GBT28073-2011南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf 11页

'ICS65．020．01B16a亘中华人民共和国国家标准GB／T28073--201南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificatiOnofarabismosaicvirus2011—12—30发布2012-06-01实施宰瞀鳃鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置GB／T28073--2011本标准按照GB／Tl_1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴嫒。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法GB／T28073--2011本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。2南芥菜花叶病毒基本信息中文名：南芥菜花叶病毒。英文名：arabismosaicvirus。异名：arabismosaicnepovirus；hopnettleheadvirus(啤酒花荨麻病病毒)；rhubarbmosaicvirus(大黄花叶病毒)；raspberryyellowdwarfvirus(悬钩子黄矮病毒)；ashringandlinepatternviurs(白腊树环线状病毒)；rhabarber-mosaik-virus(大黄花叶病毒)；forsythiayellownetvirus(连翘黄网状病毒)；jasmineyellowblotchvirus(茉莉黄斑病毒)。英文缩写：ArMV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Nepovirus。南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。3方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS_ELIsA)、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PcR)进行检测鉴定。4主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量：0．001g)、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计等和各种量程的可调移液器(1000pL、200pL、100pL、20pL、lOlL、2pL)。5检测与鉴定5．1DAs_ELISA检测把0．5g～1．0g样品充分研磨或在液氮中研磨，按1：10比例加入样品提取缓冲液，转移到5mL离心管中，8000r／min离心5min，上清液作为DAS_ELISA的检测提取液。设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料(如：种子或叶片)应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录B。注：提取液在3h内使用，否则保存在4℃中。】 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28073--20115．2RT-PCR检测分别提取检测样品的总RNA，然后用RT-PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录c。5．3实时荧光RT-PCR检测分别提取检测样品的总RNA，反转录合成cDNA后用实时荧光PCR检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染ArMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。5．4序列测定将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的ArMV相应序列进行比对，如果翻译后氨基酸序列与已知的ArMV相应序列同源性大于75％则判定为ArMV序列，小于75％则判定为非ArMV序列。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／6结果判定与报告6．1结果判定当产生以下检测结果时，则判定为检出ArMV：——当DAS-ELISA检测、RT-PCR检测、实时荧光RT—PCR检测，其中有两种方法检测结果呈阳性时，判定为检出ArMV；——当RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为ArMV序列，则判定为检出ArMV。6．2结果记录与保存记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据报告，RT—PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT—PCR检测结果保存采集的数据，序列测定结果保存测序报告图。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1分布附录A(资料性附录)南芥菜花叶病毒简介GB／T28073—2011欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫。亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。非洲：南非。北美洲：加拿大、美国。大洋洲：澳大利亚、新西兰。A．2形态特征该病毒属线虫传多面体病毒，病毒粒体为等轴对称二十面体，直径约30nm，为双分体病毒，含有两条相对分子质量分别为2．4X106和1．4×106的单链RNA。超速离心后分为T(53S)，M(93S)和B(126S)三个组分。该病毒具有一个外壳蛋白，相对分子质量为54kDa。A．3寄主范围及症状ArMV可侵染174属215种植物。