黄连素激活TGR5、调节S1P2MAPK信号通路，抵抗高糖诱导的GMC中炎症纤维化成分的表达.pdf 12页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn黄连素激活TGR5、调节S1P2/MAPK信号通路，抵抗高糖诱导的GMC中炎症纤维化#成分的表达1,21111**5杨志英，熊凤霄，黄俊英，陈诚，黄河清（1.中山大学药学院，广州5100006；2.广州军区广州总医院，广州510010）摘要：目的：观察黄连素（Berberine，BBR）是否能够通过活化胆汁酸膜受体TGR5，调节10S1P2/MAPK信号通路，从而抵抗高糖诱导的GMC中FN、ICAM-1、TGF-β1等炎症纤维化成分表达升高的作用机制。方法：Westernblot检测肾小球系膜细胞中黄连素干预后TGR5及相关指标蛋白表达。结果：（1）黄连素能够明显抑制高糖培养的肾小球系膜细胞炎症粘附因子（ICAM-1）和转化生长因子（TGF-β1）的表达，细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（FN）生成明显减少。同样地，给予黄连素处理后，能抑制HG诱导的c-Jun/c-Fos磷酸化。15（2）TGR5特异性激动剂INT-777能够剂量依赖性抑制高糖引起的FN、ICAM-1以及TGF-β1上调。（3）黄连素能够抑制由高糖引起的S1P2蛋白水平的上调，而干扰TGR5后能升高S1P2蛋白表达，并且黄连素对高糖条件下S1P2的抑制作用被取消。同样的，敲低TGR5能阻断黄连素抑制高糖引起的MAPK信号通路的激活。（4）敲低TGR5阻断黄连素抑制高糖引起的FN、ICAM-1以及TGF-β1上调。结论：激活TGR5，抑制S1P2介导的MAPK信20号的激活可能是黄连素抑制高糖引起的FN、ICAM-1以及TGF-β1等炎症纤维化成分上调的分子机制之一。关键词：黄连素；TGR5；S1P2；MAPK；纤维连接蛋白FN中图分类号：R9625BerberineisresistanttoinflammatoryfibrosisinducedbyHGinGMCsthroughactivationofTGR5andregulationofS1P2/MAPKsignalingpathway1,2111YANGZhiying,XIONGFengxiao,HUANGJunying,CHENCheng,HUANG1Heqing30(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006;2.GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA,Guangzhou510006)Abstract:Objective:ToobservewhetherBerberine(BBR)couldregulatetheS1P2/MAPKsignalingpathwaybyactivatingthebileacidreceptorTGR5,thusresistingtheexpressionofinflammatoryfibrosiscomponentssuchasFN,ICAM-1andTGF-β1inhighglucose-inducedglomerularmesangial35cells(GMCs)anditsmechanism.Methods:WesternblotassaywasperformedtoinvestigatetheeffectsofBBRontheexpressionofTGR5andfibrosisrelatedfactorsinGMCsculturedinHG.Results:(1)BBRsignificantlyinhibitedtheexpressionofinflammatoryfactors(ICAM-1),andtransforminggrowthfactor(TGF-β1)andtheformationofextracellularmatrix(FN)inHG-inducedGMCs.Likewise,thetreatmentofberberinesuppressedthephosphorylationofc-Jun/c-Fos.(2)INT-777,a40TGR5-specificagonist,inhibitedhighglucose-inducedup-regulationofFN,ICAM-1andTGF-β1inadose-dependentmanner.