GBT28070-2011黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法.pdf 19页

'ICS65．020．01B16园国中华人民共和国国家标准GB／T28070--2011黑麦草腥黑粉茵检疫鉴定方法DetectionandidentificationofTilletiawalkeriCastlebury&Carris2011—12—30发布2012-06-01实施宰瞀鹊紫瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会促111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖罱GB／T28070--201本标准按照GB／T1，1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271>提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局，深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杏元、龙海、陈枝楠、刘新娇、仲建忠、杨伟东、缪建锟。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围黑麦草腥黑粉菌检疫鉴定方法GB／T28070--2011本标准规定了黑麦草腥黑粉菌的检疫鉴定方法和检疫鉴定流程，明确了取样和样品保存方法。本标准适用于黑麦草传带黑麦草腥黑粉菌的检测以及小麦中污染的黑麦草腥黑粉菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3黑麦草腥黑粉菌基本信息中文名：黑麦草腥黑粉菌。学名：T／lletiawalkeriCastlebury&Carris(简称Tw)。英文名：ryegrassbunt。属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉菌科Tilletiaeeae、腥黑粉菌属Tilletia。病粒及附着于健康种子表面的冬孢子是病原菌进行远距离传播的主要途径，由于该病局部侵染的特性，在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒，因而病粒可随同小麦或黑麦草的资源性引种或科研性引种而进行远距离传播。黑麦草腥黑粉菌的其他信息参见附录A。4方法原理根据黑麦草腥黑粉菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征，应用相关仪器，包括显微镜和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。5检疫鉴定流程检疫鉴定流程见图1。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28070--20116取样方法2图1黑麦草腥黑粉病菌检疫鉴定流程图散装船运黑麦草种子及小麦参照GB／T18085取样方法进行取样。袋装黑麦草及小麦参照SN／T2122取样方法进行取样。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7主要仪器设备和试剂7．1主要仪器设备1摇床。2显微镜。3纯水器。4测序仪。5电泳仪。6低温冰箱。7显微操作仪。8超净工作台。9高压灭菌锅。10光照培养箱。11旋涡振荡器。12普通离心机。13冷冻干燥机。14凝胶成像仪。15核酸蛋白分析仪。16PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)。17破壁针(具有平截切面的针，能将孢子压碎)。18培养皿(9cm)。19筛网(40／zm、20pm)。20孔径100pm的毛细管。21锥形瓶(250mL、500mL)。22盖玻片(18mm×18mm)。23PCR反应管(0．2mL，0．5mL)。24载玻片(25mmX76mm)，厚(o．8mm～1．0mm)。25Tip头(0．1／tL～10弘L，5pL～200pL，100pL～1000／zL)。26可调微量移液器(2pL，10pL，20弘L，100pL，200pL，1000pL)7．2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。7．2．1三氯甲烷。7．2．2异戊醇。7．2．3异丙醇。7．2．4醋酸钠。7．2．5甲酰胺。7．2．670％乙醇。7．2．7无水乙醇。7．2．8Tris饱和酚。7．2．9Taq酶。GB／T28070--20137 标准分享网www.bzfxw.com免费下载(；B／T28070--2017．2．107．2．117．2．127．2．137．2．147．2．157．2．167．2．177．2．187．2．197．2．207．2．21Gelatin。溴化乙锭。DNAMarker。PDA培养基。SDS提取液。PeR缓冲液。电泳缓冲液。上样缓冲液。Bigdye试剂盒。TaqManUniversalPCRMasterMix。席尔氏浮载剂，见GB／T18085。dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。8检测与鉴定8．1实验室器皿和晒网前处理将所有实验器皿和筛网浸泡于1．69的次氯酸钠中15min，然后用蒸馏水冲洗5次。8．2形态学鉴定对查找到菌瘿，或通过洗涤检验获得冬孢子的，先进行形态学鉴定。对茵瘿采用解剖针挑取菌瘿的冬孢子，置于席尔氏液中制片，对洗涤检验采用滴管吸取冬孢子悬浮液制片，待冬孢子胶质鞘允分展开后，进行封片，观察冬孢子的形状，孢壁结构，在100×油镜下测量冬孢子的大小，每个样品测量100个冬孢子。形态学鉴定的具体操作过程见附录B，Tw与近似种的形态学图参见附录c。8．3单个冬孢子直接分子检测对未查找到菌瘿，但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌冬孢子的，要进行单个孢子分子方法检测。每个PeR反应检测1个冬孢子，共检测5个冬孢子。每次PeR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。单个冬孢子直接分子鉴定的具体操作过程见附录D。8．4孢子培养物的分子检测对未查找到菌瘿，但通过洗涤检验发现疑似黑麦草腥黑粉菌，而这些疑似黑麦草腥黑粉菌通过形态学和单个孢子检测无法获得准确结果时，则要对孢子进行培养(培养方法见E．1)，用培养物分子检测。每次PeR检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。孢子培养物分子检测的具体操作过程见附录E、附录F。8．5序列测定与比对将PeR产物纯化后，进行测序，或由生物公司完成。把测序所得的核苷酸序列与已知的黑麦草腥黑粉茵相应序列进行比对。序列比对的具体操作过程见附录G。4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载9结果判断与表述9．1形态学鉴定结果判断和表述GB／T28070--2011对查找到的菌瘿中的冬孢子或通过洗涤检验获取的冬孢子，所观察的症状和形态学特征与黑麦草腥黑粉菌冬孢子的一致，且对其100个孢子大小测量平均值介于30pm～3lpm，则判定该样品中含有黑麦草腥黑粉菌；对其100个孢子大小测量平均值小于25／Lm或者大于35Pm，则判定该样品不含有黑麦草腥黑粉菌；如孢子大小介于25pm～30／xm或31Pm～35pm之间，则判定该样品含有疑似黑麦草腥黑粉菌，须进行进一步分子检测。9．2单个孢子直接分子检测结果判断和表述9．2．1常规PCR检测结果判断和表述单个孢子进行常规PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品的扩增产生473bp的特异性条带，且测序比对与黑麦草腥黑粉菌一致的判定为该样品含有黑麦草腥黑粉菌，如没有PCR扩增条带的则须挑取孢子进行萌发，进行分子检测。9．2．2实时荧光PCR检测结果判断和表述对单个孢子进行MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：——检测ct值小于或等于36，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性；——检测ct值大于36，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如ct值小于或等于36，判定同上；如再次扩增后ct值大于36，则需要挑取冬孢子进行萌发，用孢子培养物进行分子检测。9．3孢子培养物分子检测结果判断和表述9．3．1常规PCR判断和表述对孢子培养物进行常规PcR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品的扩增产生414bp(引物Tinll／Tin4)或473bp(引物P14)的特异性条带，则初步判定黑麦草腥黑穗菌检测结果呈阳性，但需进一步进行实时荧光PCR检测或序列测定与比对进行结果验证，按照实时荧光PCR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定；如该样品无特异性扩增条带，则判定黑麦草腥黑穗菌检测结果呈阴性。9．3．2实时荧光PCR结果判定和表述9．3．2．1普通探针实时荧光PCR结果判定和表述普通探针的实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则——检测ct值小于34，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性；——检测Ct值大于或等于34，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性。9．3．2．2MGB探针实时荧光PeR结果判断和表述MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：——检测ct值小于或等于36，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性；——检测Ct值大于或等于40，判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性；5 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28070--2011——检测ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如ct值小于或等于36或者ct值大于或等于40，判定同上。