GBT28063-2011菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法.pdf 12页

'ICS65．020．01B16园亘中华人民共和国国家标准GB／T28063--201菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofbeanpodmottlevirus201I-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鳃紫瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会况111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T28063--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TCZ71)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、郑耘、陈青、林石明、陈红运、黄蓬英、吴嫒。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法GB／T28063--2011本标准规定了菜豆荚斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定，也适用于传播该病毒介体昆虫的检测鉴定。2菜豆荚斑驳病毒基本信息中文名：菜豆荚斑驳病毒。英文名：beanpodmottlevirus。异名：beanpodmottlecomovirus(菜豆荚斑驳病毒)，podmottlevirus(荚斑驳病毒)，desmodiumvirus(金钱草病毒)。英文缩写：BPMV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae、豇豆花叶病毒属Comovirus。菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A。3方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS_ELIsA)、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)进行检测鉴定。4主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量：0．001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器(1000pL、200pL、100pL、20pL、2PL)。5检测样品的制备5．1DAS—ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备对每批送检样品进行症状检查，优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种脐开始)，或者选取具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片。种子样品：称取0．5g～1．0g的种皮作为检测样品，在液氮中充分研磨，回温后按1：10比例加人样品提取缓冲液继续研磨。叶片样品：称取0．5g～1_0g的叶片作为检测样品，在研钵中研磨或在液氮中研磨，按1：10比例加人样品提取缓冲液继续研磨。把研磨后的样品转移到5mL离心管中，8000r／min离心5min，上清液作为DAS-ELISA(见附录B)和IC-RT-PGR(见附录C)检测提取液。注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃中。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28063--20”5．2RT-PCR检测样品的制备称取表现症状的0．1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后，利用TRIzol方法提取RNA。(见附录D中的D．3)6检测与鉴定6．1检测鉴定流程通常，初筛时采用DAS-ELISA检测方法。当DAS-ELISA产生阳性结果时，再采用IC-RT-PCR或RT-PCR等方法进行验证。当首先采用IC-RT—PCR或RT—PCR方法检测时，如果产生阳性结果，则通过实时荧光RT-PCR方法或序列测定等方法验证。6．2DAS-ELISA检测把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的在96微孔板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如：种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一致。具体操作过程见附录B。6．3RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。6．4IC-RT-PCR检测把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的离心管中，然后进行RT-PCR扩增。用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录C。6．5序列测定将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列翻译成氨基酸后与已知的BPMV相应序列进行比对，如果与已知的BPMV相应序列同源性大于75％则判定为BPMV序列，同源性小于75％则判定为非BPMV序列。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／7结果判定与报告7．1结果判定当产生以下检测结果时，则判定为检出BPMV：——当DAS-ELISA检测、IC-RT-PCR(或RT-PCR)检测、其中两种方法的检测结果呈阳性时，则判定为检出BPMV；2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28063--2011——当IC-RT-PCR或RT—PCR检测结果呈阳性，测定的序列为BPMV序列时，则判定为检出BPMV。7．2结果记录与保存记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。DAS-ELISA检测结果保存吸光值的数据报告，IC—RT-PCR或RT-PCR检测结果保存电泳照片，序列测定结果保存测序报告图。