GBT28075-2011萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法.pdf 14页

'ICS65．020．01B16囝园中华人民共和国国家标准GB／T28075—201萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPseudomonassavastanoipv．phnseDficoZ口(Burkholder)Gardaneta1．2011-12-30发布2012—06—01实施宰瞀鹊紫瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T28075--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准使用重新起草法参考国际种子检验协会(InternationalSeedTestingAssociation，ISTA)的SeedHealthTestingMethods第7-023号标准《豌豆中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测》编制，与7-023：2008标准的一致性程度为非等效。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、陈青、黄蓬英、易建平、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法GB／T28075--20”本标准规定了萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的生物学、血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料及其产品中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测与鉴定。2萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型基本信息中文名；萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型(菜豆晕疫病菌)。学名：Pseudomonassavastanoipv．phaseolicola(Burkholder，1926)Gardan，Bollet，AbuGhorrah．Grimont8LGrimont，1992。病害英文名：haloblightofbean同物异名：Bacteriummedicaginisvat．p^ns∞zifo缸(Burkholder)Link＆Hull，1927BacteriumpuerariaeHedges，1927Phytomonasmedicaginis(Sackett)var．phaseolicolaBurkholder，1926Phytomonaspuerariae(Hedges)Bergeyeta1．，1930P5eudo，”on口smedicaginisvar．phaseolicola(Burkholder)Stapp&Kotte，1929Pseudomon口smedicaginisf．sp．phaseolicola(Burkholder)Dowson，1957PseudomonasmedicaginisBurkholder，1926Pseudomonasphaseolicola(Burkholder)Dowson，1943Pseudomonassyringaepv．p^口seoZicof口(Burkholder)Young，Dye＆Wilkie，1978Xanthomonasmedicaginisvar．口haseolicola(Burkholder)Elliot，1951属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、卜变形细菌纲Gammaproteobacte血、假单胞杆菌目Pseudomonadales、假单胞杆菌科Pseudornonadaceae、假单胞杆菌属Pseudomonas。萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的其他信息参见附录A。3方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DA孓ELIsA)、基于体外DNA合成技术的聚合酶链式反应(PcR)以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定。4主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂：蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、酪胺酸、甘油、硼酸、头孢氨苄、万古霉素、溴酚蓝、放线(菌)酮或制霉菌素、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris一盐酸、EDTA、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、溴化乙锭等PCR相关试剂。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28075--20115主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定仪、酶标仪。6病菌分离6．1种子样品的制备检查种子表面的为害状与异常情况，感病豆荚的种子可能皱缩，种皮有奶黄色的斑块。每份检测样品至少检测2000粒种子。根据检测种子样品的质量(g)，按照1：1．5(质量：体积)的比例，在样品种子中加入无菌蒸馏水，如500g种子则加入750mL；于4℃～5℃下静置12h～18h。取种子浸出液10mL，用155509离心5rain，用蒸馏水分2次(每次1mL)洗下沉淀物，制成种子浸出液。6．