9．4序列测定和比对把测序所得到的核苷酸序列与已知的黑麦草腥黑粉菌序列进行比对，如果与已知的黑麦草腥黑粉菌相应序列完全一致则判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阳性，不一致则判定黑麦草腥黑粉菌检测结果呈阴性。10样品与原始数据保存10．1样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现黑麦草腥黑粉菌，该样品应保存1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。10．2原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1分布附录A(资料性附录)黑麦草腥黑粉菌其他信息主要分布在美国、澳大利亚、新西兰、加拿大、丹麦、荷兰、日本、匹班牙等国家。A．2形态特征厦寄主GB／T28070--2011黑麦草腥黑粉菌局部为害黑麦草穗部，感病小穗形成深褐色菌瘿，外表由菌丝化的果皮包被，与感病子粒果皮本身具有的淡紫色难于区别，发病严重时，小穗的子房完全被黑粉菌孢子所代替。黑麦草腥黑粉菌冬孢子直径为25pm～35pm(平均30pm)，较T．indica的直径25btm～43ttm(35pm)略小，冬孢子为淡黄褐色，或金褐色至暗褐色，外孢壁表面纹饰为粗糙的疣状突起，呈同心轮纹状排列，疣突外观较T．indica更为粗糙。目前已知自然寄主仅为黑麦草。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28070--201B．1菌瘿查找附录B(规范性附录)‘形态学鉴定在体视显微镜下，检查黑麦草种子中有无菌瘿。对于感病较重的种子，菌瘿颜色多呈暗紫褐色，不同于健康种子，感病种子因腥黑粉菌孢子而散发出三甲胺气味。对于感病轻微的种子，可采用将黑麦草种子浸泡在水中检查菌瘿。B．2洗涤检验B．2．1取50g样品放入250mL锥形瓶中，加入100mL无菌蒸馏水(含0．01％Tween一20)，放于摇床200r／rain摇动3rain以便释放孢子。B．2．2将洗涤液倒在上层的40ffm的筛网上，20ffm筛网在下层，进行抽气过滤，用500mL的锥形瓶接收滤液。B．2．3用100mL无菌蒸馏水冲洗250mL锥形瓶中样品2次，然后将样品洗涤液倒在40bLm的筛网上，再用200mL～300mL无菌蒸馏水冲洗40pm筛网，确保孢子从样品上分离。B．2．4移去40pm筛网，将20／tm筛网倾斜成45。，用无菌蒸馏水将筛网上的孢子都冲洗下来，然后将孢子洗涤液倒入离心管中，1000g离心3rain。B．2．5用移液管将上清缓缓吸出，最后加入席尔氏液，视沉淀物多少定容至100pL～500pL，混匀，镜检。B．3形态学鉴定用解剖针挑起少量孢子，置于席尔氏液中制片，在显微镜下观察孢子大小、颜色和孢壁结构，在100×油镜下测量100个冬孢子。B．4结果判定形态学鉴定的结果判定见9．1。 附录C(资料性附录)黑麦草腥黑粉病菌与近似种的孢子形态图C1黑麦草腥黑粉病菌孢子显微形态图(EPPO，2004)见图C1。C2黑图C2黑麦草腥黑粉病菌孢子电镜扫描形态图C3小麦印度腥黑穗病菌孢子显微形态圉(章桂明等-2005)见图C3。 图C3小麦印度腥黑穗病菌孢于显微形态图C4小麦印度腥黑穗病菌孢子电镜扫描形态圈(章桂明等，2005)见图C4围c4小麦印度腥黑穗病苗孢于电镜扫描形态图 D．1单个孢子核酸制备附录D(规范性附录)单个冬孢子直接分子检测GB／T28070--2011菌瘿中冬孢子获取方法：用针刺破菌瘿，挑取其中不带植物组织的少许孢子，将这些孢子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察孢子是否分散开，再将单个孢子挑起，直接转移到PCR管的管盖中，在低倍镜下确认孢子是否已被成功放置。孢子悬浮液中冬孢子的获取方法：用显微操作系统(或在倒置显微镜下人工操作)从孢子悬浮液中吸取孢子，所用毛细管孔径为100／zm，整个操作过程可在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认孢子已被吸人毛细管内并被转移到PCR管的管盖内。用破壁针对放置在PCR管盖中的孢子实施破壁：在10×低倍镜下用破壁针头轻轻挤压孢子，促使孢子壁破裂，使孢子中的核酸释放出来，在显微镜下检测孢子壁是否已经被压破。快速将PCR反应混合液加到PCR管盖中，振荡混匀，置于冰上，振荡后离心。D．2分子生物学检测D．2．1常规PCR检测D．2．1．1常规PCR引物序列常规PCR引物序列为：正向引物P14—1：57一TGTTTGAGCCACGCTATGACC一3’反向引物P14—2：5’。AACTTCCAAGGCGACCATTC-3’D．2．1．2常规PCR扩增体系及条件反应体系总体积为25止，各成分终浓度为：2．