GBT28066-2011丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法.pdf 11页

'ICS65．020．01B16a园中华人民共和国国家标准GB／T28066--201丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPseudomonassyringaepv．pisi(Sackett)Youngeta1．2011—12-30发布2012-06-01实施宰瞀鳃紫瓣警麟瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚青GB／T28066--2011本标准按照GB／T1，1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、黄蓬英、易建平、陈青、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法GB／T28066--2011本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学、血清学及分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定。2丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息中文名：丁香假单胞杆菌豌豆致病型。中文别名：豌豆(细菌性)枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等。学名：PseudomonassyringaeVanHall，1902pv．pisi(Sackett，1916)Young，DyeandWilkie，1978。病害英文名：bactrialblightofpea。异名：Bacteiumpisi(Sackett)Smith，1920；Chlorobacterpisi(Sackett)Patel&Kulkarni，1951；PseudomonaspisiSackett，1916；PseudomonassyringaeVanHall，1902；Pytomonas(Sackett)Bergey，etaI．，1923。属原核生物界Procaryotes，变形细菌门Proteobacteria，7-变形细菌纲Gammaproteobacteria，假单胞杆菌目Pseudomonadales，假单胞杆菌科Pseudomonadaceae，假单胞杆菌属Pseudomonas。丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A。3方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、基于体外DNA扩增技术的聚合酶链式反应(PCR)，以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定。4主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂：硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、甘油、硼酸、氯化镁、蛋白胨、生理盐水、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris一盐酸、EDTA、SDS(t二烷基硫酸钠)、cTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、溴化乙锭、头孢氨苄、万古霉素、头孢呋辛酸、溴酚蓝、放线(菌)酮或制霉菌素和PCR相关试剂。5主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器：超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪。1 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28066--2016病菌分离6．1种子样品的制备检查皱缩种子和其他为害状的种子。每份种子检测样品至少检测2000粒种子。将种子倒人5L桶内，加3L无菌水，搅拌，用无菌(新)的塑料袋严密封盖，4℃下静置16h～18h或过夜；去掉塑料袋，充分搅拌。取种子浸出液10mL，用15000g离心5rain，用蒸馏水分2次(每次1mL)洗下沉淀物，制成种子浸出液，以备分离培养。6．2种子中病菌的分离培养取100“L的种子浸出液涂布于P3和(或)s4培养基平板上(培养基配制见附录B)。每个样品设3个～10个重复，无菌水作为空白对照。在25℃土2℃下黑暗中培养，3d后开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1)，则将菌落转移至KB平板上划线培养1d～2d进行纯化(培养基配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。表1培养基上的菌落特征P3培养基S4培养基Pspi的苗落扁平状，白色、透明．边缘不规则Pspi的菌落较大，半球形，白色，边缘整齐多数菌株有蓝色荧光6．3植物组织中病菌的分离培养仔细检查植物叶片、豆荚等组织的症状(参见图A．1)，用无菌刀片将可疑的病斑切成细的切块，加一滴无菌水，置于载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察。如果观察到细菌的菌脓，则进行分离培养。选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm～7mm的组织，用70％酒精表面消毒15s，无菌水洗2次～3次，在s4和(或)P3培养基平板上划线分离。在25℃士2℃下黑暗中培养3d后，开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1)，则将菌落转移至KB平板上培养1d～2d进行纯化，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELISA或PCR等方法鉴定。7病菌鉴定7．1生化鉴定采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。7．