主要为害的作物有大麻(Cannabissativa)、啤酒花(Humuluslupulus)、黄瓜(Cucumissativus)、西葫芦(Cucurbitapepo)、莴苣(Lactucasativa)、草莓(Fragaiaananassa)、葡萄(Vitisvinifera)、香石竹(Dianthuscaryophyllus)、水仙(Narcissustazetta)、蔷薇(Rosamultiflora)、草木樨(Melilotussuaveolens)、郁金香(Tulipagesneriana)、芹菜(Apiumgraveo—lens)、薄荷(Menthasppiperita)、丁香(Syringaoblata)、大豆(Glycinemax)、甜菜(Betavulgaris)、马铃薯(Solanumtuberosm)、烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopericonesculentum)、菜豆(PhaseolHsvulgaris)、豇豆(Vignaunguiculata)、蚕豆(Vicia知ba)、豌豆(Pisumscatwum)、甜瓜(CMcumismelo)、花椰菜(BrassicaoleraceaL．var．botrytis)、菠菜(Spinaciaoleracea)、胡萝h(Daucuscarota)等。ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病毒的分离物、栽培条件、季节和年份的不同而改变。有时候ArMV的侵染是臆症的，并不会在寄主植物上表现症状。在鉴别寄主上产生的症状：a)昆诺藜(Chenopodiumquinoa)和苋色藜(c．amaranticolor)接种叶上形成褪绿的局部斑点，然后形成系统性斑驳；b)黄瓜(c．sativus)：接种的子叶上产生褪绿的局部斑点，以及系统性脉带或黄色斑点；c)菜豆(P．vulgaris)：产生坏死的局部枯斑、系统性坏死和畸型；d)矮牵牛(Petuniahybrida)：产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑，以及线状斑或明脉。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28073--2011然而，并不是所有株系能够产生这些明显区别的症状，如啤酒花株系(ArMV-H)就不能产生这些明显的症状。另外，ArMV经常与草莓潜隐环斑病毒(strawberrylatentringspotvirus，SLRV)等病毒混合侵染，从而产生更加复杂的症状。因此，使用鉴别寄主进行鉴定时，还需结合其他方法，如DAS-ELISA等。A．4传播途径ArMV主要通过汁液摩擦接种，种苗传播也很普遍，也可通过介体线虫传播。通过种子传播的寄主：莴苣(L．sativa)、松草莓(F．ananassa)、大豆(G．max)、甜菜(B．vulgarisvar．saccharifera)、番茄(L．esculentum)等。通过块茎传播的寄主：马铃薯(s．tuberosm)等。通过鳞球茎传播的寄主：水仙(N．tazetta)、郁金香(Tulipagesneriana)、百合(Liliumbrowniivar．colchesteri)等。通过苗木传播的寄主：葡萄(V．vinifera)、草莓(F．ananassa)、啤酒花(H．1upulus)、香石竹(D．caryophyllus)、蔷薇(R．multiflora)等。传播介体主要为异尾剑线虫(Xiphinemadiversicaudatum)。A．5血清学特性ArMV具有很强的免疫原性，提纯的病毒免疫兔子后，可以制备出高质量的抗血清。ArMV抗血清与烟草环斑病毒(tobaccoringspotvirus，TRsV)、番茄环斑病毒(tomatoringspotvirus，ToRsV)抗血清之间无交叉反应，与健康寄主和常见的自然寄主蛋白也无反应。A．6线虫传多面体病毒属区分种的标准线虫传多面体病毒属区分种的标准是：a)外壳蛋白(Coatprotein，CP)的氨基酸序列同源性小于75％b)聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75％；c)在可能的成分间没有假重组；d)抗原反应有差异；e)不同的介体种类。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载B．1DAS-ELISA所采用的试剂B．1．1包被缓冲液(pH9．6)附录B(规范性附录)DAS-ELISA检测操作步骤GB／T28073--2011碳酸钠(NazCO。)1．59g碳酸氢钠(NaHCOs)2．93g叠氮化钠(NaN。)0．20g加入900mL蒸馏水溶解，用HCI调节pH值到9．6，然后加水至1L。B．1．2磷酸盐缓冲液(PBS，pH7．4)氯化钠(NaCI)8．0g磷酸二氢钾(KHzPOt)0．2g磷酸氢二钠(Na：HPO。)1．15g氯化钾(KCl)0．2g叠氮化钠(NaN。)0．2g加入900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCl调节pH值到7．4，然后加水至1L。B．1．3PBST每升PBS中加入0．5mL的Tween-20。B．1．4样品提取缓冲液(pH7．4)PBST+2％PVP(PVP-40聚乙烯基吡咯烷酮)B．1．5酶标抗体稀释缓冲液PBST+2％PVP+0．2％卵白蛋白。B．1．6底物缓冲液二乙醇胺97mL蒸馏水600mL叠氮化钠(NaN。)0．2g用HCI调整pH至9．8，然后加HzO到1L。注：缓冲液可以储存在4℃～10℃中至少2个月，使用前回温至室温。B．2操作步骤B．2．1包被根据检测试剂盒说明，用包被缓冲液稀释ArMV抗体(如1：200)，在微孔板中每孔加入100止包5 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28073--201被抗体溶液。在室温下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。B．2．2捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次(可在洗板机上完成)。N-k100pL检测样品提取液到酶标板的孔中，每个样品至少2个重复。并设置阳性和阴性对照。在室温下孵育2h或4℃下过夜。B．2．3加入酶标抗体根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1：200)。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100止酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。B．2．4加底物用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP)配制1mg／mL的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次或在洗板机上完成。每孔加入100tzL新鲜配制的底物溶液。室温下避光放置30min～60min，至阳性对照孔明显显色。B．2．5吸光值的测定用酶标仪在405nm处读取吸光值。