(3)Berberinecouldinhibittheup-regulationofS1P2proteinlevelcausedbyhighglucose,andTGR5interferencecouldincreasetheproteinexpressionofS1P2,whilewetreatedtheGMCswithbothBBRandTGR5si-RNAsimultaneously,theinhibitoryeffectsofberberineonS1P2inhighglucoseconditioniscanceled.Similarly,TGR5knockdowncouldblocktheinhibition45effectsofBBRonMAPKsignalingpathwayactivationinducedbyhighglucose.(4)Knockdownof基金项目：教育部博士点基金（NO：20130171110097）作者简介：杨志英（1989-），女，硕士研究生，主要研究方向：糖尿病肾病通信联系人：黄河清（1964-），教授，博导，主要研究方向：糖尿病肾病.E-mail:huangheq@mail.sysu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnTGR5abolishedtheinhibitioneffectsofBBRonincreasedFN,ICAM-1andTGF-β1inducedbyHG.Conclusion:ActivationofTGR5andsuppressionofS1P2mediatedMAPKsignalingpathwayactivationmightbeoneofthemechanismsbywhichBBRinhibitedtheup-regulationofhighglucose-inducedFN,ICAM-1andTGF-β1andotherinflammatoryfibrosiscomponents.50Keywords:Berberine(BBR),TGR5,S1P2,MAPK,FN0引言糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并发症之一，可导致[1]肾功能障碍，可发展为终末期肾衰竭。DN成为糖尿病致死、致残的主要因素。肾脏纤维55化是DN的主要病理特征之一，肾小球系膜细胞（GMC）是肾脏的主要功能细胞。在糖尿病状态下，GMCs中纤维连接蛋白（FN）等细胞外基质的大量积聚、细胞粘附因子（ICAM-1）、转化生长因子（TGF-β1）等炎症纤维化细胞因子的合成表达，导致系膜区的扩张、促成了[2]肾脏纤维化的病理改变。TGR5是新型胆汁酸膜受体，由330个氨基酸组成，包含7个跨膜结构域，是G蛋白偶[3,4]60联受体（GPCR）家族的一员。研究显示：TGR5有明确的调节糖脂代谢及抗炎效应。激活TGR5能够促进GLP-1的分泌，引起胰岛素分泌增多，抑制胰高血糖素释放，减慢胃排[5,6]空的速度以及抑制食欲。近来研究表明：TGR5激活后能抑制肥胖和糖尿病状态下的肾[7]脏疾病，我们研究证实：激活TGR5能够抑制HG诱导的肾小球系膜细胞中炎症纤维化因子ICAM-1、TGF-β1、FN的过度生成，其机制可能与TGR5抑制Sphk-1/S1P/S1P2通路、65尤其是影响S1P2的表达与活性密切相关。提示TGR5在抑制糖尿病肾脏炎性纤维化病理进程中可能是重要的潜在靶点。黄连素（Berberine，BBR；[C20H18NO4]）是一种异喹啉生物碱，是中药黄连及黄柏中主要活性成分。研究显示黄连素具有多种药理活性，包括降低血糖，调节血压脂质和减少炎[8-10][11,12]症反应。此外黄连素还能抗氧化，改善胰岛素抵抗和血流动力学等。进一步研究显70示：黄连素能抑制SphK1-S1P信号通路的激活，进而调节MAPK通路、抑制核转录因子[13-16]AP-1的活性，减少FN等炎症纤维化成分的表达，改善糖尿病肾病。鉴于TGR5能明显抑制S1P2的表达与活性，黄连素能否通过活化TGR5，调节S1P2/MAPK信号通路，从而抵抗高糖诱导的GMC中FN、ICAM-1、TGF-β1等炎症纤维化成分表达升高？有待研究。