GBT28071-2011黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法.pdf 14页

'ICS65．020．01B16香雪中华人民共和国国家标准GB／T28071--2011黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofcucumbergreenmottlemosaicvirus2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖吾GB／T28071—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法GB／T28071—2011本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子、苗木及其产品的检疫鉴定。2黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息中文名：黄瓜绿斑驳花叶病毒。学名：cucumbergreenmottlemosaicvirus。缩写：cGMMv。属烟草花叶病毒属Tobamovirus成员。CGMMV可通过接触传播，也可通过种子传播。蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播CGMMV。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一。植株一旦发病，如果未进行杀灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源。黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A。3方法原理通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，并根据生物学特性进行检测鉴定。4仪器设备、用具及试剂4．1仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0．001g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仅、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅。4．2用具微量移液器(0．5弘L，2pL，10pL，20pL，100,uL，200pL，1000pL)、化学PGR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵。4．3试剂4．3．1酶联测定试剂(见附录B)。4．3。2RT-PCR检测试剂(见附录C)。4．3．3实时荧光RT-PcR检测试剂(见附录D)。4．3．4生物学测定(参见附录E)。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28071—20”5样品制备5．1种子样品制备及检疫鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。5．2苗木检验鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同5．1。5．3植物产品的检验鉴定植物产品有症状的部分(如：果实上的畸形、斑驳等)单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。6检测方法6．1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加入已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致。具体操作见附录B。6．2RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成eDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。6．3实时荧光RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PcR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。6．4生物学接种试验参见附录E。7结果判定6．1、6．2、6．3、6．4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，RT—PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载8样品保存GB／T28071—2011经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在--20℃或者--80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。9结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28071—2011A．1寄主范围附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒简介黄瓜绿斑驳花叶病毒在自然界主要侵染西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜(Cucumismelo)、黄瓜(Cucumissativus)、南瓜(Cucurbitarnoschata)、瓠子([agenariasiceraria)、丝瓜(Luffacylindrica)、苦瓜(Mornordicacharantia)等葫芦科植物。一些杂草也是CGMMV的寄主，主要包括北美苋(Amaranthusblitoides)、反枝苋(Amaranthusretroflexus)、天芥菜(Heliotropiumeuropaeum)、马齿苋(Portulacaoleracea)、龙葵(Solanumnigrum)等。A．2病害症状黄瓜：叶片斑驳并凸起，畸形，植株矮化，果实上可产生黄或银色条斑，果实严重受损。西瓜：受侵染叶片轻型叶斑驳，严重时出现疱斑，植株矮化，成熟期果实表面出现浓绿色圆斑，果肉变色和腐烂。甜瓜；茎端新叶出现黄斑，随叶片老化症状减轻。瓠子：叶片出现花叶，有绿色突起，脉问黄化，叶脉呈绿带状。A．3分布地区CC-MMV于1935年在英国首次发现和报道。目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、丹麦、德国、俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、韩国、朝鲜、以色列、波兰、日本、巴基斯坦和我国的大陆和台湾均有分布。A．4血清学特性CGMMV具有很强的免疫原性。A．5粒体形态黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状，长度为300D_m，直径为18nm。A．6基因组病毒基因组为正单链RNA，全长约6．4kb，编码4个蛋白；病毒基因组5’和3’端分别含有一段非编码区。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载B．1试剂附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定B．1．1包被抗体特异性的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。B．1．2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体。B．1．3底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。B．1．4PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7．4)OB／T28071—2011NaCI8．0gNa2HP041．15gKH2POt0．2gKCl0．2gTween-200．5mL加入900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCl调节pH值到7．4，蒸馏水定容至1L。每升PBS中加入0．5mL的Tween一20。B．1．5样品抽提缓冲液(pH7．4)PBST1LNa2S031．3gPVP(MW24000～40000)20gNaN30．2g用NaOH或HCl调节pH值到7．4。4℃储存。B．1．6包被缓冲液(pH9．6)NazC031．59gNaHC032．93gNaN30．2g加入900mL蒸馏水溶解，用HCl调节pH值到9．6，蒸馏定容至1L。4℃储存。B．1．7酶标抗体稀释缓冲液(pH7．4)PBSTBSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉1L2．0g5 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28071—2011PVP(MW24000～40000)20．0gNaN30．2g用NaOH或HCl调节pH值到7．4。4℃储存。B．1．8底物(pNPP)缓冲液(pit9．8)MgClz0．1gNaN30．2g二乙醇胺97mL溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH值至9．8，蒸馏水定容至1L。4℃储存。B．2程序B．2．