GBT28067-2011甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf 8页

'ICS65．020．01B16a雪中华人民共和国国家标准GB／T28067—2011甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法Detectionofsugarcaneyellowleafvirususingthereal·。timeRT__PCR2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣訾辫瞥星发布中国国家标准化管理委员会况1” 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖声GB／T28067--201本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：福建农林大学甘蔗综合研究所、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心、农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室。本标准主要起草人：高三基、陈平华、陈如凯、郭晋隆、张华、许莉萍、王恒波、陈由强。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB／T28067--2011本标准规定了甘蔗黄叶病毒实时荧光RToPCR检测方法所需的仪器与试剂、样品的采集与前处理、操作方法以及结果判定。本标准适用于甘蔗植株、种苗及种茎中甘蔗黄叶病毒的快速检测、诊断。2术语和定义2．12．22．3下列术语和定义适用于本文件。反转录reversetranscription以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。实时荧光RT-PCRrealtimeRT-PCR实时荧光反转录一聚合酶链式反应。ct值cycletime每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3缩略语下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核酸Taq酶：TaqDNA聚合酶dNTPs：4种脱氧核苷5，．三磷酸混合液RNase：RNA酶M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反转录酶FAM：6-羧基荧光素TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明4方法原理在反转录酶作用下将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用Taq酶进行实时荧光PCR扩增反应(采用TaqMan探针方法)。在比对甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的基础上，设计一对仅在甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团，3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团，结合部位位于目的扩增片段内部。当完整的探针与目的序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，仪器检测不到荧光信号；但在进行延伸反应时，Taq酶发挥5’一3’的外切核酸酶功能，将探针降解，使得荧光基团】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28067—2011与淬灭剂分离，所发出的荧光不再为淬灭剂所吸收而被检测仪所接受。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。5甘蔗黄叶病毒基本信息5．1病毒粒体形态特征甘蔗黄叶病毒粒体为二十面对称体，直径24nm～29nm，浮力密度1．30g／em3，由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义的RNA(ssRNA)构成，病毒基因组大小约6kb。5．2寄主范围自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharumofficinarum)、大茎野生种(Saccharumrobustum)、中国种(Saccharumslnensis)和割手密(Saccharumspontaneum)。实验寄主包括蔗茅属(Erianthussp．)、小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和高粱等。在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内。5．3寄主症状田间病症表现为甘蔗叶片中脉黄化，并向两侧扩展，中脉下表皮为鲜黄色，上表皮仍是正常的白色或绿白色，有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色。染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死，并向下扩展，严重感病植株叶片发黄、坏死。由甘蔗黄叶病毒引起的这种病害称为甘蔗黄叶病(Sugarcaneyellowleafdisease)，早期称为甘蔗黄叶综合症(sugarcaneyellowleafsyndrome)。5．4分布地区甘蔗黄叶病1989年首次发生在美国夏威夷，随后陆续在美国的弗罗里达州、德克萨斯州、路易斯安那州以及巴西、澳大利亚、南非、中国、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大。5．5传播途径由甘蔗蚜虫(Melanaphissacchari)、甘蔗绵蚜(Ceratovacunalanigera)、玉米叶蚜(Rhopalosiphummaidis)和水稻根际蚜虫(Rhopalosiphumrufiabdominalis)传播，也可由感病的种茎传播，但不能通过种子、机械摩擦方式传播。6病毒的分类信息国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告将甘蔗黄叶病毒列入黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中成员，英文名称为sugarcaneyellowleafvirus，缩写为SCYLV。7仪器与设备7．1实时荧光PCR检测系统。7．2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7．3电子天平：感量0．01g。7．4高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28067--20117．5微量加样器：0．1pL～2．5uL，0．5pL～10pL，5pL～20pL，10pL～100pL，10pL～200pL100pL～1000pL。7．6无RNA酶的离心管、PCR反应管、Tip头、实时荧光PCR反应管。7．7恒温水浴锅。7．8鼓风干燥箱。7．9冰箱：2℃～4℃，一20℃，--80℃。8试剂与材料8．1试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。8．1．1三氯甲烷。8．1．2异丙醇。8．1．375％乙醇”。8．1．4无RNase水及双蒸水。8．1．5裂解液：主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，为RNA提取试剂。8．t．65×反转录反应混合液：含5×反转录反应缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂、M-MLV反转录酶，具体配制方法参见附录A。8．1．7检测引物5’一引物：5LTTCAGTATAACTcATGcTccTcCG一3’3’一引物：5’一AcTTTcTTGGcGTTCCTCTTG一3’扩增片段大小为130bp。8．1．