751材料和方法1.1试剂和抗体黄连素购于南京泽朗生物有限公司，INT-777购于DaltonPharmaServices(Toronto,Canada)，DMEM购于LifeTechnologies(Gibico,Carlsbad,CA,USA)，抗体FN(catalogue:sc-18825)，ICAM-1(catalogue:sc-1511)，TGR5(catalogue:sc-98888)和S1P2(catalogue:80sc-31577)购于SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,USA)，TGF-β1(catalogue:3709s)，p-c-Junser63(catalogue:#2361P)，p-c-Junser73(catalogue:#3270P)，p-c-Fosser32(catalogue:#5348S)，c-Jun(catalogue:#9165S)，c-Fos(catalogue:#2250S)购于CellSignalingTechnology(Danvers,USA)，α-tubulin(catalogue:sc-18825)购于Sigma–AldrichCo.(St.Louis,USA)。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2细胞培养[18]85大鼠肾小球系膜细胞按照文献方法获得，培养于含青链霉素的10%FBS的DMEM培养基中，置于37℃含5%CO2孵箱中培养10-15天后传代。取6-12代细胞进行试验。GMCs生长至80%汇合，给予无血清培养基处理14-16h后给予30mMHG的同时加入INT-777（10μM），继续培养至进行后续实验。1.3质粒，si-RNA以及瞬时转染90TGR5过表达质粒购自OriGeneTechnologies(OriGene，USA)，pAP-1-Luc(Beyotime)，pRL-TK(Promega)，转染按照LipofectamineTMLTX&PlusReagent(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)试剂盒说明书进行。TGR5小分子干扰序列购自上海吉玛有限公司（吉玛，中国），转染按照LipofectamineTMRNAiMAXreagent(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)试剂盒说明书进行。951.4Westernblotassay肾小球系膜细胞经处理后用预冷的PBS轻轻洗2遍，吸尽残余PBS，每皿（以30mm培养皿为例）加入细胞裂解液RIPA60ul，用细胞刮将细胞轻轻刮下，转移到1.5mLEP管中，冰上裂解30min。4℃离心，12000g，离心15分钟收集上清。BCA（Pierce,USA）法蛋白定量。收集的蛋白上清液分装后采用8-12%SDS-PAGE胶进行电泳，电转后使用5%100脱脂牛奶室温封闭1h，然后进行一抗4℃孵育过夜。用相应的二抗室温孵育1h。增强型化学发光液（莱德尔试剂有限公司）孵育2min后，应用GEImageQuantLAS4000mini(GEHealthcare,Waukesha,USA)曝光显影。获取的图像采用Quantityone进行灰度分析。2结果2.1黄连素对高糖诱导的GMC中FN、ICAM-1及TGF-β1的影响105在30mM高糖刺激下，GMC中炎症因子（ICAM-1）和转化生长因子（TGF-β1）的表达明显升高，细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（FN）生成明显增多。给予黄连素预处理2h，再在高糖条件下处理24h后，与高糖组相比，黄连素组能剂量依赖性下调FN、ICAM-1、TGF-β1的蛋白水平。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn110图1黄连素对高糖诱导的GMCs中FN、ICAM-1及TGF-β1蛋白表达的影响A：BBR对FN蛋白表达的影响；B：BBR对ICAM-1蛋白表达的影响；C：BBR对TGF-β1蛋白表达的影#*响（与NG组相比，P<0.05；与HG组相比，P<0.05）Fig.1EffectsofberberineonexpressionofFN,ICAM-1andTGF-β1proteininGMCsinducedbyhighglucoseA:TheeffectsofBBRonexpressionofFN;B:TheeffectsofBBRonexpressionofICAM-1;C:Theeffectsof#*115BBRonexpressionofTGF-β1(P<0.05vs.NG;P<0.05vs.HG)2.2黄连素能明显抑制高糖诱导的AP-1的活性转录因子AP-1可以被HG、氧化应激、血管紧张素II、低密度脂蛋白（LDL）和氧化[17,18]LDL这些非常重要的诱导DN的刺激因素激活。