鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖的流变学特性研究.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖的流变学特性研究**邱丽淳，甘聃，谢旻皓，武忠伟，陈贵杰，叶红，胡冰，曾晓雄（南京农业大学食品科技学院，南京，210095）5摘要：采用液体深层发酵制备鼎湖鳞伞菌丝体，再用热水浸提、乙醇沉淀的方法获得粗多糖(PDP)。在静态流变学性质测试，考察了浓度、温度、pH值、蔗糖及无机盐添加量（NaCl及CaCl2）对粗PDP溶液表观粘度的影响，结果表明粗PDP溶液的表观粘度随着多糖浓度的增加而上升，随着剪切速率的增加而快速下降，说明粗PDP溶液是假塑性流体（非牛顿10流体）；多糖溶液的表观粘度在pH=6-10的范围内保持稳定，而在强酸性条件下则明显上升；添加低浓度CaCl2，粗PDP粘度变化不明显，但随着浓度的继续增加而逐渐增大。因此，粗PDP溶液具有较好的耐热、耐碱及耐盐稳定性。关键词：鼎湖鳞伞；菌丝体多糖；流变学特性中图分类号：TS201.715RheologicalpropertyofmycelialpolysaccharidesfromPholiotadinghuensisBiQIULichun,GANDan,XIEMinhao,WUZhongwei,CHENGuijie,YEHong,HUBing,ZENGXiaoxiong20(CollegeofFoodScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,210095)Abstract:ThemyceliaofPholiotadingensisBiwereproducedbythesubmergedfermentationandcrudepolysaccharides(PDP)wereobtainedbyhydrothermalextractionandethanolprecipitation.Effectsofconcentration,temperature,sucrose,pH,NaClandCaCl2onthestaticrheologicalpropertyofcrudePDPwereinvestigated.TheresultsshowedthattheapparentviscosityofcrudePDPincreased25withtheincreaseofcrudePDPconcentration,whiledecreasedsignificantlywiththeincreaseofshearrate,indicatingthatcrudePDPsolutionwasanon-Newtonianpseudoplasticfluid.TheapparentviscosityofcrudePDPremainedstableunderpHof6-10,whileincreasedsignificantlywithastrongacidtreatment.TherheologicalpropertyofcrudePDPdidnotchangedinalowconcentrationofCaCl2,andgraduallyincreasedwithahigherconcentrationofCaCl2.Therefore,crudePDPwasresistantto30heat,alkaliandsalt.Keywords:PholiotadinghuensisBi;Polysaccharides;Rheologicalproperty0引言作为球盖菇科的成员之一，鳞伞属富含维生素、微量元素、多糖等多种营养成分，研究[1-4]发现该属具有抗肿瘤、抗炎等广泛的生物活性。早在1985年，鼎湖鳞伞菌就被国内学者[5-7]35发现并鉴定，然而目前关于该中国特有新种中生物活性成分的研究及报道依旧寥寥无几。除了培育真菌子实体的传统方法外，药用真菌多糖亦可采用液体深层发酵法来制备菌丝体，继而从菌丝体、发酵液中提取多糖，大大缩短了制备时间，提高了生产效率，且生产过程容易控制，目标产品质量高，通常要经过斜面菌种、摇床、种子罐、发酵罐培养等一系列[8,9]工艺流程。故液体深层发酵法被广泛运用到真菌胞内外多糖的制备。[10]40多糖的粘度受内因和外因的共同影响，内因包括多糖的分支度、分子量、微观结构；基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130097110021）作者简介：邱丽淳（1993—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术通信联系人：曾晓雄（1964-），男，教授、博导，主要研究方向：糖生物学与糖生物工程，食品生物技术.E-mail:zengxx@njau.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[11-14]外因包括浓度、温度、酸碱度、糖浓度、盐的类型及浓度等。通过流变学特性研究，可[15,16]以了解多糖在溶液中的链构象和构象之间的相互转变等，有助于指导多糖在各种研究实验过程中保持结构稳定性，为进一步探究其生理活性和构效关系奠定基础。[17-18]本研究采用甘聃等报道的液体发酵法制备鼎湖鳞伞菌丝体多糖的优化工艺来制备45菌丝体，经热水提取、乙醇沉淀获取粗多糖。通过设置不同条件，来考察浓度、温度、pH值、蔗糖和盐离子（NaCl、CaCl2）添加量对粗PDP表观粘度的影响。