GBT28065-2011地中海实蝇生物芯片检测方法.pdf 10页

'ICS65．020．01B16圆雷中华人民共和国国家标准GB／T28065--201地中海实蝇生物芯片检测方法BiochipdetectionofCeratitiscapitata(Wiedemann)2011-12-30发布2012-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借龠中国国家标准化管理委员会厘111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置GB／T28065--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局，本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：余道坚、李建光、任鲁风、徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春、康林、仲建忠、向才玉。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围地中海实蝇生物芯片检测方法GB／T28065--2011本标准确定了地中海实蝇Ceratitiscapitata(Wiedemann)(双翅目Diptera实蝇科Tephritidae)的生物芯片制备、检测和结果判定方法。本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蛹的鉴定和成虫的鉴定或复核。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。sN／T2039地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法3缩略语SN／T2039界定的缩略语适用于本文件。4方法原理选择实蝇科昆虫线粒体DNACOI基因核苷酸片段为分子标记探针，将探针按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体(如：醛基化基片)的表面形成微点阵，利用反向固相杂交技术，用Cy3标记脱氧胞苷三磷酸(Cy3一dCTP)荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交，实现多个分子之间的杂交反应，并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在，最后确定是否为地中海实蝇。5仪器和用具PCR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机、水浴锅、涡旋器、冰箱、电子天平、烘箱、磁力搅拌器。醛基化基片、多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具、湿盒、杂交盒、计时器、磁柱、芯片架、2L烧杯、15mL离心管、量筒、移液器等。6试剂6．1昆虫基因组DNA提取试剂盒。6．2DNA快速纯化／回收试剂盒。6．3去离子水。6．450％二甲基亚砜(DMSO)。6．50．2％十二烷基磺酸钠(SDS)。6．80．2％硼氢化钠。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28065--2016．710XSSPE(20XSSPE：3mol／L氯化钠，200mmol／L磷酸二氢钠，25mmol／LEDTA，pH7．4)。6．80．3×SSC、0．06XSSC(20XSSC：3mol／L氯化钠，300mmol／L柠檬酸钠)。6．910XPCR缓冲液(Mg”，15mmol／L)。6．10dATP，dTTP，dCTP，dGTP(10pmo[／ML)。6．11Cy3一dCTP。6．12Taq酶。6．13引物(10pmo[／／LL)。6．14探针(50Mmol／L)。6．15阳性质粒。6．16乙醇(70％和99．9％)。6．17洗液I(0．3XSSC，0．2％SDS)。6．18洗液Ⅱ(0．06×SSC)。7生物芯片检测方法7．1样品前处理按照SN／T2039进行。7．2基因组DNA制备按照sN／T2039进行。7．3生物芯片探针7．3．1检测探针检测探针包括以下类型的探针(见A．1)：——实蝇科通用探针；——地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针；——地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针；——地中海实蝇种特异探针；——纳塔尔实蝇C．rosa种特异探针；——非洲芒果实蝇C．Cosyra种特异探针。注1：检测探针是一条20nt～29nt的寡核苷酸；序列为实蝇科昆虫的特异性序列，5’端氨基修饰。注2：实蝇科通用探针能够特异检铡实蝇科昆虫，近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种，地中海实蝇、纳塔尔实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇。7．3．2质控探针质控探针包括以下四种类型探针(见A．2)——定位点探针；——阳性对照探针；——阴性对照探针；——空白对照。7．4芯片制备7．4．1芯片基片：选择光学级醛基基片。2 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28065--20117．4．2探针稀释：探针用50％DMSO溶解至终浓度为50／-mol／L，按照探针点阵排布顺序，将探针溶液用移液器加入多孔板中。7．4．3点样：用芯片点样仪将探针点至基片上。实蝇芯片探针阵列排布图参见B．1。一张基片四个探针点阵的示意图参见B．2。注：每个阵列共5行10列，第l行和第1列为定位点探针，其他探针各设三个重复。每张基片可以根据实际需求点1个或多个相同探针点阵。7．4．4水合湾￡片置湿盒(内盛三分之一体积水)，在烘箱37℃水合12h。7．4．5固定：将基片放在芯片架上，置盛有0．2％SDS溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗5min。取出再放人盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗3次，每次2min。注：漂洗时溶液应没过基片，洗涤时应在洗液中加入磁柱，打开磁力搅拌器搅拌；每漂洗一次，更换去离子水。7．4．6封闭：将固定的基片放入盛有0．2％NaBH．封闭液的烧杯中先磁力搅拌漂洗5min，关闭磁力搅拌器，静置5min，再磁力搅拌漂洗5rain；最后用去离子水磁力搅拌漂洗3次，每次2min。7．4．7质检：基片置15mL离心管中，2000r／min离心2min除去水分；用芯片扫锚仪对基片进行预扫描质检，质检合格后芯片避光冷藏保存。注：基片表面无残余固定剂，探针阵列完整，定位点清晰的为合格的芯片。7．5荧光标记PCR荧光标记PCR反应在常规PCR仪上进行，引物P。和P；序列见C．1，标记PCR反应体系见C．2。