GBT28081-2011烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf 15页

'ICS65．020．01B16囝圄中华人民共和国国家标准GB／T28081—2011烟草环斑病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationoftobaccoringspotvirus2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鬻鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厘111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖罱GB／T28081--20”本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围烟草环斑病毒检疫鉴定方法GB／T28081—2011本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子、苗木、鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文侔。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T1146植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法。3烟草环斑病毒基本信息中文名：烟草环斑病毒。学名：tobaccoringspotvirus。缩写：TRSV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Nepovirus病毒。TRSV的传播途径多样，可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播。烟草环斑病毒其他信息参见附录A。4方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。5仪器设备、用具及试剂5．1仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0．001g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅。5．2用具微量移液器(O．5pL，2pL，10pL，20pL，100pL，200pL，1000弘L)、化学PCR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵。5．3试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂(见B．1)。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28081—2011反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂(见C．1)。实时荧光RT-PCR检测试剂(见D．1)。Ic_RT-PCR检测试剂(见E．1)。6种苗的检测鉴定6．1种子检测鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联铡定和分子生物学检测。6．2苗木、组培苗检测鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6．1。6．3鳞球茎检测鉴定取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。6．4植物产品的检测鉴定植物产品有症状的部分单独检测。没有症状或无法的观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。7检测7．1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如：种子或叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。7．2RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录c。7．3实时荧光PeR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行实时荧光PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。7．4IC-RT-PCR检测把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的离心管中，然后进行IC-RT-PCR扩增。健康的植2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录E。8结果判定GB／T28081—20117．1、7．2、7．3、7．4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒。一般是酶联测定为阳性后，分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒。必要时可进行生物接种试验，具体操作按照SN／T1146规定的方法执行。9样品保存、结果记录与资料保存9．1样品保存经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20℃或者--80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。9．2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28081—2011A．1寄主范围附录A(资料性附录)烟草环斑病毒简介TRSV自然寄主范围非常广泛，可侵染54科300多种植物，主要的经济作物有：大豆(Glycinemax)、马铃薯(Solanumtuberosum)、甘薯(Ipomoeabatatas)、烟草(Nicotianatabacum)、西瓜(Citrulluslanatus)、黄瓜(Cucumissatlr．n2s)、甜瓜(cucumismelo)、胡萝h(Daucuscarota)、唐菖蒲(Gladiouscummunis)、李属(PrunusL．)、葡萄(Vitisvinifera)等。A．2病害症状因寄主不同可产生不同的症状，一般在生长季节初始，幼嫩植株上的症状较严重，而在生长季节后期不太明显。TRSV造成叶片系统褪绿斑、坏死环斑，茎顶枯，根腐烂，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小畸形。有的症状在后期可恢复，表现为无症带毒。大豆：顶芽卷曲(芽枯萎)，其他芽逐渐变褐色且易碎。在茎干和多数叶片的叶柄上产生褐色条纹，豆荚不发达且结实。在结荚后感染则可能产生黑色污点。