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28063--201A．1分布地区北美洲：美国、加拿大。南美洲：巴西、厄瓜多尔、秘鲁。亚洲：伊朗。A．2形态特征附录A(资料性附录)菜豆荚斑驳病毒简介病毒粒子形态为等轴对称二十面体，无包膜，直径为28nm。A．3寄主范围及症状BPMV的寄主局限于豆科植物，主要是大豆(GlycinemⅡz)和菜豆(Phaseolusspp．)，山蚂蟥(Desmodiumpaniculatum)是其多年生寄主。在鉴别寄主植物上的症状：大豆(Glycinemax)：表现为严重的系统症状，叶片斑驳、皱缩、荚和种子斑驳，甚至坏死、植株死亡。该病毒还能延迟大豆茎杆成熟，引起“绿茎”现象。在种子上产生褐色、黑色的斑驳症状，症状从种脐开始，因而称为“种脐渗色”。菜豆(Phaseolusvulgaris)Tendergreen品种：起初出现褪绿斑，后发展为严重的系统褪绿，叶片畸形，豆荚严重斑驳、深绿色、豆荚变短、畸形、扭曲、变得粗糙有疣状突起。菜豆(P．vulgaris)Pinto品种：无系统症状，接种后约3d～4d出现散生的红色局部枯斑，接种叶有时叶脉坏死。菜豆(P．vulgaris)Bountiful品种：无系统症状，接种后约3d～4d出现大的淡黄色局部病斑。A．4传播途径BPMV可以通过昆虫介体传播，主要是大豆叶甲(Cerotomatrifurcata)，而玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)、带斑黄瓜叶甲(D．balteata)、点斑黄瓜叶甲(D．undecimpunctatahowardii)、葡萄甲虫(Co—laspisflavida)、甲虫(C．1ata)、曲条豆芫菁(Epicautavittata)、墨西哥叶甲(Epilachnavarivestis)和大豆潜叶虫(Odontotahorni[Xenochalepushorni])也是该病毒的传播介体。该病毒另外还可以机械传播，嫁接传播，以及通过种子进行远距离传播。从感染BPMV植株上收获的种子，其种传率为0．10％，种传率相对较低。与大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)一起感染，种传率可以达到39％。A．5血清学特性BPMV具有很强的免疫原性，制备的多克隆抗体可以检测大豆叶片、种子、草本寄主植物和介体昆虫中的病毒。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．6分子生物学特性GB／T28063--201BPMV是正链RNA病毒，其基因组由两条正链RNA一1(约3．6kb)；f11RNA一2(约6．0kb)tJt成，分别包裹在两个直径为28nm的等轴多面体粒体中。RNA一1编码5个复制所需的蛋白，RNA-2编码一个推导的细胞间运动蛋白和两个外壳蛋白。A．7豇豆花叶病毒属种间区分依据A．7．1大外壳蛋白(Largecoatprotein，LCP)的氨基酸序列同源性小于75％。A．7．2聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75％。A．7．3在可能的成分间没有假重组。A．7．4抗原反应有差异。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28063--2011B．1DAS-ELISA所采用的试剂B．1．1包被缓冲液(pH9．6)附录B(规范性附录)DAS-ELISA检测操作步骤碳酸钠(NazCO。)1．59g碳酸氢钠(NaHCOs)2．93g叠氮化钠(NaNa)0．20g加入900mL蒸馏水溶解，用HCl调节pH值到9．6，然后加水至1L。B．1．2磷酸盐缓冲液(PBS，pH-／．4)氯化钠(Nacl)磷酸二氢钾(KH：PO。)磷酸氢二钠(Na：HPO。)氯化钾(KCl)叠氮化钠(NaN。)加入900mL蒸馏水溶解，8．0g0．2g1．15g0．2g0．2g用NaOH或HCl调节pH值到7．4，然后加水至1L。每升PBS中加入0．5mL的Tween-20。B．1．4样品提取缓冲液(pH7．4)PBST+2％PVP(PVP一40聚乙烯基吡咯烷酮)。B．1．5酶标抗体稀释缓冲液PBST+2％PVP+0．2％卵白蛋白。B．1．6底物缓冲液二乙醇胺97mL蒸馏水600mL叠氮化钠(NaN。)0．2g用HCl调整pH至9．8，然后加H。O到1L。注：缓冲液可以储存在4℃～lo℃中至少2个月，使用前回温至室温。B．1．7抗体BPMV包被抗体、碱性磷酸酶标记的BPMV抗体。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载B．2操作步骤GB／T28063--2011B．2．1包被根据检测试剂盒说明，用包被缓冲液稀释BPMV抗体(如1：200)，在微孔板中每孔加入100止包被抗体溶液。在室温下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。B．2．2捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次孔(可在洗板机上完成)。加入100“L检测样品提取液到酶标板的孔中，每个样品至少两个孔。并设置阳性和阴性对照。在室温下孵育2h或4℃下过夜。B．2．3加入酶标抗体根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1：200)。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100“L酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。B．2．4加底物用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(p-NitrophenylPhosphate，pNPP)配制成1mg／mL的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加人100“L新鲜配制的底物溶液。室温下避光放置(约30min～60min)，至阳性对照孔明显显色。B．2．5吸光值的测定用酶标仪在405nm处读取吸光值。18．2．6结果判定通过酶标仪上405nm的OD值来判定。对照孔的0n。。值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD。。；值2，判为阳性；——样品OD。值／阴性对照OD。值明显<2，判为阴性；——样品on。。值／阴性对照On。；值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T2Bfl63--2011C．