DB13T 1113-2009 食品中总抗生素残留的快速测定 微生物抑制法.pdf 6页

'ICS67.100X16DB13J卜、竺，甲丬r﹄冫pi省地方标准DB13/T1113-2009食品中总抗生素残留的快速测定微生物抑制法ExaminationofResidueofantibioticsinfood―MIAmethod2009-05-27发布2009-06-11实施河d匕省质量技术监督局发布 DB13/T1113-2009月Ij吕本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：河北省食品安全重点实验室、河北医科大学基础医学院、河北师范大学生命科学学院。本标准主要起草人：吕品、周巍、张岩、周正、李挥、穆燕魁、刘敬泽、杨小龙、赵宝华。 DB13/T1113-2009食品中抗生素残留的检测方法范围本标准规定了食品中抗生素残留的检验方法。本标准第一法适用于肉、蛋和饲料中总抗生素残留的检测；本标准第二法适用于乳和乳制品中总抗生素残留的检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB厅4789.27食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验。第一法肉、饲料和蛋中抗生素残留的检测方法原理抗生素残留检验试剂盒的原理是基于抑制微生物生长。试剂盒是以96孔板的形式来设计，每个小孔里面都含有均匀扩散了芽孢杆菌抱子的琼脂培养基，同时还含有氧化还原指示剂。当试剂孔在65¡ãC培养时，孢子开始被激活，并且生长繁殖，细胞的生长改变了培养基里面的氧化还原潜力，使琼脂的颜色从蓝色变成橘红色（橙色）。如果样品内的抗生素浓度超过了试剂盒的检测限，则孢子就不会被激活，细菌就不会生长繁殖，琼脂的颜色不会改变。试剂4.1检测板。4.2抗生素残留检测试剂盒。4.3粘胶纸。4.4PBST:45gNaCl,80mL的磷酸氢二钾溶液（0.5M),16.7mL的磷酸二氢钾溶液（0.5M),5mL吐温20，调节PH到7.40仪器只I刂O恒温培养箱：65¡ãC士1¡ãCo－J匕q天平：感量0.1go‘U︺浦无菌吸头。只，刂只无菌试管。二︺口凡无菌锥形瓶。只O︺r二了离心机。刂．仄O均质器。︺U磁力搅拌器。 DB13/T1113-2009酶标仪。操作步骤6.1样品的前处理6.1.1鲜肉样品取3g士0.5g没有脂肪或者其他组织的一片瘦肉样品，剪成小碎片；把瘦肉样品放入玻璃杯或者直径1.5cm的耐热塑料管中，密封；在100℃的水浴中加热3min士0.5min；把试管浸在冷水中降温；用镊子来压榨尽可能多的肉汁，丢掉肉，留下肉汁；把肉汁在2000r/min下离心3min，取上清液待测。6.1.2肝脏切取5g士0.5g肾带皮和髓汁在内；把样品放入玻璃杯或者直径1.5cm的耐热塑料管中，密封；在100℃的水浴中加热4min士0.5min；把试管浸在冷水中降温;2000r/min下离心3min，取上清液待测。6.1.3饲料称取1g士0.01g均匀的饲料样品，放入清洁的试管密封；加20mL的预热后PBST（约40¡ãC);均质混合样品液30min，使用磁力搅拌器直到样品全部溶解；2000r/min下离心15min，取上清液待测。6.1.4蛋样品把蛋黄和蛋白都放进清洁的容器，然后拍打得到均匀的液体，不能有块状；用蒸馏水按1:4的比例将样品稀释成均匀的液体（(1mL样品＋+3mL水），装在玻璃杯或者是直径1.5cm的耐热塑料管中，密封；在100℃的水浴中加热样品12min士0.5min；用力搅拌样品20s-30s避免样品凝结成块状，在室温冷却样品，待测。6.2检测过程：先用刀切开所需要检测的小孔，从底部用力把切好的小孔顶出微孔板架。把带检测的试剂条上的铝薄纸撕去，每个小孔加100¦ÌL的样品，同时做一个阴性对照样（加100林L的阴性控制样）。用粘胶纸把加好样的小孔密封好，放入65℃的恒温器中培养30min，使样品充分均匀扩散开来。倒空扩散后的样品液，用蒸馏水冲洗样品孔，如果使用微量加样枪时每个孔需要加300¦ÌL，如果使用冲洗瓶则充满整个小孔。倒空所有的蒸馏水，并且在吸水纸上面吸去多余的水。重复冲洗3-4次后，用粘胶纸密封检测孔，在65℃的恒温器中培养，直到阴性控制样孔变成橙色（橘黄色），培养3h-3.5h，取出使用酶标仪分别在590nm和650nm读数。结果判定当阴性控制样的读数差值（ANssonm-AN650nm)在0.15^0.25之间时。样品的结果如果大于阴性样品读数差值加0.15的和时为判断为阳性，即：阳性：AM59onm-AM650nm%AN5sonm-AN65o.+0.150(AM:样品的吸光度值；AN：阴性控制样品的吸光度值。）当于阴性控制样品的吸光度值超出0.15-0.25的范围，检测结果通过肉眼来判读。样品管橙色为阳性，蓝色为阴性。本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素G5¦Ìg/kg，阿莫西林8¦Ìg/kg，泰乐菌素80jg/kg，新霉素300gg/kg.第二法牛奶和乳制品中抗生素残留的检测方法原理 DB13/T1113-2009试剂盒是一种微孔板，每个微孔中含有散播了芽孢杆菌的琼脂培养基和pH指示剂。当在65℃下培养微孔板时，抱子发育生长，进而降低了培养基的pH值，在pH指示剂的作用下，原来的蓝（紫）色将会变为绿一黄色。如果牛奶中的抗生素浓度高于试剂盒的检测限，微生物的生长和酸的生产将会受到抑制，由于没有酸生成，颜色将不会改变。试剂01︺八检测板。0丿甘10抗生素残留检测试剂盒。八口J0．粘胶纸。月口…呼水。10仪器10.1恒温培养箱：65℃士1¡ãC¡ã10.2天平：感量0.1g010.3无菌吸头。10.4无菌试管。10.5无菌锥形瓶。11样品处理液体样品直接进样测试。固体样品使用无菌水稀释成1:10的稀释液后进样测试。12操作步骤确定所需微孔数量，用介刀沿微孔外侧划开金属薄膜。注意不要剪开剩余的微孔板上的金属薄膜，因为这会使微孔挥发以致干结。从塑料框上取下已剪开的微孔条。只需简单地用指尖向上压微孔条，微孔条即可分离出来。将要使用的微孔板（条）安放到空的白色塑料架上，剥开微孔上的胶粘金属膜，在每个微孔中加入50¦ÌL样品。用胶粘纸小心地密封微孔板（条），将其放入到已经预热到65℃的水浴或培养器中，培养2h-2.5h，从微孔侧面观察结果。13结果判定最终观察时，培养基依然保持原有的蓝紫色，可以报告为抗生素残留阳性。培养及变为黄色或黄绿色时，可以报告为抗生素残留阴性。本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素G3林g/kg，阿莫西林4林g/kg，泰乐菌素80¦Ìg/kg，四环素100卩g/kg,磺胺嘧啶100¦Ìg/kg. '