AP-1转录因子主要是由Fos家族（c-Fos，120FosB，Fra-1andFra-2）和Jun家族（c-Jun，JunBandJunD）成员形成的二聚体，最为常见[19]的AP-1复合物是由c-Jun和c-Fos蛋白组成。在正常糖条件下给予黄连素处理2h，再在高糖条件下干预45min后，与高糖组相比，黄连素能够明显降低其由高糖引起的p-c-Junser63/73以及p-c-Fosser32蛋白水平的上调。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn125图2黄连素能明显抑制高糖诱导的AP-1的活性#A：c-Fos(ser32)和c-Jun(ser73)磷酸化水平；B：c-Jun(ser63)磷酸化水平（与NG组相比，P<0.05；与*HG组相比，P<0.05）Fig.2BerberinesignificantlyinhibitedtheactivityofAP-1inducedbyhighglucose#A:Thephosphorylationofc-Fos(ser32)andc-Jun(ser73);B:Thephosphorylationofc-Jun(ser63)(P<0.05vs.*130NG;P<0.05vs.HG)2.3黄连素对胆汁酸膜受体TGR5蛋白水平的影响在高糖培养的GMC中，TGR5的蛋白表达呈现时间依赖性降低，而黄连素能剂量依赖性升高由高糖引起的TGR5蛋白水平的减少。作为阳性对照，在高糖条件下，我们给予了TGR5135特异性激动剂INT-777，结果显示，与高糖组相比，INT-777能够明显抑制高糖培养的肾小球系膜细胞FN、ICAM-1、TGF-β1的表达。因此，黄连素可能属于TGR5非特异性激动剂的一种。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图3黄连素对胆汁酸膜受体TGR5蛋白水平的影响140A：HG条件下TGR5蛋白表达变化；B：BBR对TGR5蛋白表达的影响；C：INT-777对FN和TGF-β1蛋#*白表达的影响；D：INT-777对ICAM-1蛋白表达的影响（与NG组相比，P<0.05；与HG组相比，P<0.05）Fig.3EffectsofberberineontheproteinlevelofbileacidreceptorTGR5A:TGR5proteinexpressionunderHGconditions;B:TheeffectsofBBRonexpressionofTGR5;C:Theeffects#ofINT-777onexpressionofFNandTGF-β1;D:TheeffectsofINT-777onexpressionofICAM-1(P<0.05vs.*145NG;P<0.05vs.HG)2.4干扰TGR5对高糖条件下黄连素抑制S1P2受体的影响根据我们前期研究结果，黄连素能够抑制由高糖引起的肾小球系膜细胞S1P2蛋白水平的升高，并且我们实验结果也证实了这一点fig4A。那么在黄连素调控S1P2，减缓糖尿病肾150纤维化过程中TGR5是否起到了积极的作用？结果显示，TGR5激动剂INT-777能明显下调S1P2蛋白水平fig4B，而使用小分子RNA干扰TGR5的表达后，S1P2蛋白水平明显升高，并且给予黄连素后S1P2蛋白表达并未受到明显抑制fig4C。说明黄连素抑制S1P2的表达可能是通过激活TGR5实现的。