GBT28068-2011柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法.pdf 16页

'ICS65．020．01B16a亘中华人民共和国国家标准GB／T28068--201柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法DetectionofXanthomonascitrisubsp．citriusingthereal—timefluorescentPCR2011-12-30发布2012-06-01实施丰瞀徽鬻瓣警糌瞥篓发布中国国家标准化管理委员会促19 标准分享网www.bzfxw.com免费下载前言GB／T28068--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王中康、殷幼平、王福祥、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测方法GB／T28068--2011本标准规定了柑桔溃疡病菌(Xanthomonascirrisubsp．cirri，Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制备、检测技术、操作方法及结果判定标准。本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB5040柑桔苗木产地检疫规程GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3．1柑桔溃疡病citruscankerdisease由柑桔溃疡病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害。症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面出现隆起的木栓化溃疡病斑，造成柑桔落叶落果、树势衰弱，严重影响柑桔产量与果品外观质量。3．2柑桔溃疡病菌Xanthomonuscitrisubsp．cirri指引起亚洲型柑桔溃疡病的病原细菌，为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新组合(Schaad2006；Young2008)。3．3实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。3．4扩增引物primer人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3．5扩增模板templetDNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。3．6Ct值cyclethresholdvalue实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28068--20113．7柑桔溃疡病菌重组质粒利用特异性引物扩增柑桔溃疡病菌(Xanthomonascirrisubsp．citri)基因组模板，获得的柑桔溃疡菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔溃疡病菌检测的阳性对照。4柑桔溃疡病菌基本信息拉丁学名：柑桔黄单胞茵柑桔亚种Xanthomonascitrisubsp．citriGabrielet．al(1989)。病害名称：柑桔溃疡病citruscancerdisease。分类地位：假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas，柑桔黄单胞Xanthomonascitri[Gabrielet．al(1989)]。主要分布于亚洲的中国，印度和东南亚，美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区。葡萄柚、甜橙、柠檬、莱檬、柑桔和枳等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要途径；田间则主要由夹风雨和农事操作传播。柑桔溃疡病菌其他信息参见附录A。利用柑桔溃疡病菌亚种通用引物对XccF05／XccR05，以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和褐色黄单胞莱檬亚种(BC／D菌系)(检测引物、检测方法及结果判定参见附录B)。5方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物一DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和淬灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TaqDNA聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测(荧光探针法)。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的ct值不同，因此ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。6实验室设置柑桔溃疡病菌PCR检测实验室主要参照GB／T19495．2设置与管理。