烟草：在叶片上产生环形及线状斑，植株矮化。葫芦：植株矮化、叶片斑驳、果实畸形。葡萄：新长出的枝条柔弱、稀疏，节间变短。叶小且扭曲．植株矮小、产果少且变形。A．3分布地区TRSV在日本、韩国、印度、中国台湾地区、美国、土耳其、加拿大、墨西哥、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰等50多个国家和地区均有分布。A．4传播途径TRSV在大豆上的种传率有时可达到100％。主要的传播介体为美洲剑线虫Xiphinemaameri—cnn“m。此外在实验室条件下确定能传播TRSV的昆虫介体有许多，如烟蓟马Thripstabaci和烟草跳甲Epitrixhirtipennis等。A．5血清学特性TRSV免疫原性强。A．6粒体形态病毒粒体为等轴二十面体球状颗粒，直径约28rim。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A。7基因组GB／T28081—2011病毒基因组含两条ssRNA。RNA一1长7514nt，RNA一2长3929nt，外壳蛋白基因1548nt。5 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28081—2011B．1试剂附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定B．1．1包被抗体特异性的烟草环病毒抗体。B．1．2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的烟草环斑病毒抗体。B．1．3底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)B．1．4样品抽提缓冲液(pH7．4)PBST1LNa2S031．3gPVP(MW24000～40000)20gNaN30．2g用NaOH或HCl调节pH值到7．4。4℃储存。B．1．5包被缓冲液(pH9．6)Na2C031．59gNaHC0。2．93gNaN30．2g加入900mL蒸馏水溶解，用HCI调节pH值到9．6，蒸馏定容至1L。4℃储存。B．1．6PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7．4)NaCl8．0gNa2HP041．15gKH2P040．2gKCl0．2gTween-200．5mL加入900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCI调节pH值到7．4，蒸馏水定容至1L。每升PBS中加入0．5mL的Tween-20。B．1．7酶标抗体稀释缓冲液(pH7．4)PBST1LBsA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2．0g6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载PVP(MW24000～40000)20．ogNaN30．2g用NaOH或HCl调节pH值到7．4，4℃储存。B．1．8底物(pNPP)缓冲液(pH9．8)MgCl20．1gNaN30．2g二乙醇胺97mL溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH值至9．8，蒸馏水定容至1L。4℃储存。B．2程序GB／T28081--2011B．2．1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100pL／孔，加盖，室温避光孵育4h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次～6次。B．2．2样品制备待测样品按1：10(重量：体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r／min，离心10min，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B．2．3加样加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照，100pL／孔，加盖，室温避光孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次～6次。B．2．4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100pL／孔，加盖，室温避光孵育2h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4次～6次。B．2．5加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg／mL(现配现用)，按100pL／孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B．2．6读数用酶联检测仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。B．3结果判断B．3．1对照孔的OD4so值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD“值<0．15，当阴性对照孔的0n。；值<0．05时，按o．05计算。阳性对照有明显的颜色反应；阳性对照On。s值／阴性对照0n。s值>2；孔的重复性基本一致。B．3．2在满足了B．3．1质量要求后，结果原则上可判断如下： 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28081—20”样品OD“值／阴性对照OD。值明显>2，判为阳性。样品ODms值／阴性对照OD4。。值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。样品0n。s值／阴性对照OD4。。值明显<2，判为阴性。若满足不了B．3．1质量要求，则不能进行结果判断。 C．1试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检铡GB／T28081—2011c．1．1TRlzolreagent、三氯甲烷、异丙醇、70％乙醇。C．1．2反转录试剂：M—MLV反转录酶(200U以L)、5×RT反应缓冲藏(250mmoI／LTris-HClpH8．325℃、375mmol／LKCl、15mmol／LMgCl2、50mmol／LDTT)、dNTP混合液(各10retool／L)、RNaseInhibitor(40U／pL)。c．1．3PCR试剂：10×PCR缓冲液(含15mmol／L的M92+)、TaqDNA聚合酶(5U／pL)、dNTP混合液(各10retool／L)。c．2实验步骤c．2．1引物设计根据已报道的TRSVCP基因的保守序列设计l对特异性引物引物序列为：TRSVF-1：5’。