1材料与方法1.1材料与试剂鼎湖鳞伞菌种来源于广东微生物研究所菌种保藏中心（中国，广州）。50葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯化钠、乙醇、丙酮、乙醚、氢氧化钠、盐酸、KH2PO4、MgSO4等，为国产分析纯；马铃薯采购于苏果超市（江苏，南京）；麦芽购于三九药店（江苏，南京）。3斜面培养基：200g马铃薯切成1cm左右，放入水中，煮至软烂（20-30min），用纱布过滤，加葡萄糖、琼脂各20g，加热熔化并搅拌均匀，稍冷加水至1L，分装于试管，加55塞、包扎，于121℃灭菌20min，摆成斜面，冷凝备用。种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏4g/L，KH2PO41g/L，MgSO41g/L，去离子水1000ML。发酵培养基：葡萄糖45g/L，酵母膏6g/L，无机盐KH2PO4和MgSO4分别为1.5g/L和0.5g/L，马铃薯100g/L，麦芽粉2.5g/L。601.2液体发酵制备菌种接种在斜面培养基上并在4℃条件下保藏，每隔两个月进行传代以保持菌种的活力。在传代或者活化时，取菌丝块接种于灭菌处理过的斜面培养基上，于温度为28℃的恒温培养箱中培养9天，此时菌丝已长满整个斜面培养基。接下来进行摇床培养，用灭菌过的小药勺挑取菌丝块适量，接种于装有适量液体培养基的锥形瓶中，置于28℃的摇床上，转65速为150r/min，培养10-15天。将培育好的菌实体打散后备用。上述菌种液再按照15%的比例接种至发酵培养基，在温度为28℃、转速为120rpm的摇床中培养10天，以进一步扩大培养。1.3粗PDP的制备采用减压抽滤的方法将发酵液与菌丝体分开，菌丝体以去离子水冲洗多次后冷冻干燥，70再用研钵研磨成粉末后，按照1:10的料液比加入去离子水，用玻璃棒搅拌均匀后，90℃条件下隔水加热3h，趁热过滤，并将滤渣重复提取，将两次收集的提取液合并，离心除杂后，真空浓缩到原来的1/6，再倒入3倍体积的无水乙醇，玻棒拌匀，4℃条件下静置12h，4000-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnrpm离心20min，倒掉上层清液，沉淀分别用适量的丙酮、乙醚溶液洗涤，重复两次，用去离子水复溶后，真空冷冻干燥，得到粗PDP。751.4静态流变学测试1.4.1浓度对粗PDP表观粘度的影响准确称取粗PDP，加水后磁力搅拌至完全溶解，静置过夜，通过PhysicaMCR301流-1变仪测定样品液表观粘度（剪切速率0.01-1000s，间隙：0.5mm，测试温度：25℃），考察浓度（3,6和9%）对粗PDP溶液表观粘度的影响。采用PhysicaRheoPlus软件采集数80据。1.4.2温度对粗PDP表观粘度的影响配制6%的粗PDP，加水后磁力搅拌至完全溶解，静置过夜，通过PhysicaMCR301流-1变仪测定样品液表观粘度（剪切速率：0.01-1000s，间隙：0.5mm，温度控制系统精度±0.01℃），考察温度（5、25、45℃）对粗PDP溶液表观粘度的影响。851.4.3pH对粗PDP表观粘度的影响配制6%的粗PDP溶液，加水后磁力搅拌至完全溶解，静置过夜，通过滴加盐酸及氢氧化钠溶液而得到不同pH的粗PDP溶液，静置到pH值稳定。通过PhysicaMCR301流-1变仪测定样品液表观粘度（剪切速率0.01-1000s，间隙：0.5mm，测试温度：25℃），考察不同pH（3、6、7、8、10）对粗PDP溶液表观粘度的影响。901.4.4蔗糖对粗PDP表观粘度的影响配制6%的粗PDP溶液，加水后磁力搅拌至完全溶解，静置过夜，通过PhysicaMCR301-1流变仪测定样品液表观粘度（剪切速率0.01-1000s，间隙：0.5mm，测试温度：25℃），考察蔗糖添加量（2、4、6、8、10%）对粗PDP溶液表观粘度的影响。1.4.5盐对粗PDP表观粘度的影响95配制6%的粗PDP溶液，加水后磁力搅拌至完全溶解，静置过夜，通过PhysicaMCR301-1流变仪测定样品液表观粘度（剪切速率0.01-1000s，间隙：0.5mm，测试温度：25℃），分别考察不同浓度NaCl及CaCl2溶液（0.001、0.01、0.1及1.0M）对粗PDP溶液表观粘度的影响。2结果与分析1002.1粗PDP的制备如图1所示，液体深层发酵生成的鼎湖鳞伞菌丝体呈大小均一的白色颗粒，发酵液为浅黄色。实验结果表明，鼎湖鳞伞菌在葡萄糖45g/L，马铃薯100g/L，酵母膏6g/L，麦芽粉2.5g/L，无机盐KH2PO41.5g/L及MgSO40.5g/L配制而成的发酵培养基中，以15%的接种量，于28℃、120rpm的条件下培养10天后，测得PDP产量约为429mg/L。可见，液体深105层发酵法来制备菌丝体，继而提取多糖，大大缩短了生产时间，提高了生产效率，且生产过[8,9]程容易控制，目标产品质量高。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图1液体深层发酵鼎湖鳞伞菌丝体的生长状态Fig.1ThegrowthofmyceliaofPholiotadingensisBibythesubmergedfermentation1102.2静态流变学性质2.2.1浓度对粗PDP表观粘度的影响图2为25℃下，多糖浓度对粗PDP表观粘度的影响。从测定结果可知，多糖溶液的表观粘度在3%~9%的浓度范围内不断增大，这是由于单位区域的多糖分子大量聚集，导致分[19]子之间相互缠结，从而使得粘度增大。