8TaqMan探针：5’一FAM—CGCAACTCCAGGTGCAATCGC-TAMRA-3’。8．1．9含有EXTaq荧光PCR反应混合液含有2×EXTaq荧光PCR反应液、5’一引物、3’一引物、TaqMan探针，具体配制方法参见附录A。8．2材料8．2．1阳性对照：用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照。8．2．2阴性对照：用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照。9样品的采集与前处理9．1取样工具砍刀、剪刀、镊子等取样工具应经121℃土2℃、1．1×105Pa高压灭菌15rain或经160℃千烤2h。9．2采样方法9．2．1采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。9．2．2叶片样品：取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(一1叶)叶片，编号备用。1)用无RNase水配制。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28067--20119．2．3蔗茎样品：取甘蔗植株可见肥厚带叶下两叶(+3叶)对应的蔗茎，若为甘蔗蔗种，取中部种茎编号备用。9．3存放与运送采集或处理的样本在2℃--8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，要求放置一80℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，或用液氮处理，尽快运送到实验室。10操作方法10．1总RNA的提取10．1．1取1．5mL无RNA酶的离心管，并对每个管进行编号。10．1．2称取0．2g样品材料(蔗茎样品要去除表皮)，并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干净)。10．1．3向1．5mL离心管中加入粉末，等液氮刚挥发完立即加入1mL裂解液，盖上管盖，振荡混匀，于4℃、12000g离心10rain。10．1．4吸取上清液至另一新的离心管中，加入0．2mL三氯甲烷，盖住管盖，剧烈振荡混匀约15s，室温静置3rain后，于4℃、12000g离心15min。10．1．5吸取上清液至另一新的离心管中，加入0．5mL预冷的异丙醇(一20℃)，颠倒混匀，室温静置10rain后，于4℃、12000g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。10．1．6小心倒出离心管中上清液，加人1mL75％预冷的乙醇(--20℃)洗涤，颠倒离心管2次～3次，7500g离心5rain(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。重复洗涤沉淀1次。10．1．7小心倒出离心管中上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀的一面，室温干燥10min～15rain。10．1．8加人50“L无RNase水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000g离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；若需长期保存，应放置一80℃冰箱。10．1．9取5“LRNA溶液加无RNase水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测260nm和280nm处的吸光值Az。和A。。。。RNA浓度按式(1)计算：C—A×N×40／1000⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)式中：c——RNA浓度，单位为微克每微升(／Lg／vL)；A——260nrll处的吸光值lN——RNA稀释倍数。当Azs。／A。。。比值在1．8～2．0之间时，适合于实时荧光RT-PCR扩增。10．2反转录10．2．1取1．0pLRNA(约2．0vg／vL)、1．0pL反转录引物(3’一引物)和8．ovtLDEPC水加入到无RNase的PCR管中，70℃15rain。10．2．2冰浴2rain。10．2．3加入反转录反应混合液，每个测试样本反转录反应混合液配制参见表A．1。轻微混匀，500g离心30s，42℃1h，75℃8rain。反应结束后，可以直接进行实时荧光PeR检测，或者放于--20℃保存备用。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载10．3实时荧光PCR反应GB／T28067--201110．3．1荧光PCR扩增试剂准备与配制。从试剂盒中取出含有EXTaq荧光PCR反应液，在冰上融化后，2000g离一tl,5S。每个测试样本反应混合液配制参见表A．2。10．3．2根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，全部加完后，充分混合均匀，2000g离心5s。向每个实时荧光PCR管中各分装24．0“L。10．3．3在各设定的实时荧光PCR管中分别加入10．2．3中反转录产物各1．0pL(cDNA约long～100ng)，盖紧管盖后，轻微混匀，500g离-tl,30S。10．3．4将10．3．3中加样后的实时荧光PCR反应管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。实时荧光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：95℃10S，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环，在每次循环的延伸阶段收集荧光。¨结果判断与表述11．1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。11．2对照结果检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照，用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照，用等体积的无RNase水代替模板RNA作空白对照。空白对照：无ct值且无扩增曲线。阴性对照：无ct值且无扩增曲线。阳性对照的ct值应≤30．0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。11．3检测结果的判定11．3．1阴性无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黄叶病毒。11．3．2阳性ct值≤35．0，且出现典型的扩增曲线，表示样本中含甘蔗黄叶病毒。11．3．3有效原则ct值>35．0的样本应重做。重做结果无ct值者为阴性，否则为阳性。11．4结果表述该试样中检出甘蔗黄叶病毒。该试样中未检出甘蔗黄叶病毒。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28067—2011附录A(资料性附录)甘蔗黄叶病毒反转录反应与实时荧光PCR扩增反应混合液配制表A．1每个测试样本反转录反应混合液配制的组分及使用量试剂使用量25HL反应体系终浓度5×反转录反应缓冲液(M92+Plus)5．0／LL1×10mmol／LdNTPs1．0pL0．4mmol／L10LI／／“LRNase抑制剂0．5uL5U／25nL200U／vLM-MLV反转录酶1．0pL200u／25v．L无RNase水7．5“L总体积15．0uL表A．2每个测试样本荧光PCR扩增反应混合液配制的组分及使用量试剂使用量25“L反应体系终浓度2×荧光PCR反应液(含Taq酶)12．5uL1×5。引物(10pmol／L)1．0uL0．4pmol／L3。引物(10vmol／L)1．0／LL0．4“mol／L荧光探针(10／_￡mol／L)1．0uL0．4／1mol／L2’双蒸水8．5“L总体积24．0vL2)探针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书或各荧光探针的具体使用要求进行。'