检测实验室应至少分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区和检测区；每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。7材料与试剂7．1仪器与器材7．1．1实时荧光PCR仪。7．1．2高速台式离心机。7．1．3生物安全柜或超净工作台。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载7．1．4冰箱(冷藏室4℃和冷冻室--20℃)。7．1．5涡旋混匀仪。7．1．6紫外灭菌灯。7．1．7微量可调移液器(0．5pL～10pL、10／*L～100pL、100pL～1000弘L)。7．1．8带滤芯Tip头。7．1．9PCR反应管(O．2mL八联管)。7．1．10微滤柱。7．1．11高压灭菌锅。7．2试剂7．2．1磷酸二氢钠(NaH。PO。·HzO)。7．2．2磷酸氢二钠(Na：HPO。·7HzO)。7．2．3三羟甲基氨基甲烷(Tris)。7．2．4乙二胺四乙酸(EDTA)。7．2．5实时荧光PcR混合试剂(Real-timePCRMasterMix)。8采样及样品处理GB／T28068t20118．1采样及样品处理工具8．1．1样品袋：牛皮纸袋或信封(一次性使用)。8．1．2枝剪。8．1．3剪刀，镊子。8．1．4塑料离心管(1．5mL，50mL)。8．1．2--8．1．4的取(制)样工具应经121℃土2℃，15min高压蒸汽灭菌。田间取样每个样品采集后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70％酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染。8．2取样方法8．2．1田间采羹田间实地取样参照GB5040。取带有柑桔疑似溃疡病病斑的柑桔叶片、嫩梢和果实样品(柑桔溃疡病症状特征参见附录A)。8．2．2口岸检疫及调运检疫抽样种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(无症材料)10株，每株取叶片5片，共50片；接穗等材料则随机直接抽取10份材料；商品果采集带有疑似病斑的果实。样品采集后立即装入样品袋。按规定编号密封后，做好相关记载，包括样品品种、目测症状、采样人、采集地、采集时间等。及时寄送检测实验室。8．3样品存放采集的植物材料若需短暂保存，应置于4℃条件下，可保存1周。检测后余下的植物材料应置于4℃条件下保存7d，以备复测的需要。8．4样品DNA制备操作样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。所制备的DNA样本在4℃条件下保存应不超过3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28068—20117d，在--20℃冻存不超过30d，避免反复冻融。样品制备的具体操作过程见附录C。9PCR检测操作9．1所用引物对与探针荧光染料法PCR检测所用特异性引物对CQUXccF02／CQUXccR02，序列为CQUXccF025’一ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3’，CQUXccR02：57一TCTGACCACATCGCATAGGA．3’。荧光探针法PCR检测所用特异性引物对CQUXccF06／CQUXccR06，序列为CQUXccF065LGCGGCTATTGGCTGACTTCA一3’和CQUXccR06：5’一GTAGGGCGGACCTTGGGAT一3’。荧光标记探针CQUxccP】，序列为5’一TccTccATAAcGAAcTcGcAAGGcAcG一3，。9．2扩增准备PCR扩增反应体系为25pL。准备PCR扩增反应管，分别加入反应液23pL，最后加人制备的待测样品2pL。每个样品设置3次重复。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。9．3扩增过程扩增过程中，设置每次循环的延伸阶段采集荧光。荧光染料法检测应在扩增结束后立即进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线的反应程序为：97℃，1rain57℃，1rain；从57℃开始每升高0．5℃保持10s，连续升高80次(到97℃为止)。检测结束后，根据采集的荧光曲线和ct值判定结果。实时荧光PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录D(不同PCR仪具体程序参数可能稍有调整)。推荐使用柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒组成、功能及使用注意事项参见附录E。10结果判定及描述10．1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况自动调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。10．2质控标准10．2．1阴性对照及空白对照无ct值并且无扩增曲线。否则，此次检验视为无效。10．2．2阳性对照的ct值应<28．0，并出现典型的上升扩增曲线。否则，此次检验视为无效。10．