表现出随着剪切速率的增加而快速下降的假塑性115流体性质，说明粗PDP溶液是非牛顿流体。当剪切速率达到某一程度时，物理交联点破坏[7]速度超过其复原速度，从而导致其粘度急剧的下降。图2浓度对粗PDP表观粘度的影响Fig.2EffectofconcentrationonapparentviscosityofcrudePDP-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1202.2.2温度对粗PDP表观粘度的影响图3为温度对粗PDP表观粘度的影响。从结果中可知，温度对多糖表观粘度影响无差异，高于室温（45℃）时其表观粘度才略微减小。这是由于温度升高促进多糖分子的运动，分子间相互作用力减弱，导致溶液流动阻力减小，从而表现出粘度下降的现象。125图3温度对粗PDP表观粘度的影响Fig.3EffectoftemperatureonapparentviscosityofcrudePDP2.3.3pH值对粗PDP表观粘度的影响图4为pH对粗PDP表观粘度影响，从测定结果看出，当溶液处于碱性及中性时，粗PDP表观粘度几乎不受pH值影响，说明多糖具有良好的耐碱性，而当pH值为3时，粗PDP130表观粘度明显上升。图4酸碱度对粗PDP表观粘度的影响Fig.4EffectofPHonapparentviscosityofcrudePDP-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.3.4蔗糖浓度对粗PDP表观粘度的影响135图5为蔗糖浓度对粗PDP表观粘度的影响，由测定结果看出，当蔗糖浓度为2％时，粗PDP表观粘度显著上升，而蔗糖添加量高于2％后，多糖溶液表观粘度不升反而呈下降趋势。图5蔗糖对粗PDP表观粘度的影响140Fig.5EffectofSucroseonapparentviscosityofcrudePDP2.3.5盐浓度对粗PDP表观粘度的影响图6为NaCl对粗PDP表观粘度的影响，从测定结果看出，当粗PDP表观粘度NaCl溶液低于0.1M时，对多糖的表观粘度几乎没有影响，而NaCl溶液高于0.1M时，与6%粗PDP表观粘度相比较，多糖溶液的表观粘度略有上升。145图6氯化钠对粗PDP表观粘度的影响Fig.6EffectofNaClonapparentviscosityofcrudePDP-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn与NaCl相比较，CaCl2对粗PDP表观粘度的影响较为明显（图7），与6%粗PDP表观粘度比，当CaCl2溶液超过0.1M时，多糖溶液的表观粘度显著上升，在较高盐浓度+2+150的情况下，由于Na和Ca离子随溶剂扩散到多糖分子内部，与其侧基结合，屏蔽了分子内部的电荷斥力，致使粘度上升。图7氯化钙对粗PDP表观粘度的影响Fig.7EffectofCaCl2onapparentviscosityofcrudePDP1553结论采用液体深层发酵制备鼎湖鳞伞菌丝体，再用热水浸提、乙醇沉淀的方法获得粗多糖。在静态流变学性质测试中，粗PDP溶液的表观粘度随着多糖浓度的增加而上升（<6%），表现出随着剪切速率的增加而快速下降的假塑性流体性质，说明粗PDP溶液是非牛顿流体。多糖溶液的表观粘度在pH6-10的范围内很稳定，而在强酸性条件下则明显上升。添加低浓160度CaCl2，PDP粗多糖粘度变化不明显，CaCl2浓度继续增加，粗PDP粘度逐渐增大。以上结论表明粗PDP溶液具有较好的耐热、耐碱及耐盐稳定性。[参考文献](References)[1]CuiYJ,LiQZ.ImmuneeffectofPholiotanamekopolysaccharideontheagingmodelmiceinthedifferent165period[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2004,35(2):159-161.[2]LiH,LuX,ZhangS,etal.Anti-inflammatoryactivityofpolysaccharidefromPholiotanameko[J].Biochemistry(Mosc),2008,73:669-675.[3]LiH,WangS.KineticsofinhibitionofribonucleaseAbyPholiotaNamekopolysaccharide[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2007,40:134-138.170[4]LiH,ZhangM,MaG.HypolipidemiceffectofthepolysaccharidefromPholiotanameko[J].Nutrition,2010,26:556-562.[5]田恩静.中国鳞伞属[Pholiota（Fr.）Kummer]真菌分类学研究[D].吉林农业大学,2005.[6]毕志树,李泰辉,郑国杨,等.伞菌目的四个新种[J].真菌学报,1985,(3)：155-161.[7]毕志树,李泰辉.广东鳞伞属的研究初报[J].真菌学报,1989,(2)：94-97.175[8]WasserSP.MedicinalMushroomScience:History,CurrentStatus,FutureTrends,andUnsolvedProblems[J].-7- 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