5IxLl0×PCR缓冲液[Tris—HCI(pH8．o)10mmol／L，Mg”1．5mmol／L，KCI50mmol／L]，2pLdNTPs(2．5mmol／L)，0．25pL各引物(10btmol／L)，0．3pLTaq酶(5U／I』L)，2．5btLGelatin[0．01％(wt／v01)]，无菌双蒸水17．2pL。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个PCR反应检测1个冬孢子，共检测5个冬孢子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。PCR的反应条件为96℃预变性3rain，然后进入循环反应：96℃变性15S，59℃退火15s，72℃延伸15S，共70次循环，72℃延伸10rain。D．2．1．3琼脂糖凝胶电泳每个样品取5oL的PCR产物与1pL的6×上样缓冲液混合均匀，并加到含有溴化乙锭(o．5ug／mL)的1．2％琼脂糖凝胶中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。】】 GB／T28070--2011D．2．2实时荧光PCR检测D．2．2．1实时荧光PCR引物及探针序列实时荧光PCR引物及探针序列为：正向引物MP3—1：5’一CTCGAGCCACTccGTTGG一3’反向引物MP3—2：5，一GACAACTCCAGTGATGGCTc(>3，探针序列MPb3：5，一FAM_TACTCTTCATTGCCCTCA-MGB-3，D．2．2．2实时荧光PCR反应体系及条件反应体系总体积为5pL，各成分为：实时荧光反应混合液2．5pLTaqManUniversalPCRMasterMix，0．45pL各引物(10pmol／L)，0．1,uL探针(10pmol／L)，无菌双蒸水1．5pL。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个实时荧光PCR反应检测1个冬孢子，共检测5个冬孢子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。设置扩增反应条件为50℃预热2min，95℃变性10min，然后进入循环反应：95℃变性15S，60℃延伸1rain，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，以使该仪器能进行FAM荧光的检测。D．3结果判定结果判定见9．2。 E．1孢子萌发附录E(规范性附录)孢子培养物常规PCR检测GB／T28070--2011挑取冬孢子，置于2％水琼脂培养基上，18℃～20℃、每日连续光照12h条件下培养10d，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的孢子用接种针挑取置于PDA培养基上，20℃～22℃培养20d。E．2孢子培养物的核酸制备E．2．1称取0．1g培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氨冷冻，用研磨捧将它们研成粉末。E．2．2立即转移到2mL的离心管中，加入65℃预热的SDS提取液700”L，置于水浴锅中65℃水浴30min，期间不断混匀。E．2．3加入5／xL10mg／mLRNA酶，充分混匀，在37℃放置30rain。E．2．4加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，在12000r／rain下离心15rain。E．2．5取上清液，加入1：1三氯甲烷／异戊醇(24：1)，在12000r／min下离心15mira重复一次该步骤。E．2．6加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱静置30rain，在12000r／rain下离心15min。E．2．7弃上清液，加入70％乙醇500pL，12000r／rain下离心3min，弃上清液，重复2次。E．2．8得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入30／zL--50ILLTE或水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一20℃冰箱中保存。注：孢子培养物的核酸也可采用DNA提取试剂盒提取。E．3DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算见式(E．1)和式(E．2)：DNA纯度一ODzs。／ODz”⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(E．1)DNA浓度(pg／mL)一50×OD260⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(E．2)PCR级DNA溶液的OD。。。／OD。。。比值为1．7～1．9。E．4常规PCRE．4．1引物序列引物序列为：正向引物Tin11：5’-TAATGTTGGCGTGGCGGCAT一3’反向引物Tin4：5’一CAACTCCAGTGATGGcTcCG一3’也可以选用D．