3阴性测试样品检测无ct值和扩增曲线，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品为阴性，表示样品中无柑桔溃疡病菌。10．4阳性测试样品检测ct值≤35，出现典型的扩增曲线，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28068--2011该样品为阳性，表示样品中存在柑桔溃疡病菌。10．5其他情况ct值大于36的样品，建议重做实时荧光PCR扩增，扩增结果按上述标准判定。扩增结果ct值若仍大于36，结果判定为阴性。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28068--2011A．1分类命名附录A(资料性附录)柑桔溃疡病症状及病原菌的名称及鉴别特征比较A．1．1概要柑桔溃疡病是由柑桔黄单胞细菌引起的柑桔重要检疫性病害；主要随带菌苗木或接穗远距离传播，随夹风雨溅射在田问扩散。近年来，柑桔溃疡病菌的分类地位和命名变动较大，原来的柑桔溃疡病菌的A，B／C／D和E菌系，依据16SrRNA基因、多基因分类新方法和培养特征等综合分类方法已经归人三个不同的细菌种下的三个亚种：柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)、褐色黄单胞莱檬亚种(BC／D菌系)和苜蓿黄单胞枳柚亚种(E菌系)。A．1．2柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnascitrisubsp．citri)原称为A系的柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnascitrisubsp．citri)，是依据N．W．Schaad(2006)和J．M．Young(2008)的黄单胞属最新分类命名的调整确认，是分布最广、危害最重的一种柑桔溃疡病的检疫性细菌，可以侵染芸香科柑桔属、枳属的大部分柑桔种类。病菌在血清学、DNA-DNA复性测定、ITS测序、reI>-PCR和培养特征等方面都不同于其他黄单胞属的细菌。A．1．3褐色黄单胞莱檬亚种(置fuscanssubsp．aurantifolid根据DNA-DNA复性测定和多基因测序的相似率，把仅引起南美的墨西哥莱檬、柠檬、酸橙和柚子溃疡病的原B／C／D菌系归人褐色黄单胞莱檬亚种(XanthomonasASCanSsubsp．aurantifolii)。A．1．4苜蓿黄单胞枳柚亚种(x．alfalfaesubsp．citrumelonis)原柑桔溃疡病菌E菌系，引起美国佛州柑桔苗圃的柑桔斑点病。现依据病害症状、同工酶谱带等不同于柑桔亚种的特征，归入到莒蓿黄单胞枳柚亚种(x．alfalfaesubsp．citrumelonis)。A．2柑桔溃疡病症状A．2．1主要症状柑桔溃疡病菌可以侵染柑桔叶片、枝条和果实等地上部分。主要症状特征为产生两面木栓化病斑中心突起呈火山口状。A．2．2叶片症状叶片初始病斑呈圆形、微突起、半透明脓泡状；病斑两面隆起、圆形或近圆形，周围大多有黄色晕圈和釉圈；老病斑木栓化，表面粗糙开裂呈火山口状，晕圈不明显；病斑单生，严重时愈合成片。在潜叶蛾危害的伤口处往往成片发生[图A．1a)]。与柑桔疮痂病等叶部类似症状的区别在于受害叶片仅一面出现隆起的近圆锥形病斑，另一面凹陷。病斑较多时，叶片扭曲畸形，病斑周围仅有黄色晕圈而无釉圈。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载a)柑桔m痔府叶片初期痔斑b)柑#*瘟病#条目m#斑c)柑#女盎翥$女^■#女圈A1柑桔溃蛊病寄主檀株典型症状A．23柱条症状在嫩枝上，产生坏死扁平的病斑，有时具有油浸状的边缘，投有黄色晕圈[图Alb)]A24果实症状在幼果的病斑有黄色晕圈，果实上的火山口开裂更加明显，严重时愈合成片。疮痂病罹病果实病斑呈散生或群生的瘤状突起，可以剥落[图A．1e)]。A3鉴别特征比较柑桔溃疡病菌及其类似病原菌的鉴别特征比较见表A．1表A1柑桔溃疡病菌豆其类似病原菌的鉴别特征比较柑桔渍寤病eltrusbacterialcanker病害g称#桔斑点病(CBS)AⅢ溃癌病BⅢ／CⅢ／Dg*高病柑桔黄单胞柑桔亚#棕色黄单胞莱檬亚种苜蓿黄单胞枳柚Ⅲ#新订学名x4日I^⋯Msi”cansx口^￡^o⋯⋯埔帕oX4Hf^⋯一fI‘nsubspCitriGabrieletaI(1989)subspaurantifaliiGabrieleLsubspCitromel帆isa1．(1989)GabneleL81．．(1989)阿根廷、E拉圭、乌拉圭；B地理分布亚W、非洲、南美各目美目佛，Ⅲ达M日、撼日哥橙、枯、#等多种柑桔寄主范围葡萄柚、甜橙、柚、柠糠、槐属柠糠，酸橙、曼目哥莱糠幼苗韧期形成突起小癌斑，后新*虚术桂化粗糙，Mi隆起病斑，韧斯形成小的瘪斑‘后期形成叶片病斑扁平囊T陪．病有时崭斑m缎釉目日显．外日i束挂化粗糙t隆起病斑t后m病斑醣起t病斑边缘呈术渍#水渍状在YDC上，28℃～30℃培养在YDc±，鹅℃～30℃培养在YDC上，28℃～30℃培养特性如h～44h形成单苗落I不产生56h～60h形成单苗落，日产生培养30h～34h形成单目术落性褐色素水溶性褐色素落．日产±水溶性榀色素 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28068--2011表A．