2种子中病菌的分离培养取100pL的种子浸出液涂布于MT和(或)MSP培养基平板(培养基的配制见附录B)。每个处理至少3个～5个重复，无菌水作为空白对照。在27℃士2℃下培养，3d后开始观察。发现可疑菌落(菌落形态特征见6．4)，将菌落转移至KB平板上培养1d～2d(培养基的配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR等方法鉴定。6．3植物组织中病菌的分离培养仔细检查症状(参见图A．7)，用无菌刀片将感染组织切成细的切块，加一滴无菌水置于载玻片上，然后盖上盖玻片在显微镜下观察细菌的菌脓。如有，直接蘸取菌脓，或将菌脓转移入1mL无菌水中，在MT和(或)MSP平板上划线分离(培养基的配制见附录B)。选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm～7mm的组织，用70％酒精表面消毒15s，无菌水洗2次～3次，在MT和(或)MSP平板上培养。在27℃±2℃下培养，3d后开始观察。发现可疑菌落(菌落形态特征见6．4)，将菌落转移至KB平板上培养1d～2d(培养基的配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR等方法鉴定。6．4菌落形态特征可疑菌落在KB培养基上划区培养至少20个菌落，在28℃下培养24h～48h，观察有无荧光色素产生，并进行革兰氏染色及鞭毛染色。菌落在以下培养基上产生如下特征，可以确定可疑菌落。在MSP培养基上：Psph菌落圆形、隆起、球形、发亮、淡黄色、中央略浅。3d后，菌落边缘的培养基变成淡黄色(参见图A．6)。在MT培养基上：Psph菌落奶油状、乳白色、扁平、圆形、直径4．5mm～5．0mm；在紫外光下，多数菌落产生淡蓝色的荧光(参见图A．7)。在KB培养基上：Psph的菌落扁平、乳白色和奶油状；3d后，产生蓝绿色荧光。丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseonomonassymngaepv．syringae)的一些菌株与Psph一样，在MSP培养基上培养3d后，菌落边缘的培养基也变成淡黄色。但是，Psph的菌落边缘不整齐。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7病菌鉴定7．1生化鉴定采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。7．2DAS-ELISA方法GB／T28075--20”将可疑菌落配制成104cFu／mL悬浮液，取100pL悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。具体操作步骤见附录C。7．3PCR方法将可疑菌落制备成108cFu／mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增。或者把可疑菌落转到NB培养基中(培养基配制见附录B)，在25℃士2℃下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增。用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照。具体操作步骤见附录D。7．4致病性测试7．4．1概述如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果。致病性测定采用以下针刺接种法或浸泡接种法。7．4．2针刺接种用牙签或解剖针蘸取在KB培养基上有蓝绿荧光的纯化菌落，在弯颈期的小苗上剌伤接种子叶的近胚轴面。用无菌水接种叶片作空白对照。最少接种10个菌落，每个可疑的菌落接种10株以上小苗，每株接种至少2个接种点。每次接种前，牙签或解剖针都要消毒。接种4d～5d后，子叶内部可以见到典型的“油脂”状斑点。如果8d～10d后没有出现症状，则可判定为非致病菌。7．4．3浸泡接种将感病品种的种子播种在苗床或吸水纸上，保湿，25℃黑暗条件下培养2d。可疑菌落在KB上培养1d～2d后，用无菌水配制成108CFU／mL的悬浮液。用解剖针挑开已充分吸水种子的子叶和种皮，在悬浮液中浸泡10rain15min。每个可疑菌落接种10粒以上种子。设无菌水作空白对照。将浸泡后的种子种植在无菌的土壤中，20℃下高湿培养5d～7d。种子萌发后，在子叶上出现“油脂状”的斑点，第一真叶也可能出现症状。如果8d～10d后没有出现症状，则可判定为非致病菌。8结果判定与检测报告8．1结果判定8．1．1未分离到可疑菌落如果经MT或MSP培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28075--201致病型。8．1．2分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落，应经生化鉴定、或DAS-ELISA或PCR方法检测，并通过致病性测试的确认：——如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，致病性测试也产生典型症状，则判定为阳性，检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型；——如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR的结果为阴性，则判定为阴性，未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型；——如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，但致病性测试为阴性，则应重新进行致病性测试。致病性重新测试后，如果仍然未产生典型症状，则判定为未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型。8．