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn155图4干扰TGR5对高糖条件下黄连素抑制S1P2受体的影响A：BBR对S1P2蛋白的影响；B：INT-777对S1P2蛋白的影响；C：干扰TGR5能增加S1P2蛋白表达，#*而且能阻断高糖条件下BBR诱导的S1P2蛋白下调（与NG组相比，P<0.05；与HG组相比，P<0.05；&与HG+BBR组相比，P<0.05）Fig.4EffectsofinterferingwithTGR5ontheinhibitionofS1P2receptorbyberberineunderhighglucose160conditionsA:TheeffectsofBBRonexpressionofS1P2;B:TheeffectsofINT-777onexpressionofS1P2;C:si-TGR5increasedtheexpressionofS1P2andblockedtheberberine-induceddownregulationofS1P2underhighglucose#*&conditionsinGMCs(P<0.05vs.NG;P<0.05vs.HG;P<0.05vs.HG+BBR)2.5干扰TGR5对高糖条件下黄连素抑制MAPK信号通路的影响165同样的，我们前期研究也证实了，MAPK信号通路的激活促进了DN病理进程，在这个过程中，S1P2起到了关键的介导作用，而黄连素能够抑制高糖培养的肾小球系膜细胞[15]MAPK信号的激活，包括p-p38和p-ERK蛋白水平降低，p-JNK则不受影响。本实验结-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn果显示，干扰TGR5后p-p38和p-ERK蛋白水平明显升高，给予黄连素处理后升高的p-p38和p-ERK蛋白表达同样未受到抑制。因此，TGR5在黄连素调控S1P2介导的MAPK信号170通路过程中可能发挥了十分关键的作用。图5干扰TGR5对高糖条件下黄连素抑制MAPK信号通路的影响#A：干扰TGR5对p38磷酸化的影响；B：干扰TGR5对ERK和JNK磷酸化的影响（与NG组相比，P<0.05；*&与HG组相比，P<0.05；与HG+BBR组相比，P<0.05）175EffectsofinterferingwithTGR5oninhibitionofMAPKsignalingpathwaybyberberineunderhighglucoseconditionsA:EffectsofinterferingwithTGR5onthephosphorylationofp38;B:EffectsofinterferingwithTGR5onthe#*&phosphorylationofERKandJNK(P<0.05vs.NG;P<0.05vs.HG;P<0.05vs.HG+BBR)1802.6敲低TGR5能明显阻断黄连素抑制高糖条件下GMCs中FN、ICAM-1、TGF-β1的作用根据我们上述实验结果，黄连素能够明显抑制由高糖引起的FN、ICAM-1、TGF-β1表达上调，同时TGR5蛋白水平有明显升高。因此，为了探讨黄连素调控FN、ICAM-1、TGF-β1的分子机制，我们进一步对TGR5进行了小分子RNA干扰，在高糖条件下再给予黄连素干185预。结果显示，黄连素抑制由高糖引起的FN、ICAM-1、TGF-β1表达上调这种作用即被取消。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图6敲低TGR5能明显阻断黄连素抑制高糖条件下GMCs中FN、ICAM-1、TGF-β1的作用*A：TGR5和FN的蛋白表达；B：ICAM-1和TGF-β1的蛋白表达（与HG组相比，P<0.05）190Fig.6KnockdownofTGR5cansignificantlyblocktheinhibitioneffectsofberberineonFN,ICAM-1andTGF-β1inGMCsunderhighglucoseconditions*A:TheexpressionofTGR5andFN;B:TheexpressionofICAM-1andTGF-β1(P<0.05vs.HG)3讨论胆酸是胆固醇代谢的最终产物，人体内有两种主要的胆酸，CA和CDCA。近来研究表195明，胆汁酸不仅可以助消化，还可以作为体内的信号分子，与体内胆固醇水平、脂类和糖类的代谢，以及炎症免疫反应的调控有密切的关系。TGR5是胆酸在细胞膜上的受体，属于G蛋白偶联受体家族，在胆汁酸调控这些行为的过程中，TGR5发挥了及其关键的作用。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是近十年来备受关注、由肠道L细胞产生的具有促进胰岛素分泌、[20,21]保护胰岛β细胞、减轻体重等生理活性的物质。