1(续)柑桔溃疡病citrusbacterialcanker病害名称柑桔斑点病(CBS)A型溃疡病B型／C型／D型溃疡病利用麦芽糖，阿拉伯糖，不能不能利用麦芽糖，可沉淀石蕊能利用菊糖，使纤维二利用菊糖；可碱性水解石蕊牛乳，可水解酪朊牛乳，不能水解酪朊糖、甘露醇产酸鉴别特征对CPl、CP2噬菌体不对CPl、CP2噬菌体敏感对CPl、CP2噬菌体不敏感敏感与柑桔亚种抗体血清学反应与柑桔亚种抗体血清学血清学反应呈阳性有差异反应呈阴性8 B．1采样及样品制备附录B(资料性附录)柑桔溃疡病菌柑桔亚种和褐色亚种的常规PCR检测同柑桔溃疡病实时荧光PCR。B．2PCR扩增GB／T28068--201B．2．1扩增引物根据柑桔溃疡病菌专有的保守蛋白基因设计通用引物对xccF05／xccR05，序列分别为5，_TTCGGCGTCAACCTG-3’／5。AACTCCAGCACATACGGGTC-3’(扩增柑桔溃疡病菌保守蛋白基因序列413bp)。用无菌超纯水配制25／zmol／L母液。B．2．2扩增体系配制常规PCR反应液，25”L反应体系，各种成分终浓度为：M92+2mmol／LdNTP200tlmol／LTaq酶1U／25“L引物各0．5btmolPCR缓冲液(pH9．1)1×B．2．3加样取PCR反应管，每管中加入PCR反应液23pL，再分别加入zpL待测样品浸出液。同时以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2“L／每管代替待测模板作为对照。盖紧管盖，30009瞬时离心，以混匀并去除气泡；转移至PCR，扩增区。B．2．4PCR扩增设置好各反应管在定量PCR仪上的孔位并做好标记记录，按照预设孔位将各检测样品及对照放人常规PCR检测仪内进行PCR扩增。扩增程序为(不同PCR仪可能稍有差异)95℃裂解变性94℃DNA变性58℃退火72℃延伸B．3扩增产物检测}35次循环PCR反应结束后，各反应管取10pL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，另一泳道加DNAMarker9．msm“如∞∞h GB／T28068--2011(100bpDNALadder)。100V电压下电泳30rain。电泳后的凝胶经GoldViewer荧光染料染色后，在凝胶成像系统上观察分析并拍照电泳结果。B．4结果判定B．4．1质控标准阳性凝胶图像阳性对照出现413bp左右特征性扩增条带，阴性对照、空白对照无此条带。B．4．2阳性凝胶图像样品泳道中出现413bp左右特征性扩增条带，阳性对照、阴性对照、空白对照正常，判定样品为阳性，表示样品中带有柑桔溃疡病柑桔亚种或褐色亚种。B．4．3阴性凝胶图像样品泳道中没有特异扩增条带，阳性对照、阴性对照、空白对照正常，判定样品为阴性，表示样品中不带可检出的柑桔溃疡病柑桔亚种和褐色亚种。 C．1样品制备试剂附录c(规范性附录)柑桔溃疡病菌检测试剂配制和样品制备GB／T28068--201c．1．10．01mol／L磷酸缓冲液(pH7．2)PBS缓冲液A液；0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液，NaH。PO。·H。O27．6g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。B液：0．2mol／L磷酸氢二钠水溶液，Na2HP04·7HzO53．6g，(或Na2HP04·12H2071．6g，或Na：HPO。·2H：O35．6g)加蒸馏水溶解，定容至1000mL。将0．2mol／LA液14mL与0．2mol／LB液36mL混合均匀即成0．01mol／L磷酸缓冲液。C．1．2TE缓冲液取0．1mol／LTris—HCl(pH7．4)20mL，加入0．5mol／LEDTA(pH8．o)40mL，用灭菌超纯水定容至200mL，4℃保存。C．2样品制备C．2．1工作台及操作者消毒灭菌样品处理在超净工作台或生物安全柜中进行。工作台和操作者双手应消毒灭菌。C．2．2疑似症状柑桔样品制备切取柑桔组织表面的溃疡病疑似病斑，放人1．5mL微量离心管中，加入PBS液500FL，室温条件下浸泡20rain，经8000g离心5min，弃去上清液，以试管底部残液(约100FL)直接作为待测模板。C．2．3无症柑桔样品制备对需检测的无症材料，取植物组织5g～10g，用10mL～20mLPBS液浸泡，150r／rain富集振荡培养1h～1．5h，10000g离心5min，弃去上清液，以试管底部残存液(约500uL)经微滤柱过滤，以200FLTE缓冲液再次洗涤离心，去滤液。最后以100FLTE缓冲液将滤膜上的菌体洗脱，洗脱液作为待测模板。C．2．4阳性对照配制按照C．2．2方法以典型柑桔溃疡病病斑制备浸出液、或经致病性验证的柑桔溃疡病菌纯培养、或以柑桔溃疡病菌特异DNA序列无害化重组质粒DNA作为阳性对照。C．2．5阴性对照按照C．2．3方法制备健康柑桔植株叶片浸出液作为阴性对照。 GB／T28068--201附录D(规范性附录)柑桔溃疡病菌PCR检测操作程序D．1扩增试剂配制(在反应试剂配制区进行)D．1．1用无菌超纯水配制25“mol／L柑桔溃疡病菌特异性引物对母液(用于荧光染料法，引物序列为CQUXceF02：5，一ACGAGAAAGAACTTCGCCCC一3’，CQUXccR02：5’一TCTGACCACATCGCAT—AGGA-3’，扩增柑桔溃疡病菌特异性基因序列为278bp)。D．1．