2检测报告检测报告应包含所采用的检测方法所产生的数据，包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌落形态特征照片，PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1检疫重要性附录A(资料性附录)萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型相关资料属2007年公布并实施的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。A．2地理分布GB／T28075--201非i}}f：埃及、马达加斯加、尼日利亚、南非等。美洲：阿根廷、巴巴多斯、百慕大、巴西、加拿大、哥伦比亚、多米尼加、古巴、格林纳达、牙买加、墨西哥、波多黎各、圣文森特、美国、乌拉圭、委内瑞拉等。亚洲；缅甸、柬埔寨、菲律宾、韩国、日本、印度尼西亚、以色列、文莱、黎巴嫩、马来西亚、尼泊尔、斯里兰卡、印度等。欧洲：保加利亚、英国、芬兰、法国、德国、希腊、荷兰、匈牙利、意大利、摩洛哥、葡萄牙、罗马尼亚、土耳其、俄罗斯、西班牙、前南斯拉夫、瑞士等。大洋洲：澳大利亚、新西兰、西萨摩亚等。A．3寄主植物菜豆(Phaseolusvulgaris)、大豆(Glycinem口z)、多花菜豆(P．multifloⅧs)、碗豆(Pisumsatizrum)、绿豆(Vignaradiate)、豇豆(Vunguicugata)、扁豆L(Dolichoslablab)、赤豆_(Phaseolusangus—laris)、木豆L(Cajanuscajan)、野葛(Puerariathunbergiana)和桑橙(Maclurapomifera)等。A．4传播途径病菌附着在种子表面，多在种皮的外表和里面，严重为害时才侵入子叶，但不会侵入胚乳。种子带菌率一般在1％～10％之间，一般的商业用种子带菌率为1％以下。病菌可通过种子进行远距离传播。田问可通过风吹雨溅，洒水灌溉传播，但沟灌或畦灌不会传播。冬季在土壤或菜豆植株残体上不能存活，但在于野葛的溃疡病斑上能越冬。A．5症状特征该病菌可通过气孔侵入，引起系统侵染，叶、茎、荚和种子等部位均可发病。病菌产生毒素导致黄色褪绿晕圈，毒素可以转移到无病斑的叶片上，产生类似病毒病的中脉褪绿、花叶和畸形等症状。潮湿时叶、茎和荚等部位的病斑上常有黄色粉状物。晕疫病的症状随温度等变化而异，一般在16℃～20℃时才会有晕圈产生。大雨和低温有助于晕疫病的发生和蔓延，而温暖气候有利于细菌性萎蔫病的发生。在叶片上，初期在叶的两面产生水渍状小斑点，扩大后成不规则形，深褐色，边缘有黄色晕圈，干燥时似羊皮纸，半透明，质脆易破裂，最后全叶干枯，严重时似火烧状；病斑周围具黄色褪绿晕圈，后期的叶片坏死，畸形。5 标准分享网www.bzfxw.com免费下载叶片症状见图A1～圈A3。在茎秆上。病斑为水渍状，红褐色，稍凹陷，长条形，后开裂，有时渗出细菌菌脓，引起茎的环状剥皮或萎蔫。在豆荚上，病斑(见图A4)通常表现为类似脂点的暗绿色斑点，凹陪，近圆形或不规则形；豆荚中的种子皱缩(见图A．5)，有拽褐色凹陷的小斑，种皮偶有奶黄色的斑块等症状，在种子上，严重感染的于燥种子会变色，纵向皱缩或具外缘整齐、稠密的黄色斑。在紫外灯(350nm～450rim)下观察，产生白色荧光的表明被感染。多数种子没有明显症状。口洌k■一鞠图A1菜豆叶片上的早期症状围A2菜豆叶片上的症状圈A3绿豆叶片上的后期症状围A4豆荚上的暗绿色斑点圈A5豆美皱缩症状 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A6菌落培养特征GB／T28075--20该病菌在不同的培养基上产生不同的特征，在MSP培养基上的蔺落特征参见固A6，在MT培养基上的萧落特征参见围A7。＆：目片⋯自1STA(2006)。图囝图A6在MSP培养基上的酋落囤A7在MT培养基上的苗藩 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28075--201B．1生理盐水附录B(规范性附录)培养基的配制将8．5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃湿热灭菌15rain；加入0．2mL吐温一20。B．2NB培养基(NutrientBroth)蛋白胨5．0g，牛肉浸膏3．0g，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌15rain。B．3KB培养基(改良KB培养基，King，eta1．，1954)称取以下试剂：3号朊蛋白胨20．0g，磷酸氢二钾(KzHPO。)1．5g，硫酸镁(MgSO。·7HzO)1．5g，甘油15．0mL，琼脂15．0g，倒入1L的烧杯中，加1000mL的蒸馏水，搅拌溶解。在121℃下湿热灭菌15rain；冷却至45℃～50℃后，加人头孢氨苄(Cephalexin)50mg(溶解于75％的酒精中，配制成25×10“浓度)。把培养基缓慢地倒人培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。培养基在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装入塑料袋中，在4℃下保存。最长的保存时间是2周～3周，否则抗生素会失效。B．4MT培养基(牛奶土温琼脂培养基，Goszczynska＆Serfontein，1998)称取所有的A原液(见表B．1)倒入适宜的容器内，加500mL蒸馏水；将脱脂奶粉倒入500mL水中溶解；准备iomL的吐温一80；将A、B、C原液分别在121℃下灭菌消毒15rain；在无菌的条件下，将B、C原液(见表B．1)加入A溶液中；待冷却到45℃～50℃时才加入抗生素(见表B．1)；缓慢地倒入培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。表B．1MT培养基配方比例原液成分mL或g／L3号朊蛋白胨10．og氯化钙o．25gA酪胺酸o．5g琼脂15．og蒸馏水500mL脱脂奶粉10．0gB蒸馏水500IllL 表B．1(续)GB／T28075--2011比例原液成分mL或g／LC吐温一80(10％)10．