GBT28064-2011蚕豆染色病毒检疫鉴定方法.pdf 10页

'ICS65．020．01B16a雪中华人民共和国国家标准GB／T28064—201蚕豆染色病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofbroadbeanstainvirus2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀髁紫瓣警糌瞥篓发布中国国家标准化管理委员会履111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚置GB／T28064--201本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈红运、陈青、林石明、郑耘、赵文军、李一农、廖富荣、余芳平、朱水芳、陈枝楠。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围蚕豆染色病毒检疫鉴定方法GB／T28064--2011本标准规定了蚕豆染色病毒的血清学和分子检测方法。本标准适用于蚕豆Vicia丘ba、小扁豆Lensculinaris、豌豆Pisumsativum和菜豆Phaseolusvulgaris种子携带蚕豆染色病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3蚕豆染色病毒基本信息中文名：蚕豆染色病毒。学名：broadbeanstainvirus。缩写：BBSV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae；豇豆花叶病毒属Comovirus。病株花粉可通过授粉将病毒传至健株种子；远距离通过种子传播，种传寄主有蚕豆(种传率4％～16％)、豌豆(20％)和小扁豆(o．2％～32．4％)。BBSV易机械接种传播，并可通过甲虫传毒，豆长喙象甲Apion"OOTO,X是最主要的传毒介体。蚕豆染色病毒的其他信息参见附录A。4方法原理主要根据BBSV的血清学特性和基因组特征进行鉴定，生物学测定为辅助鉴定手段。5仪器、设施及试剂5．1仪器与设施酶联检测仪、电子天平(感量0．0001g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等；微量移液器(2．5止，10pL，20pL，100v-L，200PL，1000pL)；酶联板、研钵等；防虫温室。5．2试剂酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂(见附录c)。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28064--20116检测与鉴定6．1抽样按照sN／T2122的规定执行。6．2制样选取种皮呈BBSV为害症状的可疑病粒，无可疑病粒时随机选取。用无菌水授种16h，磁盘中放人两层吸满水的滤纸，将充分吸水的种子摆放在滤纸上，20℃催芽，芽长2cm～4cm时取芽进行检测。检测方法见6．3。注：资源性引种时，每份资源选10粒～14粒种子播种于防虫温室或网室内，待长出4片～6片叶时挑选有病毒症状植株的叶片进行检测。6．3检测6．3．1酶联免疫吸附测定双抗体夹心法见附录B。6．3．2RT-PCR检测称取0．1g植物组织提取总RNA，沉淀充分干燥后溶于30”LDEPC处理的去离子水中。RT-PCR检测方法见附录c。6．3．3生物学测定生物学测定参见附录D。7结果判定与记录7．1结果判定酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阴性或者鉴别寄主反应与附录D描述不符合，判定未检出蚕豆染色病毒。酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阳性或者鉴别寄主反应与附录D描述相符合，判定检出蚕豆染色病毒。直接对样品进行RT-PCR检测时，检测结果呈阳性即可判定检出蚕豆染色病毒。7．2结果记录记录包括：样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳结果图片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。8样品保存经检验确定携带蚕豆染色病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20℃或者--80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1寄主范围附录A(资料性附录)蚕豆染色病毒寄主、分布及危害症状GB／T28064—2011BBSV侵染7种豆科植物：美丽猪屎豆(cr0￡dz4r缸spectabilis)、毛羽扇豆_(Lupinushirsutus)、白花草木犀(Melilotusalba)、菜豆、豌豆、绛车轴草(Trifoliumincarnatum)和蚕豆。A．2病害症状A．2．1蚕豆蚕豆感染BBSV后，症状分为花叶型和坏死型。花叶型表现为接种叶片上有或无局部斑，新叶均呈褪绿条纹状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状；坏死型表现为接种叶片有或无黄化或局部斑，叶脉和茎出现坏死条纹，最后茎坏死、顶枯、全株萎蔫。种子表皮出现褐色坏死色斑。A．2．2豌豆豌豆感染BBSV后，症状分为花叶型、顶枯型和花叶、顶枯混合型。花叶型先在新叶出现系统褪绿点，后发展为花叶、畸形；顶枯型在茎上出现系统褐色或坏死条纹，后顶梢枯死。A．2．3菜豆豌豆感染BBSV后，症状分为局部斑和系统斑。局部斑是在接种叶上产生局部坏死斑或先为局部褪绿斑而后病斑中心坏死，系统斑不但在接种叶上有坏死斑，新生叶还出现系统枯斑。A．2．4小扁豆小扁豆感染BBSV后，症状不明显或很长时间才有症状反应，有些品种出现死株，有些品种接种后25d才见新叶上出现不明显花叶。因此小扁豆不适合作繁殖寄主或鉴别寄主。A．3分布地区英国、法国、德国、瑞典、捷克、奥地利、波兰、匈牙利、意大利、叙利亚、黎巴嫩、苏丹、摩洛哥、埃及和突尼斯等欧洲、西亚和北非国家。3 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28064--2011B．1试材附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定B．{．1酶联板。B．1．2包被抗体：特异性的蚕豆染色病毒抗体。B．1．3酶标抗体：碱性磷酸酯酶标记的蚕豆染色病毒抗体。B．1．4底物：对硝基苯磷酸二钠(0NPP)。B．1．5PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7．