B．3结果判定通过酶标仪上405rim的OD值来判定。对照孔的OD。值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD。值2，判为阳性；——样品OD。值／阴性对照OD一值明显<2，判为阴性；——样品OD。值／阴性对照OD,。。值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载c．1主要试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检测操作步骤GB／T28073--201C．1．1RNA提取试剂TRIzolreagent、三氯甲烷、异丙醇、70％乙醇。C．1．2反转录试剂M-MLV反转录酶(200U／／1L)、5×反应缓冲液(250mmol／L"Iris—HClpH8．325℃、375mmol／LKCl、15mmol／LMgClz、50mmol／LDTT)、dNTP混合液(各10mmol／L)、RNaseInhibitor(40U／／LL)。C．1．3PCR试剂10×PCR缓冲液(含15mmol／L的Mg”)、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液(各10retool／L)。C．2引物序列ArMV的特异性引物及其序列见表C．1，位于RNA2的CP基因上，预计扩增产物大小为370bp。引物可由有关生物公司合成和纯化。表c．1RT-PCR的引物和序列引物名称引物序列在D100864上的位置ArMl5’一TTGGCAGCGGATTGGGAGTT一3’1120～1139ArM25LATTGGTTOCAGTTGTTAGTGAc_3’1468～1489注：也可以采用ArMV其他特异性引物。4在GenBank上的基因序列登录号。C．3总RNA的提取取0．05g～o．1g检测样品，加入1mLTRIzolreagent充分研磨，室温放置5mintl2000g离心5min，取上清液到另一离心管中；加入三氯甲烷200PL，充分振荡15s，室温放置3mln12000g，4℃离心15rain；取上层水相加入另一离心管中，加入0．5mL异丙醇；12000g，4℃，离心10min，弃去上清液；加入lmL70％乙醇洗涤；RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的超纯水40pL溶解即可。注：本方法是根据TRIzolreagent方法提取总RNA，在保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他总RNA提取方法。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28073--2011C．4eDNA合成在3pL的总RNA中加入1pL的ArM2引物(10pmol／L)，于95℃的水浴中7min，然后迅速冰浴5min。继续加入5×RT缓冲液2．5pL、dNTP混合物(10mmol／L)0．5pL、M—MLV反转录酶(200U／pL)0．5弘L、RNasin0．5弘L、经DEPC处理的ddH204．5pL。然后37℃水浴1h，95℃水浴10min，自然冷却至室温，--20℃冰箱中保存。C．5PCR扩增以上述合成的eDNA为模板，进行PCR扩增。在PCR的薄壁管中分别加入以下试剂(25pL体系)：10×PCR缓冲液(含20mmol／L的Mg”)2．5pL、TaqDNA聚合酶(2．5U／pL)0．5pL、dNTP混合物(每种各含10retool／L)0．5pL、ArMl引物(10pmol／L)1．0pL、ArM2引物(10／1mol／L)1．0pL、cDNA3．0pL、ddHzO16．5pL。反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，进行35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸7min。C．6琼脂糖凝胶电泳RT—PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5pL的RT—PCR产物与1pL的6×上样缓冲液混合均匀，并加到置于0．5×TBE缓冲液的1．5％琼脂糖凝胶孔中，然后在120V下电泳。电泳结束后，放人装有0．5pg／pL的溴化乙锭(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察，拍照，并保存照片。c．7结果判定在阴性对照没有产生条带、阳性对照产生约370bp的预期大小条带情况下，如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则判定为阳性；否则判定为阴性。 D．1引物及探针序列附录D(规范性附录)实时荧光RT-PCR方法GB／T28073--2011本方法的引物及探针序列见表n1，扩增区域在ArMV基因组RNA2的CP基因上，扩增长度100bp。其中ArM3为正向引物，ArM4为反向引物，探针5’一端标记报告荧光染料6-carhoxyfluorescent(FAM)，3。端标记淬灭荧光染料tetra-methylcar-boxyrhodamine(TAMRA)。洼：探针也可以用其他荧光染料标记。表D．1实时荧光RT-PCR的引物和探针序列引物名称引物序列在AIM238665‘上的位置ArM35’一CACTGTAGCCCTTGGAGATAATCCc-3，22～45ArM45LGCCTTCCAGGTCCCACATTAACTT’r_3’98～121ArM-Probe5’一(FAM)CTCACATGATAGCTTGTCATGGACTCC(TAMRA)一3，S1～771在GenBank上的基因序列登录号D．2总RNA的提取总RNA提取见C．3。D．3实时荧光RT-PCR检测反转录合成cDNA见c．4，然后进行实时荧光PCR检测。在25pL的反应体系中加入：12．5pL的2×PremixExTaq，1_0弘L引物ArM3(10gmol／L)，1．0pL引物ArM4(10v-mol／L)，Taqman探针ArM-Probe(10vm01／L)0．5PL，0．5pL的RoxReferenceDye，3．0PL合成的cDNA，超纯水6．5pL。使用实时数据采集模式，反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃15S、60℃40s共40个循环。注：也可采用其他公司的试剂盒，各种试剂的量根据具体情况进行调整。D．4结果判定在阳性对照ct值≤34，阴性对照和空白对照的ct值≥40前提下：——如果检测样品的ct值≤35时，则判定为阳性；——如果检测样品的Ct值≥40时，则判定为阴性；——如果35