0iTlL放线(菌)酮(cycloheximide)或40×10-6的制霉菌素200mgD头孢氨苄(cephalexin)80．0mg万古霉素(vancomycin)10．0mg在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装入塑料袋中，在4℃下保存。最长的保存时间是2周～3周，否则抗生素会失效。B．5MSP培养基(改良的蔗糖蛋白胨琼脂培养基，Mohan＆Schaad，1987)称取所有的A原液(见表B．2)倒人适宜的容器内，加1000mL蒸馏水将试剂溶解；在121℃下灭菌消毒15min；将培养基冷却到45℃～50℃时加入抗生素(见表B．z)；缓慢地倒人培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。表B．2MSP培养基配方比例原液成分mL或g／L蔗糖20．0g3号朊蛋白胨5．0gA磷酸氢二钾(K：HPO．)0．5g硫酸镁(MgSO‘·7H20)0．25g琼脂20．0g放线(菌)酮(cycloheximide)或40×10-6的制霉菌素200mg头孢氨苄(cephalexin)3．2mLB万古霉紊(vancomycin)1．0nlL溴酚蓝(bromothymolblue)1．0mL在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装入塑料袋中，在4℃下保存。最长的保存时间是2周～3周，否则抗生素会失效。 GB／T28075--201IC．I检测样品制备附录C(规范性附录)DAS-ELISA方法以种子浸出液可作为检测样品(制备方法见6．1)。将可疑菌落的纯培养物可配制成104CFU／mL的菌体悬浮液作为检测样品。c．2包被根据DAS-ELISA检测试剂盒说明，用碳酸钠缓冲液稀释抗体溶液(如1：200)，在微孔板中每孔加入100pL包被抗体溶液。在室温下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。c．3捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗3次(可在洗板机上完成)。加入样品提取物，每孔100pL每个样品2个孔(重复1次)。并设置阳性／阴性和空白对照。在室温下孵育2h或4℃下过夜。C．4加入酶标抗体根据说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1：200)。倒去孔中的样品提取液，用PBST洗3次(可在洗板机上完成)。每孔加入i00pL酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。C．5加底物用二乙醇胺缓冲液(pH9．8)配制1mg／mL的对硝基苯磷酸酯的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBST洗3次(可在洗板机上完成)。每孔加入100pL新鲜配制的底物溶液。室温下避光放置，直至阳性对照孔明显显色(约30min～60min)。在准备底物溶液的过程中，不要接触药剂或暴露在强光中，避免在阴性对照孔中出现背景颜色。C．6结果判定C．6．1对照孔的OD4。。值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的On。。值2；同一样品的0n。。值应基本一致。C．6．2在满足了C．6．1质量要求后，结果原则上可判断如下：——样品OD“值／阴性对照OD“值明显>2，判为阳性；——样品OD。值／阴性对照On。值在阈值附近，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证；——样品On。。值／阴性对照OD4。。值明显<2，判为阴性。C．6．3若满足不了C．6．1质量要求，则不能进行结果判断。10 D．1PCR模板的制备附录D(规范性附录)PCR方法GB／T28075--2011D．1．1菌悬液PCR模板的制备取3pL的108CFu／mL(0D5。。一0．1)的菌体悬浮液，转入装有100pL无菌双蒸水的1．5肛L离心管中，在99℃水浴10min，100009离心10min，冷却后，取上清液作为PCR反应模板。D．1．2DNA的提取取1mL在NB培养基中振荡培养过夜的菌液，100009离心2rain，提取沉淀的DNA；或者取0．1g的发病植物组织，研磨后，提取植物总DNA。具体提取步骤根据所采用的DNA提取试剂盒。D．2引物用于检测Psph的特异性引物及其序列见表D．1，可由有关生物公司合成和纯化。表D．1用于PCR检测的引物及其序列I引物名称引物序列扩增片断大小HBl4F5’一CAACTCCGACACCAGCGACCGAGC3，1375bpHBl4R5’一CCGGTCTGCTCGACATCGTGOCAc-3，D．3PCR反应体系50pL反应体系中加入：10×PCR缓冲液(含MgCI：)5．0pL，10mmol／L的dNTP混合物1．0gL，TaqDNA聚合酶(5U／pL)0．5PL，10pmol／L的上下引物各2．0pL，DNA模板3乩，去离子水补足至50“L。D．4反应条件在PCR仪上完成以下程序：95℃预变性3rain；然后94℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸2min，共35个循环；最后在72℃下保持10min。D．5电泳分析取5pL扩增产物与1PL的6×上样缓冲液混合均匀，在1×TBE缓冲液配制的1．5％琼脂糖凝胶中，50V电泳45min，用荧光染料或溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察，拍照并保存。 GB／T28075--201D．6结果判定在阳性对照扩增出预期的1375bp大小的条带，阴性对照和空白对照没有扩增到预期大小条带的条件下：——如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阳性；——如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阴性。'