扩增条件：94℃90s；94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃5rain。待测样品模板DNA和实蝇阳性质粒平行进行荧光标记PCR，阳性质粒基因序列见C．3。注：阳性质粒是一段人工合成的DNA片段，其5’端和3’端校苷酸序列分别为引物R和P5的互补链。7．6杂交反应7．6．1杂交液预热10×SSPE芯片杂交液在水浴锅中预热至50℃。7．6．2变性分别取杂交液10pL和PCR产物10btL(实蝇模板扩增产物8pL和阳性质粒扩增产物2pL)到一个灭菌的50“L离心管中，涡旋混匀，在PCR仪上95℃变性5min。7．6．3杂交盖上芯片盖片，取变性后的产物20“L加入点样区，芯片用锡箔纸包装，置湿盒中在烘箱46℃避光杂交3h。7．6．4清洗杂交后的芯片依次在42℃预热的洗液I、洗液Ⅱ中磁力搅拌清洗2rain。7．6．5离心芯片置15mL离心管中，2000r／min离心2min除去水分。7．7芯片扫描杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区532nm处进行扫描，PMT值设为800。通过扫描仪软件获得所有探针阵列的荧光数据。注：芯片扫描结果存人计算机，扫描后芯片避光室温保存。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28065--2017．8结果判读芯片杂交信号判读原则见附录D。在质控探针和定位点探针杂交信号正常的情况下，检测探针杂交信号满足以下情况判定为地中海实蝇：——实蝇科探针(teph)杂交信号阳性；——地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种探针(caro)杂交信号阳性；——地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种探针(caco)杂交信号阳性；——地中海实蝇特异探针(ccca)杂交信号阳性。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载附录A(规范性附录)地中海实蝇生物芯片检测探针、质控探针及探针阵列A．1地中海实蝇生物芯片检测探针见表A．1。表A．1地中海实蝇生物芯片检测探针GB／T28065--201探针类型探针名称探针序列(5，一3，)特异性说明科通用探针tephAGCAAAGACTGCTCCTATTGATAAT实蝇科通用探针地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针ATAGCTGGGGAATAATTTAATTG近缘种探针地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种特异探针CGTTAAACCTCCAACTGTAAA近缘种探针种特异探针AGAACAACGCCCGTTAAACC地中海实蝇特异探针种特异探针CTGTTAAACCCCCAACTGTGA非洲芒果实蝇特异探针种特异探针cproACATAATGGAAGTGTGcTACAAC纳塔尔实蝇特异探针A．2地中海实蝇生物芯片检测质控探针见表A．2。表A．2地中海实蝇生物芯片检测质控探针长度类型代码序列(5L3’)nt定位点探针ATGGATACCCAACTTAGCTATTAATAGTC28阳性对照探针PTGAGACCAACCAACTGAAACG21阴性对照探针NGACTATAGTATAAGCGCGGTCCA23空白对照‘B‘空白对照为水对照。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28065--201附录B(资料性附录)芯片检测探针点阵图及在基片上布局示意图B．1地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图见图B．1。AtephAcproAPNB图B．1地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图B．2探针点阵在基片上布局示意图见图B．2。6说明：每张基片有四个探针点阵(小正方形区域)。图B．2探针点阵在基片上布局示意图单位为毫米 标准分享网www.bzfxw.com免费下载附录C(规范性附录)荧光标记PCR引物、反应体系和阳性质粒序列C．1地中海实蝇生物芯片检测荧光标记PCR引物(李文芬等2008)见表C．1。表C．1地中海实蝇生物芯片检测荧光标记PCR引物GB／T28065--201长度引物名称引物序列(5’。3’)正／反向来源基因ntRTTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGG27正向COIP5CTGGAGGGGTATTTTGAAGTCATT24反向C．2荧光标记PCR反应体系见表C．2。表c．2荧光标记PCR反应体系见表试剂名称PCR反应体系终浓度杂交信号阳性参考体系110×缓冲液(Mg”)1．5mmol／L1．0“LdNTPo0．2mmol／L0．2“L正向引物R0．2mmol／L0．2uL反向引物Ps0．2mmol／L0．2uLTaq酶1U0．15uLDNA模板或阳性质粒10ng～20ng0．5pL去离子水补足反应总体积到10“L7．75uL‘反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。。dNTP配方(以10／tL为例)：dATP1／LL，dCTP1pL，dGTP1pL，dTTP0．65／tL，1raMCY3一dCTP3．5PL，去离子水2．85pL。c．3实蝇芯片阳性质粒序列(扩增长度：235bp)TTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGGCACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATATTCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAGAGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAATAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTGAATGACTTCAAAATACCCCTCCAG注：实蝇芯片阳性质粒载体为T载体。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28065--2011附录D(规范性附录)杂交信号阳性结果判读原则D．1每个检测点信号值一该点荧光强度值一该点背景强度值。D．2空白对照平均信号值一3个空白对照点信号值的平均值。D．3阴性对照平均信号值一3个阴性对照点信号值的平均值一空白对照平均信号值。D．4每条探针的每个检测点信号值一空白对照平均信号值>3倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性。D．5每条探针的3个重复检测点平均值为阳性即判读该条探针杂交结果为阳性。D．6如定位探针部分或全部为阴性，则表明探针与片基结合有问题，实验结果不准确，重做试验。D．7如阳性对照为阴性，则表明扩增标记环节或杂交环节存在问题，实验结果不准确，重做试验。'