研究显示：TGR5激活后不仅可以激活200肠道内分泌细胞GLP-1的分泌，促进胰岛素分泌；还可调控外周组织如骨骼肌、脂肪中能[22-24]量代谢相关基因表达，增加能量消耗，改善胰岛素抵抗，调节糖脂代谢，抑制炎症反应。提示活化TGR5在调节糖尿病糖脂代谢及抗炎方面具有明确的作用。另有研究显示：TGR5[24]能够通过减少巨噬细胞炎症反应和脂质吞噬而预防动脉粥样硬化。最新研究发现，TGR5激活后能够诱导线粒体增值，减少肾脏氧化应激以及脂质堆积，显示TGR5在抑制肥胖和糖[7]205尿病状态下的肾脏疾病过程中起到关键作用。上述研究证实了TGR5在调节糖脂代谢、抑制炎症反应、改善肾脏疾病等方面的具有重要的作用。我们前期研究证实：活化TGR5能够明显抑制HG诱导的GMCs炎症因子（ICAM-1）和转化生长因子（TGF-β1）的表达，细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（FN）生成明显减-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn少。进一步结果显示，激活TGR5能够抑制高糖诱导的S1P2表达增多，下调核因子AP-1210二聚体中c-Jun/c-Fos的磷酸化水平，降低AP-1的转录活性。同为G蛋白偶联受体家族成员，TGR5与S1P2存在相互作用，并且TGR5激活后能够促进S1P2内化失活。提示TGR5在抑制糖尿病肾脏炎性纤维化病理进程中可能是一重要的潜在作用靶点。黄连素在实验性DN的研究中显示了较好的改善肾损伤、保护肾功能的作用，其相关作用与黄连素调节糖脂代谢，抗氧化应激、抗炎、抑制NFk-B、RhoA/ROCK与SphK1-S1P信[25,26]215号通路的激活密切相关。然其具体的分子机制尚未完全明确。本实验主要观察了黄连素是否能够通过活化胆汁酸膜受体TGR5，从而抑制高糖引起的肾小球系膜细胞纤维连接蛋白FN的表达，改善由高糖引起的肾小球系膜细胞纤维化的发生。结果显示，在高糖条件下，黄连素在不同浓度下均能抑制细胞外基质主要成分FN的表达，炎症因子ICAM-1以及生长因子TGF-β1表达也相应下调，且呈现剂量依赖性。还能降低p-c-Junser63/73以及p-c-Fos220ser32蛋白水平。黄连素能够升高由高糖引起的TGR5蛋白水平的下调，激活TGR5能够明显抑制高糖培养的GMC中FN、ICAM-1、TGF-β1的表达。提示黄连素能够通过活化高糖状态下GMC中胆汁酸膜受体TGR5，抑制核因子AP-1二聚体中c-Jun/c-Fos的磷酸化水平，从而降低其活性，抑制FN、ICAM-1、TGF-β1等炎性纤维化成分的表达增加，以改善由高糖引起的肾小球系膜细胞纤维化的发生。225在糖尿病状态下，肾组织中S1P2受体表达明显上调。S1P2受体介导高糖状态下S1P诱导的系膜细胞细胞外基质主要成分FN的表达增加，该作用可能与S1P-S1P2受体激活MAPK（主要是ERK1/2和p38MAPK）信号通路密切相关。鉴于TGR5与S1P2存在着相互作用的密切关系，黄连素激活TGR5后，是否进而影响S1P2/MAPK通路、调节炎性纤维化成分的表达？我们进行了相关观察，结果显示：黄连素激活TGR5能够抑制高糖引起的GMC230中S1P2的表达升高，而干扰TGR5后黄连素抑制由高糖引起的S1P2蛋白表达上调的作用被取消；同时干扰TGR5后S1P2下游的MAPK（p-p38和p-ERK蛋白）水平明显升高，给予黄连素处理后升高的p-p38和p-ERK蛋白表达同样未受到抑制，与单一的高糖条件下黄连素抑制S1P2-MAPK信号形成鲜明的对比。同时，黄连素能使高糖引起的FN、ICAM-1、TGF-β1的表达明显降低；而在干扰TGR5后，黄连素降低FN、ICAM-1、TGF-β1蛋白水平235的作用被抑制。提示TGR5在黄连素调控S1P2介导的MAPK信号通路激活、进而影响GMCs中炎性纤维化成分表达增加的过程中可能发挥了十分关键的作用。4结论综上，本研究从高糖培养的肾小球系膜细胞初步证实黄连素通过促进TGR5的表达，抑制S1P2介导的MAPK信号的激活，降低高糖诱导的GMC中的核因子AP-1二聚体中240c-Jun/c-Fos的磷酸化水平，改善FN、ICAM-1以及TGF-β1等炎性纤维化成分的生成表达。活化TGR5可能是黄连素抑制糖尿病肾脏纤维化、抗DN的重要分子机制之一，值得进一步深入研究。245-10- 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