GATGCAAAGAAAGGAAAGC-3’TRSVR-1：5’一AGATATGGACAACATGGAG-3’扩增片段大小为576bp。C．2．2RNA提取C．2．2．1取0．1g样品，液氮研细，加人1mLTRIzolreagent，混匀，倒入1．5mL离心管中，室温静置3min。C．2．2．2加入0．2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，室温静置3min，4℃11000r／min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中。C．2．2．3加入等体积异丙醇，混匀，--20℃静置10min，4℃12000r／min离心15min，弃上清液。c．2．2．4加入1mL70％冷乙醇，悬浮沉淀，4℃8000r／min离心10min，干燥沉淀。c．2．2．5加入30pLDEPC处理的ddH。O，溶解沉淀(必要时，55℃～60℃水浴10min，加速溶解)，于--80℃保存备用。洼：也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作。c．2．3反转录利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。先加人2p乙的总RNA、1pL的TRSVR-1引物(10Pmol／L)，于95℃的水浴中7min，然后迅速冰浴5min。继续加入5×RT缓冲液2．5pL、dNTP混合液(10mmoI／L)0．5pL、M-MLV反转录酶(200U／／1L)0．5／LL、RNaseInhibitor0．5PL、DEPC处理的ddH。O5．5vtL。反应参数：37℃60rain，95℃10rain。合成的cDNA于--20℃冰箱保存备用。C．2．4PCR扩增PCR反应体系见表C．1。反应条件：94℃4rain；94℃45s、48℃45s、72℃45s，30个循环；72℃延伸10rain。9 GB／T28081--2011表C1PCR反应体系加样量名称“L10xPCR缓冲液(含15mmol／L的Mgz+)2．5dNTP混合液(各10retool／L)1．0TRSVF-1(20pmol／／zL)0．5TRSVR-1(20pmol／vL)0．5Taq酶(5U／v-L)0．3eDNA3补ddH：O至25pLC。2．5琼脂耱凝腔电泳检测C．2．5．1制备凝胶配制1．5％(质量浓度)的琼脂糖凝胶。溴化乙锭可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为0．5gg／mL)，也可在电泳完成后用溴化乙锭染色。C．2．5．2电泳用1pL6×加样缓冲液与5pL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中。接通电源，以3V／cm--5V／cm电场强度进行电泳，约0．5h后观察结果。C．2．5．3结果观察电泳结束后，将琼脂糖凝胶放人装有0．5pg／止的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。C．3结果判断阳性对照在576bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。 D．1试剂试剂见C．1。D．2实验步骤附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR检测GB／T28081--2011D．2．1引物设计引物序列；TRSV一5P：57一TCCATGTTGTCCATATCTTA-3’TRSV一3P：57一AGAAGAAACACTCTTGACACT-3’探针序列：5’一FAM-CCGCTTATAGTGCCAGACCA-TAMARA-3’D．2．2RNA提取及反转录操作方法见C．2．2。D．2．3实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表D．1，每个样品设2个平行处理。并设阳性对照、阴性对照和空白对照，以含有烟草环斑病毒的eDNA为阳性对照；以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的eDNA作为阴性对照；以ddH。O代替DNA模板作为空白对照。每个对照各做2个平行管。表D．1实时荧光PCR反应体系加样量名称贮备液浓度终维度pLPCR缓冲液10×1×5TRSV一5P20tlmol／L0．24／1mol／L0．6TRSV-3P20／zmol／L0．24tlmol／L0．6Taq酶5U／ML2U／test0．4探针20Mmol／L0．4ttmoI／L1cDNA4ddH20补ddH20至50pLD．2．4实时荧光PCR反应参数反应条件：94℃5rain；94℃15s，55℃40s，72℃40s，共40个循环。点击运行，进行PCR反应，11 GB／T28081--2011保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出&Rn(荧光信号增加值)与循环数之间关系的图像。D．3结果判定检测样品的ct值大于或等于40时，则判定烟草环斑病毒阴性。检测样品的ct值小于或等于35时，则判定烟草环斑病毒阳性。检测样品的ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的ct值大于或等于40时则判定烟草环斑病毒阴性；如果重新测试的ct值小于40，则判定烟草环斑病毒阳性。12 E．1试剂附录E(规范性附录)IC-RT-PCR检测E．1．1TRSV抗体。E．1．2样品抽提缓冲液(见B．1．4)。E．1．3包被缓冲液(见B．1．S)。E．1．4PBST缓冲液(见B．1．6)。E．1．5反转录及PCR试剂(见c．1．2、c．1．3)。E．1．6AMV反转录酶。E．2实验步骤E．2．1引物引物序列见C．2．1。E．2．2抗体吸附GB／T28081—2011将TRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200止包被离心管，37℃，孵育2h；用PBST洗3次，取样品50mg，加入样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100pL包被PCR管，4℃过夜(或37℃孵育2h)；PBST洗3次，DEPC—H。O洗1次，短暂离心后吸去管底余液。E．2．3反转录直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20pL，其中lpL反向引物(20tlmol／L)，4btL5×AMV酶缓冲液，2pLdNTP(10mmol／L)，11pLDEPC-H20。离心混匀后95℃变性5min，迅速置冰上2min～3min，然后加入1pLAMV反转录酶(5U／pL)，1pLRNA酶抑制剂(40U／ttL)，42℃反应1h。E．2．4PCR扩增和琼脂糖凝胶检测操作方法见C．2．4、c．2．5。E．3结果判断阳性对照在576bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。'