1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100pL／孔，加盖，室温避光孵育4h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次～6次。B．2．2样品制备待测样品按1：10(质量：体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r／min，离心10min，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B．2．3加样加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照，100pL／孔，加盖，室温避光孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次～6次。B．2．4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100uL／孔，加盖，室温避光孵育2h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次～6次。B．2．5加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg／mL(现配现用)，按100pL／孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B．2．6读数用酶联检测仪在30rain、1h和2h于405ilm处读OD值。B．3结果判断B．3．1对照孔的OD。值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD。值2；孔的重复性基本一致。B．3．2在满足了B．3．1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品0n。s值／阴性对照OD。值明显>2，判为阳性。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28071--2011样品0n。；值／阴性对照0n。。值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。样品0n。。值／阴性对照OD一值明显<2，判为阴性。若满足不了B．3．1质量要求，则不能进行结果判断。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28071—2011C．1试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检测C．1．1RNA提取试剂TRIzolreagent、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇。C．1．2反转录试剂M—MLVRT(200U／pL)、5×RT缓冲液、dNTP(10retool／L)、RNaseInhibitor(40U／／‘L)。C．2PCR试剂10×PCR缓冲液(含15mmol／L的M92+)、TaqDNA聚合酶(5U／／-L)、dNTP混合液(各10retool／L)。C．3实验步骤C．3．1总RNA提取称取0．1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1．5mL离心管中，加入1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3min；4℃，12000g离心10min，取上清液；加人200pL三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静止3min；4℃，12000g离心10min，取上层水相；加等体积的异丙醇，颠倒混匀；4℃，12000g离心10min，弃上清；加1mL75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5rain，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30pL经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的ddH：O，一20℃保存备用。C．3．2RT-PCR反应C．3．2．1引物序列上游引物CGMMVl：5’-CgTggTAAgCggCATTCTAAACCTC-3’下游引物CGMMV2：5。CCgCAAACCAATgAgCAAACCg-3’RT-PCR产物大小654bp。C．3．2．2eDNA合成反转录总体系为12．5pL。在PCR管中依次加入3pL总RNA，1pLCGMMV2引物，在65℃温浴7min，然后，冰浴5rain，瞬离，再向PCR管中加入下列试剂：M—MLVRT(200U／／,L)0．5pL、5×RT缓冲液2．5pL、dNTP(10mmol／L)0．5pL、RNasin(40U／pL)0．5pL、DEPC处理的ddH204．5pL。反应参数：37℃60min，95℃10rain。合成的cDNA于--20℃冰箱保存备用。C．3．2．3PCR扩增PCR反应体系见表C．1。反应参数：95℃4min；95℃60S，60℃50S，72℃60s，30个循环72℃10min。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。8 表C．1PCR反应体系GB／T28071--201110xPCR缓冲液2．5dNTP(10mmol／L)1．0CGMMVl(20pmoI／pL)0．5CGMMV2(20pmol／gL)0．5Taq酶(5U／,uL)0．2cDNA模板3．0ddH：O补足反应总体积至25“LC．3．3琼脂糖电泳C．3．3．1制备凝胶配制1．oH(质量浓度)的琼脂糖凝胶。溴化乙铰可直接加人琼脂糖凝胶中(浓度为0．5p-g／mL)，也可在电泳完成后用溴化乙锭染色。c．3．3．2电泳用1pL6×加样缓冲液与5pL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中。接通电源，以3V／cm～5V／em电场强度进行电泳，约0．5h后观察结果。c．3．3．3结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放人装有0．5pg／pL的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。C．4结果判断阳性对照在654bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。9 GB／T28071—2011D．1主要试剂附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR检测RNA提取试剂见C．1．1。TaqManOne-StepRT—PCRMasterMixReagents。D．2实时荧光RT-PCR检测D．2．1引物与探针引物和探针序列见表D．1。表D．1引物和探针序列及其在基因组中的位置名称引物和探针序列位置CGMMV—F5’一gCATAgTgCTTTCCCgTTCAC-3’6284nt～6304ntCGMMv-R5’一TgCAgAATTACTgCCCATAgAAAC-3’6361nt～6384ntCGMMv-PCggTTTgCTCATTggTTTgCggA6315nt～6337ntD．2．2RNA提取操作方法见C．3．1。D．2．3反应体系实时荧光PCR反应体系见表D．2。表D．2实时荧光RT-PCR反应体系加样量试剂名称2×MasterMixwithoutUNG25．040×MultiScrlbeandRNaseInhibitorMix1．25CGGMV模板(RNA)3．0CGMMV-F(20／*tool／L)1．0CGMMV-R(20b‘mol／L)1．OCGMMV-P(20／*tool／L)0．5DEPC处理水补足反应总体积至50pL10 D．2．4实时荧光RT-PCR反应参数检测CGMMV反应参数见表D．3。表D．3实时荧光RT-PCR反应参数GB／T28071—20”作用温度时间反转录48℃30min活化DNA合成酶和预变性95℃10rainPCR(40个循环)变性95℃15s延伸60℃1minD．3结果判定检测样品的ct值大于或等于40时，则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性。检测样品的ct值小于或等于35时，则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性。检测样品的ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的ct值大于或等于40时则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性；如果重新测试的ct值小于40，则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性。 GB／T28071—2011E．1接种附录E(资料性附录)生物学接种病叶加l：3(质量：体积)的磷酸盐缓冲液(o．01mol／L，pH7．2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。E．2寄主及症状E．2．1鉴别寄主黄瓜(Cucumissativus)：系统侵染；褪绿斑；花叶。西瓜(Citrulluslanatus)：系统花叶。E．2．2桔斑寄主苋色藜(Chenopodiumamarantieolour)：局部侵染；枯斑。曼陀罗(Daturastramonium)：局部侵染；枯斑。碧冬茄(Petuniahybrida)：局部侵染；枯斑。'