1主要试剂附录C(规范性附录)IC-RT-PCR检测操作步骤BPMV抗体、包被缓冲液和PBST试剂见B．1；RT—PCR试剂见D．1。C．2包被抗体根据检测试剂说明，将包被抗体用包被缓冲液稀释(如1：200)，取50pL～100pL稀释好的包被溶液于0．6mL的离心管中。25℃中放置3h或4℃冰箱中过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次～5次，去除残留溶液。C．3抗原捕捉向每个已包被抗体的离心管中加入检测样品上清液100pL，25℃下放置2h--3h或4℃冰箱中放置过夜；加入PBST缓冲液洗涤3次～5次，双蒸水洗涤1次，去除残留溶液。注：如果是用于验证DAS-ELISA的检测结果，可直接使用血清学检测样品的剩余提取液。C．4cDNA合成在上述离心管中加入1pL的BPM4引物(10／tmol／L)、37．5pL的ddH20(经DEPC处理)，于95℃的水浴中处理7min，然后迅速冰浴5min；继续加入5×RT缓冲液10“L、10mmol／L的dNTP混合物0．5PL、M-MLV反转录酵0．5pL、RNaseInhibitor0．5PL；然后37℃水浴1h，95℃水浴10min，冷却后作为PCR扩增模板。C．5PCR扩增在25pL的反应体系中：2．5pL的10×PCRbuffer(含20mmol／L的Mg”)，dNTP(每种各10mmol／L)0．5pL，TaqDNA聚合酶(2．5U／pL)0．5pL，BPM3和BPM4引物(10／_￡mol／L)各1．0pL(引物见表D．1)，加入上述DNA模板10PL，ddHzO补足体积。与D．5反应程序相同，反应完成后，取5pL扩增产物在1．5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后用EB染色，在凝胶成像系统上观察。C．6结果判定阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小(约228bp)的条带情况下——如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性；——如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。 D．1主要试剂附录D(规范性附录)RT-PCR检测操作步骤GB／T28063--2011D．1．1RNA提取试剂TRIzolreagent、三氯甲烷、异丙醇、70％乙醇。D．1．2反转录试剂M-MLV反转录酶(200u／“L)、5×反应缓冲液(250mmol／LTris—HClpH8．325℃、375mmol／LKCI、15mmoI／LMgCl2、50mmol／LDTT)、dNTP混合液(各10mmol／L)、RNaseInhibitor(40U／／zL)。D．1．3PCR试剂10×PCR缓冲液(含15mmol／L的M92+)、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液(各10retool／L)。D．2引物序列本方法的特异性引物序列见表D．1。其中BPM3为正向引物，BPM4为反向引物，扩增区域在大外壳蛋白基因上，扩增大小为228bp。引物由生物公司合成与纯化。表D．1所使用的引物序列引物名称引物序列在NC一003495‘上的位置BPM35，一CATAGCATTTGGAAATTTGGCT(}3’2587～2609BPM45，一TCACCTGGTATTGTRGACAC-3¨2795～2814注：也可以采用根据BPMV基因组序列合成的其他特异性引物。‘在GenBank上的基因序列登录号。‘序列中的R=G或A。D．3总RNA的提取取0．05g～o．1g样品，加入1mLTRIzolreagent充分研磨，室温放置5rain；12000g离心5rain，取上清液到另一离心管中；加人三氯甲烷200“L，充分振荡15s，室温放置3rain；12000g，4℃离心15min；取上层水相加入另一离心管中，加入0．5mL异丙醇；12000g，4℃，离心10rain，弃去上清液；加人1mL70％乙醇洗涤；RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH。O40止溶解即可。注：本方法是根据TRIzolreagent方法提取总RNA，在保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。9 GB／T28063--201D．4eDNA合成在3pL的总RNA中加入1pL的BPM4引物J(10pmol／L)，于95℃的水浴中7min，然后迅速冰浴5min。继续加入5×反应缓冲液2．5pL、dNTP混合物(10mmol／L)0．5pL、M-MLV反转录酶(200u／肛L)0．5pL、RNaseInhibitor0．5pL、经DEPC处理的ddH204．5pL。然后37"C水浴1h，95℃水浴10min，自然冷却至室温，--20℃冰箱中保存。D．5PCR扩增以上述合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。在PCR的薄壁管中分别加入以下试剂(25pL体系)：10XPCR缓冲液(含20mmol／L的M92+)2．5”L、TaqDNA聚合酶(2．5U／pL)0．5pL、dNTP混合物(每种各含10mmol／L)0．5／zL、BPM3引物(10／zmol／L)1．0“L、BPM4引物(10pmol／L)1．0pL、cDNA3．0pL、ddHz016．5卜L。反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性50s、60℃退火50s、72℃延伸30s，进行35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸7min。D．6琼脂糖凝胶电泳RT—PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5pL的RT-PCR产物与1pL的6X上样缓冲液混合均匀，并加到置于0．5XTBE缓冲液的1．5％琼脂糖凝胶孔中，然后在120V下电泳。电泳结束后，放入装有0．5pg／pL的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。D．7结果判定在阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小(约228bp)的条带情况下——如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性；——如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。'