DB13T 1115-2009 食品中军团菌的测定.pdf 4页

'ICS67.100X16DB13、竺T冫pi北省地方标准DB13/T1115-2009食品中军团菌的测定DeterminationofLegionellabacteriainfood2009-05-27发布2009-06-11实施河d匕省质量技术监督局发布 DB13/T1115-2009月ij吕本标准参照工SO11731-1998《军团菌的检测方法（英文版）》制定。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：河北省食品安全重点实验室、河北省食品质量监督检验研究院。本标准主要起草人：周正、张岩、周巍、刘辰魁、康素芬、刘东、穆燕魁。 DB13/T1115-2009食品中军团菌的检测方法范围本标准规定了食品中军团菌的检验方法。该方法适用于饮用水中军团菌的检验。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1军团菌Legionella杆形菌，宽度0.3-0.9林m，长度为2-20¦Ìm以上，不形成内孢子或小囊，无英膜，不产酸，革兰氏染色阴性，借一两根或以上直的或弯曲的极鞭毛和侧鞭毛可以运动，偶尔可见无动力菌株。需氧，生长时需L一半胱氨酸和铁盐。氧化酶阴性或弱阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，液化明胶。细胞壁中有支链脂肪酸。可从有机化合物中摄取营养，可利用氨基酸作为能量来源。不发酵碳水化合物，亦不能使之氧化。可从地表水、泥土和热水及污染的湖水和河水中分离到本菌，但从土壤和动物中分离尚不了解，对人有致病性，DNA的G+Cmol％含量为39-43%(TmBd)¡ã3试剂3.1缓冲木炭酵母膏琼脂培养基（BCYE)3.2无L一半胱氨酸缓冲木炭酵母膏培养基（BCYE-Cys)3.3选择性缓冲木炭酵母膏培养基（GVPC)¡ã4仪器4.1恒温培养箱：36℃士1¡ãCo4.2天平：感量0.1g04.3无菌吸头。4.4无菌试管。4.5无菌锥形瓶。5操作步骤5.1总则：如果液体样品军团菌的数量估计超过105，可以采用直接平板法。为了确保低于这个数量样品中军团菌的检测，需采用浓缩技术。为了浓缩水样，可采用膜过滤法（(5.2)或离心法（(5.3)¡ã5.2膜过滤法：如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心法。采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47^-147mm，孔径0.22¦Ìm和0.45¦Ìm的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加5mL-25mL的无菌稀释液或无菌去离子水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中2^-10min. DB13/T1115-20095.3离心法：取200mL样品于300mL-500mL容积的离心瓶中，6000g离心10min或3000g离心30min，保持温度在巧℃一25¡ãC，弃去上清液，将沉淀物悬浮在2mL-20mL无菌稀释液或无菌去离子水中。5.4培养5.4.1将制备好的样品（浓缩的或未浓缩的）分成3份，1份不做任何处理；1份进行热处理；1份进行酸处理。5.4.2热处理：加1mL士0.5mL样品于一无菌容器中，50℃士1℃水浴处理30min士2mina5.4.3酸处理：加1mL-10mL样品于一拧盖的容器中，6000g离心10min或3000g离心30min，用无菌枪头吸去一半体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物，用酸处理缓冲液补足原始体积。混合静置5min士0.5min.5.4.4选择性培养基的接种：分别接种未处理、热处理和酸处理的样品0.1mL-0.5ml于GVPC培养基上，热处理和酸处理的样品应在处理完立即接种，记录接种体积。5.4.5培养：翻转平板，36℃士1℃培养10d.5.4.6检查平板在10d的培养期间，用显微镜在2d-4d内至少观察3次（军团菌生长较慢，很可能被其他菌掩盖），记录每一种菌落形态的数量。可疑军团菌的确证从每个GVPC平板上至少选择3个可疑军团菌菌落接种到BCYE和BCYE-Cys两块平板上进行二次培养，36℃士1℃培养至少2d。在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的被认为是军团菌。通过血清学实验确证在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的菌落。注：血琼脂和营养琼脂可以代替BCYE-Cys培养基'