2用无菌超纯水配制25“mo|／L柑桔溃疡病菌特异性引物对cQuxccF061cQUXccR06母液(用于荧光探针法，引物序列为CQUXccF06：5’-GCGGCTATTGGcTGACTTCA一3’和CQUXccR06：5’一GTAGGGCGGACCTTGGGAT-3’，扩增柑桔溃疡病菌特异性基因序列为119bp)。D．1．3以无菌超纯水配制25umol／L荧光标记探针cQUXccPl母液(序列为5LTccTccATAAc—GAACTCGCAAGGCACG-3’)。D．2加样(反应体系为25|lL)D．2．1方法1试剂盒方法(推荐方法)从固相化试剂盒中取出0．2mLPCR固相化试剂检测管，管中分别加入23pL样品恢复液，再在不周管中分别加入2pL待测样品DNA液、阳性对照、阴性对照、空白对照(灭菌超纯水)，盖紧管盖，转移至PCR反应区。D．2．2方法2自配试剂方法D．2．2．1荧光染料法D．2．2．1．1加入引物对CQUXccF02／CQUXccR02母液到荧光PCRMasterMix(含dNTPs、Mg”、热启动DNA聚合酶、PCR缓冲液、SYBRGreenI荧光染料)中，加灭菌超纯水使反应液中引物终浓度为0．25pmol／L，1×PCRMasterMix，混匀。D．2．2．1．2取0．2mLPCR反应管，编号后每管中加入23pL上步所配反应液。D．2．2．1．3分别加入待测样品液2止。／每管；以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2pL／每管代替待测模板作为对照。盖紧管盖，3000g瞬时离心，以混匀并去除气泡。D．2．2．1．4转移至PCR反应区。D．2．2．2荧光探针法D．2．2．2．1在避光条件下加入荧光标记探针CQUXecP，母液和引物对CQUXccF06／CQUXccR06母液到PCRMasterMix(含dNTPs、Mg”、热启动DNA聚合酶、PCR缓冲液)中，使引物终浓度为0．3“mol／L，探针浓度为0．2gmol／L，1×PCRMasterMix，混匀。D．2．2．2．2分别加入待测样品液2止／每管；以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2pL／每管代替待测样品作为对照，盖紧管盖，3000g瞬时离心，以混匀并去除气泡。D．2．2．2．3转移至PCR检测区。12 D．3实时荧光PCR扩增(在检测区进行)GB／T28068--2011D．3．1荧光染料法PCR扩增D．3．1．1扩增程序在iCycler“(Bio-Rad，USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化)：——95℃裂解&酶活性热启动4min，一个循环(×1)；——94℃变性15s，61℃退火，72℃延伸30s，共40个循环(×40)，在每个循环的延伸阶段72℃时采集荧光10s；——末次延伸72℃，7min。D．3．1．2熔解曲线分析PCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线反应程序为：97℃，1min；57℃，1min；从57℃开始每升高0．5℃保持10s，升高到97℃止。验证检测结束后，设备自动记录并生成报告。根据仪器采集荧光曲线和ct值判定结果。D．3．2荧光探针法PCR扩增在iCycler“(Bio-Rad，USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化)：——95℃变性＆酶活性热启动4min，1个循环；——94℃变性15s，61℃退火，72℃延伸30s，共计40个循环(×40)，在每个循环的延伸阶段(72℃)同步采集荧光；——末次延伸72℃，7min。检测结束后，设备自动记录并生成报告。根据仪器采集的荧光曲线和ct值判定结果。 Gn／T28068--2011E．1检测试剂盒组成附录E(资料性附录)柑桔溃疡病菌实时荧光PCR检测试剂盒组成及使用说明每个试剂盒最多可检测48个样品，包括以下成分：——样品制备液——固相试剂恢复液——阳性对照(无害化Xaee特异序列重组质粒DNA)——阴性对照(健康柑桔植株DNA)——同相化试剂检测管E．2说明30mL×4瓶50MLX4支20ngX5支20ng×5支8联管×6条E．2．1样品制备液的主要成分为磷酸缓冲液。E．2．2恢复液用于溶解荧光PCR固相化混合试剂。E．2．3用于荧光染料法检测的固相试剂管中包含除待测样品DNA外的所有PCR扩增反应试剂及荧光染料，用于荧光探针检测的固相化试剂反应管中包含除待测模板DNA外的所有PCR反应试剂及荧光探针。E．3功能所列试剂盒可用于柑桔溃疡病叶片、枝条和果实等组织材料样品中柑桔溃疡病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。具体操作按使用说明进行。E．4使用注意事项E．4．1发生褐变的柑桔组织材料不宜作为PCR检测样品。E．4．2在制样及检测过程中，应严格防范不同样品间的交叉污染，所有用具应彻底清洗并消毒；移液器头尖应一次性使用，并且转移每个样品时都应更换，以免交叉污染。E．4．3上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器，反应管内避免产生气泡。E．4．4全部检测过程可在室温(23℃)下进行，PCR固相化试剂盒可以在室温条件下置于干燥器内密封保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。'