2．1．1中的P14引物。 GB／T28070--201E．4．2扩增体系及条件引物Tinll／Tin4的反应体系总体积为25止，各成分为：2．5pL10×PCR缓冲液[Tris—HCl(pH8．o)10mmol／L，M92+1．5mmol／L，KCI50mmol／L]，1pLdNTPs(10mmol／L)，0．1pL各引物(25gmol／L)，0．1止AmpliTaq(5U／iLL)，1pLDNA(10ng／vL)，无菌双蒸水20．2pL。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉茵的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。PCR的反应条件为94℃预变性1min，然后进入循环反应：94℃变性15S，65℃退火15S，72℃延伸15S，共25次循环，72℃延伸6rain。引物P14的扩增体系和反应条件见D．2．1．2。E．5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳见D．2．1．3。E．6结果判定结果判定见9．3．1。 F．1孢子的萌发孢子的萌发见E．1。F．2孢子培养物的核酸制备孢子培养物的核酸制备见E．2。F．3DNA纯度与浓度的测定附录F(规范性附录)孢子培养物实时荧光PCR检测DNA纯度与浓度的测定见E．3。F．4普通探针实时荧光PCR检测F．4．1引物及探针序列引物及探针序列为(FrederickRD，2000)：引物序列同E．4．1。探针序列为：5"-FAM—ATTcccGGcTTcGGcGTcAcT—TAMRA-37F．4．2反应体系及条件GB／T28070--2011反应体系总体积为25pL，各成分为：实时荧光反应混合液12。5pLTaqManUniversalPCRMasterMix，1pL各引物(10／1mol／L)，1pL探针(10pmol／L)，1止DNA(10ng／pL)，无菌双蒸水8．5pL。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50℃预热2rain，95℃变性10rain，然后进入循环反应：95℃变性15S，60℃延伸1rain，共34次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使该仪器能进行FAM荧光的检测。F．5MGB探针实时荧光PCR检测F．5．1引物及探针序列引物及探针序列为：正向引物MP2-1序列为；5LAGCGCTAGGATcATGCGG一3’反向引物MP2-2序列为：5’一ccCGGCTTcGGCGT-3’探针MPb2序列为：5’-FAM—TCTGAGGCATcGcTGMGB-3’ GB／T28070--2011也可采用D．2．2．1中的引物和探针进行检测。F．5．2反应体系殛条件反应体系总体积为5pL，各成分分别为：实时荧光反应混合液2．5btLTaqManUniversalPCRMasterMix，0．45”L各引物(10tLmol／L)，0．1pL探针(10ttmol／L)，1pLDNA(10ng／btL)，无菌双蒸水0．5PL。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有黑麦草腥黑粉菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50℃预热2min，95℃变性10min，然后进入循环反应：95℃变性15s，60℃延伸1min，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使该仪器能进行FAM荧光的检测。F．6结果判定和表述结果判定和表述见9．3．2。 G．1PCR扩增附录G(规范性附录)序列测定与比对GB／T28070--201rDNAITS片段PCR扩增方法如下：ITS4引物序列：5’‘TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ITS5引物序列：5oGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’反应体系总体积为25肛L，各成分为：2．5pL10×PCR缓冲液[Tri}Hcl(pH8．o)10mmol／L，M92+1．5mmol／L，KCl50mmol／L]，2pLdNTPs(2．5mmol／L)，1．25pL各引物(10pmol／L)，0．3pLTaq酶(5U／pL)，1pLDNA(10ng／弘L)，无菌双蒸水16．7pL。反应条件为95℃预变性10rain，然后进入循环反应：95℃变性30s，58℃退火30S，72℃延伸1rain，共35次循环，72℃延伸7rain。电泳检测见D．2．1_3。对符合条件的PCR产物进行纯化，直接测序，具体操作步骤见相关试剂盒说明书，也可将PCR产物送到生物公司进行测序。也可以用附录D、附录E中的常规PCR引物进行PCR扩增。G．2序列比对把测序所得的核苷酸序列与已知的黑麦草腥黑粉菌的相对应的序列进行比对。G．3结果判定结果判定见9．4。'