，取集菌滤膜备检。GB／T28229—20116．2增菌6．2．1以无菌操作取1份集菌滤膜加入到250mL的脑心浸液肉汤(BHI)中，振荡混匀，于36℃土1℃培养3h，加入250mL双倍胰蛋白胨磷酸盐肉汤(dTP)，混匀后于44℃±1℃培养18h～24h。6．2．2以无菌操作取1份集菌滤膜加入到250mL的EHEC增菌肉汤(EEB)中，于36℃±1℃振荡培养18h～24h。6．3分离6．3．1挑取BHLdTP增菌液划线接种于伊红美蓝琼脂(EMB)和麦康凯琼脂(MAC)，于36℃士1℃培养18h～24h后，观察茵落。典型菌落在伊红美蓝琼脂上呈黑色扁平菌落，大部分有金属光泽，在麦康凯琼脂上呈红色或粉红色。6．3．2挑取EEB增菌液涂布改良山梨醇麦康凯琼脂(TC-SMAC)，于36℃士1℃培养18h～24h后观察菌落。典型菌落呈淡褐色中心，扁平透明，直径约1mm～2miD．。．6．3．3自TC-SMAC上挑取数个典型茵落，分别接种伊红美蓝琼脂(EMB)和月桂基硫酸盐胰蛋白胨MUG肉汤(LST-MUG)。EHEC在EMB上的典型菌落同6．3．1，LST-MUG培养液置于365am长波紫外灯下无荧光。6．3．4若多个选择性培养基均未发现可疑菌落，出具未检出报告。6．4生化试验自多个选择性平板上挑取5个以上可疑菌落接种三糖铁琼脂(TSI)，接种时使用接种针先穿刺至底部，而后于斜面作划线，于36℃士1℃培养20h；同时进行染色镜检和其他生化鉴定，包括阿拉伯糖、尿素、吲哚(靛基质)、MR／VP、柠檬酸盐和半乳糖苷(ONPG)。大肠埃希氏菌是革兰氏阴性短杆菌，在TSI底部产酸呈黄色，不产生硫化氢(H：s)，其他生化鉴定特征见表1。表1大肠埃希氏菌鉴定特征阿拉伯糖尿素吲哚MR／VP试验柠檬酸盐ONPG++或+注；+阳性，一阴性。6．5血清学试验综合以上试验结果，挑取经初步生化鉴定出的大肠埃希氏菌落，用肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌诊断血清做凝集试验，根据致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群(见表2)判定致泻大肠埃希氏菌的种类。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28229--201表2致泻大肠埃希氏菌所包括的。抗原群致泻大肠埃希氏菌的种类包括的O抗原群018a020a026028ac044055086a011la011401190125a01260127EPEC0128a014201580159ETEC060801101502002502706307801280148014901590167EIEC028ac0112a012401360143014401520167EHEC01576．6报告结果报告每升水样中未检出或检出致泻大肠埃希氏菌和种类。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1双倍胰蛋白胨磷酸盐肉汤(dTP)A．1．1成分胰蛋白胨磷酸氢二钾磷酸二氢钾氯化钠吐温80蒸馏水附录A(规范性附录)培养基和试剂A．1．2制法以上成分溶解于蒸馏水后，121℃高压灭菌15rain，pH约7．0。A．2EHEC增菌肉汤(EEB)A．2．1基础成分胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾葡萄糖3号胆盐磷酸二氢钾蒸馏水17g3g0g2．5g2．5g1．5g1．5g1000mLGB／T28229--2011A．2．2抗生素溶液头孢克肟(cefixime)0．05mg头孢磺啶(cefsulodin)10．00mg万古霉素(vancomycin)8．00mg分别溶于5mL去离子水，经0．22pm滤器过滤除菌，备用。A．2．3制法基础成分溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌15rain，pH约7．4，冷却至50℃左右加入抗生素溶液混匀备用。5吨ggg巧22々o5l 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28229--2011A．3伊红美蓝琼脂(EMB)A．3．1基础成分蛋白胨磷酸氢二钾琼脂蒸馏水A．3．2其他成分20％乳糖2％伊红Y溶液0．65％美蓝溶液分别过滤除菌，备用。A．3．3制法10g2g17g1000mL50mL20mL10mL基础成分溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌15rain，pH约7．1，冷却至50℃左右，加入乳糖、伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。A．4麦康凯琼Ill(MAC)A．4．1基础成分蛋白胨胨3号胆盐氯化钠琼脂蒸馏水乳糖0．01％结晶紫水溶液0．5％中性红水溶液A．4．2制法将以上成分加热溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min备用，pH7．2，冷却至50℃左右倾注平板。A．5改良山梨醇麦康凯培养基(TC-SMAC)A．5．1成分蛋白胨多蛋白胨山梨醇17．0g3．0g10．0gO¨vn。m。h㈣％～乩；i! 标准分享网www.bzfxw.com免费下载胆盐氯化钠琼脂中性红结晶紫蒸馏水A．5．2制法1．5g0g13．5g0．03g0．001g1000ITILGB／T28229--201将以上成分加热溶解于蒸馏水中，121℃高压灭菌15rain，pH7．1，冷却至50℃左右倾注平板。A．6月桂基硫酸盐胰蛋白胨MUG肉汤(LST-MUG)A6．1成分胰示胨乳糖磷酸氢二钾磷酸二氢钾氯化钠十二烷基硫酸钠4一甲基伞形酮一pn葡萄糖醛酸苷MUG蒸馏水A．6．2制法将以上成分加热溶解于蒸馏水中，pH约6．8，分装到试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15min。A．7三糖铁琼脂(TSI)A．7．1成分蛋白胨牛肉膏乳糖蔗糖葡萄糖氯化钠硫酸亚铁铵硫代硫酸钠琼脂酚红蒸馏水A．7．2制法．2g2g．025g000mL将以上成分溶解于蒸馏水中，pH约7．3，118℃高压灭菌15rain。分装试管，装量宜多些，以便得g呱。mm。“呱㈣Z525O51g呱。呱吣。。卫25；50 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28229--2011到较高的底层，制成高层斜面备用。A．8三糖铁琼脂(替代方法)A．8．1成分蛋白胨示胨牛肉膏酵母膏乳糖蔗糖葡萄糖氯化钠硫酸亚铁硫代硫酸钠琼脂酚红蒸馏水A．8．2制法15g0g3gJg10g10g1gbg0．2g0．3g12g0．025g1000mL将以上成分溶解于蒸馏水中，加热溶解，pH约7．4。121℃高压灭菌15rain，分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层，制成高层斜面备用。'