2DAS-ELISA方法将可疑菌落配制成104CFU／mL悬浮液，取100pL悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。具体操作步骤见附录C。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7．3PER方法GB／T28066--2011将可疑菌落制备成108CFU／mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增。或者把可疑菌落接种到NB培养基中(培养基配制见附录B)，25℃士2℃下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增。用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照。具体操作步骤见附录D。7．4致病性测试如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果。将豌豆种子播种于小盆钵中，待长出2片～3片真叶的小苗。取在KB培养基上培养24h～48h的菌落，用消毒的昆虫针蘸取菌落，在最为幼嫩的秸秆处进行刺伤接种。每个菌落接种5株小苗。5d～7d后，观察是否产生致病性。如果出现扩展型的水渍状病斑，则有致病性；反之，则没有致病性。注：有些Pspi的菌株在接种1d～2d后，就引起小苗倒伏。8结果判定与检测报告8．1结果判定8．1．1未分离到可疑菌落如果经s4或P3培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出Pspi。8．1．2分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落，应经生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法检测，并通过致病性测试的确认。——如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性，致病性测试也产生典型症状，则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型；——如果生化鉴定、DAS-ELISA检测或PCR的结果为阴性，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型；——如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，而致病性测试为阴性，则应重新进行致病性测试。致病性重新测试后，如果仍然未产生典型症状，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型。8．2检测报告检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据，包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌落形态特征照片、PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28066--2011A．1寄主植物附录A(资料性附录)丁香假单胞杆菌豌豆致病型相关资料自然寄主：豌豆(Pisumsativum)、扁豆(Dolichoslablab)、香豌豆(Lathyrusodoratus)和野豌豆(Viciasepium，V．benghlensis)等。接种寄主：天蓝苜蓿(Medicagolupulina)、豇豆(V．unguiculata)和菜豆(Phaseolusvulgaris)等。A．2传播途径病菌通过种子进行远距离传播。病菌在种子表面或种子内部至少存活10个月，在田间病残体上存活几个月，在干燥的种子上可以保持活性3年以上。即使只有0．01％的种子带菌率，也会引起病害发生，产生严重为害。病残体也是侵染源。在大田，病菌通过雨水的飞溅、风和人工或机械传带而扩散。A．3症状特征豌豆植株所有的地上部分均会产生症状，包括叶柄、复叶、托叶、茎、卷须、花芽和豆荚，其中在茎秆和托叶上的症状最为明显。发病严重的田块颗粒无收，一般损失在20％以下。在干燥且偶有霜冻的天气条件下，症状通常出现在土表的茎部，其上形成水渍状病斑，后期呈橄榄色至紫褐色。病斑向上发展，侵染复叶和托叶，使叶脉变成褐色至黑色，周围组织发病形成扇形图案，脉间组织变成水渍状，并逐渐变黄色至褐色，最后叶片干枯呈纸质状。在多雨的条件，复叶和豆荚上会出现病斑，初期为圆形或卵圆形或不规则的水渍状小斑点，呈暗绿色；斑点扩大后相互融合成较大的病斑，但是只限于脉间。在病斑表面可能出现乳白色的菌脓，干燥后有亮光。在叶片和托叶上，最初症状为小的、暗绿色水渍状病斑。病斑经常扩展并融合，但是均会受到叶脉的限制。在小叶上，病斑发黄，后变褐色，而呈薄纸状。复叶后期变黄，病斑呈褐色纸状。茎秆上的病斑向托叶和小叶扩展，在托叶上产生伞形病斑。受侵染的叶脉变黑褐色，叶片组织变成黄色至褐色，干枯后变薄纸状结构。茎秆上的病斑可能融合，引起萎缩死亡。在果荚上，病斑凹陷，橄榄褐色；在近土表的茎秆上也会产生病斑，最初病斑呈水渍状，而后变榄绿色至暗褐色。发病的豆荚成熟后扭曲，病斑下陷，呈暗绿色。豆荚上的病斑只限于缝隙处的一条窄带。发病的种子在种脐周围形成水渍状的斑点，或呈皱缩状，褐黄色。出苗前后可发生瘁倒，而后植株死亡。严重者种子变色，但多数种子表面没有明显症状。一般只在潮湿的季节或受霜害之后才发生该病害。在潮湿、雨后或重露水的生长季节，易于侵染；潮湿季节发病最重。大降雨加上雨水或重露水极其有利于病菌的扩散。受霜冻或大雨损害的植株最容易发病。Pseudomonassyringaepv．pisi和Pseudomonassyringaepv．syringae所产生的症状相似，难于区别。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A4地理分布围A1豌豆细菌性枯萎镐的症状非洲：马拉维l肯尼亚、摩褡哥、南非、坦桑尼亚、津巴布韦等。美洲：巴西、百幕大、加拿大、墨西哥、美国、阿根廷、乌拉圭等。亚洲：印度尼西亚、以色列、日本、黎巴嫩、尼泊尔、叙利亚，印度等。欧洲：保加利亚、丹麦、英国、法国、德国、希腊、荷兰、匈牙利、意大利、罗马尼亚、瑞士等太洋洲：澳大利亚、新西兰等。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28066--2011附录B(规范性附录)培养基的配制B．1KB培养基(改良KB培养基，King，eta1．，1954)称取以下试剂：3号朊蛋白胨20．0g、磷酸氢二钾(K2HPq)1．5g、硫酸镁(MgSO。·7H：0)1．5g、甘油15．0mL、琼脂15．0g，倒人适宜的容器内，加1000mL蒸馏水，溶解所有的试剂。在121℃下湿热灭菌15rain；冷却至45℃～50℃后，加人头孢氨苄(Cephalexin)50mg(溶解于75％的酒精中，配制成25×10“浓度)；缓慢地倒人培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。培养基在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装入塑料袋中，在4℃下保存。最长的保存时间是2周～3周，否则抗生素会失效。B．2s4培养基称取蔗糖50g、硼酸1．5g和琼脂15．0g，溶解于1000mL的蒸馏水中，在121℃下湿热灭菌15rain，冷却至50℃加入制霉菌素(Nystatine)或放线菌酮(溶解于30mL70％酒精中配制成母液)。B．3P3培养基称取甘油10g、硼酸1．5g和PseudomonasF琼脂38g，溶解于1000mL的蒸馏水中，在121℃下湿热灭菌15min，冷却至50℃加入制霉菌素(Nystatine)或放线菌酮(溶解于30mL的70％酒精中)。B．4NB(NutrientBroth)培养基蛋白胨5．0g，牛肉浸膏3．0g，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌15min。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载C．1包被附录C(规范性附录)DAS-ELISA方法GB／T28066--2011用碳酸钠缓冲液稀释抗体溶液(如1：200)，在微孔板中每孔加入100pL包被抗体溶液。在室温下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。C．2捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBS-Tween洗4次～5次孔(或在洗板机上完成)。加入菌悬液或样品提取液到酶标板的孔中，每孔100pL，每个样品2个孔(重复1次)。并设置阳性和阴性对照。在室温下孵育2h或4℃下过夜。c．3加入酶标抗体根据说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1：200)。倒去孔中的样品提取液，用PBs_Tween洗4次～5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100“L酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。C．4加底物用二乙醇胺缓冲液(pH9．8)配制1mg／mL的对硝基苯磷酸酯的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBS-Tween洗4次～5次孔(可在洗板机上完成)。每孔加入100pL新鲜配制的底物溶液。室温下避光放置，直至阳性对照孔明显显色(约30min～60min)。C．5读数用酶标仪在405121"／1处读吸光值。c．6结果判定c．6．1对照孔的OD40s值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：——缓冲液孔和阴性对照孔的0D4。。值2；——同一样品的OD。值应基本一致。C．6．2在满足了C．6．1质量要求后，结果原则上可判断如下：——样品Onos值／阴性对照On。s值明显>2，判为阳性；——样品0n。s值／阴性对照On。。值在阚值附近，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证；——样品ODtos值／阴性对照ODtos值明显<2，判为阴性。C．6．3若满足不了C．6．1质量要求，则不能进行结果判断。7 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28066--2011D．1PCR模板的制备D．1．1菌悬液PCR模板的制备附录D(规范性附录)PCR方法取3pL的108CFU／mL(ODe”一O．1)的菌体悬浮液，转入装有100pL无菌双蒸水的1．5pL离心管中，在99℃水浴10min，10000g离心10min，冷却后，取上清液作为PCR反应模板。D．1．2DNA的提取取1mL在NB培养基中振荡培养过夜的菌液，10000g离心2min，提取沉淀的DNA；或者取0．1g的发病植物组织，研磨后，提取植物总DNA。提取步骤根据商用试剂盒说明进行。D．2引物序列用于检测Pspi的特异性引物及其序列见表D．1，经合成纯化后，冻干备用。表D．1用于PCR扩增的引物及其序列引物名称引物序列扩增产物EFEPl5’一ACGCTGGGATGTTACTTG3’303bpEFEP25’一GCCTGTTCAAAACGTGTG-3’D．3PCR反应50pL反应体系中加入：10×PCR缓冲液(含MgCIz)5．0pL，10mmol／L的dNTP混合物1．0pL，TaqDNA聚合酶(5U／pL)0．5bcL，10／*mol／L的上下引物各2．0pL，DNA模板2“L，去离子水补足至50扯L。在PCR仪上完成以下程序：95℃预变性3min；然后94℃变性1min、60℃退火1rain、72℃延伸1min，共30个循环；最后在72℃下保持10min。D．4电泳分析取5pL扩增产物与1”L的6×上样缓冲液混合均匀，在0．5XTBE缓冲液配制的1．5％琼脂糖凝胶中，4V／cm～6V／era电泳50min，溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统中观察，拍照并保存。8 D．5结果判定件下GB／T28066--2011在阳性对照扩增出预期大小的条带(约303bp)，阴性对照和空白对照没有扩增到预期大小条——如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阳性；——如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阴性。'