4)NaCl8．0gNa2HP041．15gKH2P040．2gKCl0．2gTween-200．5mL蒸馏水定容至1L。B．1．6样品抽提缓冲液(pH7．4)Na2S031．3gPVP(MW24000～40000)20．0gNaN30．2gPBST定容至1L，4℃储存。B．1．7包被缓冲液(pH9．6)Na2C031．59gNaHCOa2．93gNaN30．2g蒸馏水定容至1L，4℃储存。B．1．8酶标抗体稀释缓冲液(pH7．4)BsA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2．ogPVP(MW24000～40000)20．0gNaN30．2gPBST定容至1L，4℃储存。B．1．9底物(pNPP)缓冲液(pH9．8)MgCl20．1gNaN30．2g二乙醇胺97mL溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9．8，蒸馏水定容至1L。4℃储存。B．2程序B．2．1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100“L／孔，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28064--201B．2．2样品制备待测样品按1：10(质量：体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7500g离心10rain，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行；空白对照为样品抽提缓冲液。B．2．3加样根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板，包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100pL／孔，每个样品设1个重复。4℃冰箱孵育过夜，酶联板用PBST洗涤3次。B．2．4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100“L／孔，37℃孵育4h，PBST洗涤3次。B．2．5加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg／mL(现配现用)，按100“L／孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B．2．6读数用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。注：实际检测时，PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B．3结果判断B．3．1对照孔的0n。s值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的On。。值2；同一样品的OD。。；值应基本一致。B．3．2在满足了B．3．1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品On。。值／阴性对照On。；值>2，判为阳性；样品On“值／阴性对照0D40s值接近阈值，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证样品0n。。值／阴性对照on。。值<2，判为阴性。B．3．3若满足不了B．3．1质量要求，则不能进行结果判断。注；质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28064—2011C．1试剂附录C(规范性附录)RT-PCR检测C．1．1TrizoL裂解液。C．1．2三氯甲烷。C．1．3异丙醇。C．1．475％乙醇。C．1．5去离子水(DEPC处理)。C．1．650×TAETris242g冰醋酸52．1mLNa2EDTA·2HzO37．2g加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1×TAE。C．1．76×加样缓冲液0．25％溴酚蓝40％(质量浓度)蔗糖水溶液C．2实验步骤C．2．1总RNA提取称取0．1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1．5mL离心管中，加入1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀后室温保持5min；4℃，12000g离心10rain，取上清液；加入0．2mL三氯甲烷并剧烈振荡混匀；4℃，12000g离心10min，取上清液；加0．6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温保持5rain；4℃，12000g离心10min，弃上清液；加75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心2min，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30“L去离子水(DEPC处理)中，--20℃保存备用。也可采用等效的试剂盒提取总RNA。C．2．2RT_PCR反应RT-PCR检测引物见表c．1。cDNA的合成：在0．2mL反应管中，加入总RNA6pL，1pL下游引物(20“mol／L)，去离子水4pL，10mmol／LdNTPs1pL，65℃水浴5min，取出后立即放在冰上，加入5×FirstStrandBuffer4肛L，40u／肛LRNaseBlockRibonudeaseInhibimr1弘L，0．1mol／LDTT2“L，42℃水浴2min，然后再加入200U／vLReverseTranscriptase1“L，混匀后42℃水浴50min，70℃水浴15min，合成cDNA。FirstStrandBuffer和ReverseTranscriptase的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。也可采用一步法RT—PCR试剂盒进行扩增。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载表C．1RT-PCR检测的引物GB／T28064--20”检测基因引物序列(5L3’)上游引物TggCAAgTCACAgTTCgC小外壳蛋白(SCP)下游引物CgCCTCTTTggTTTCACgPCR反应体系见表c．2。反应参数：94℃5rain；94℃30s，54℃45s，72℃45s，35个循环72℃7min。表C．2PCR反应体系10×PCRBuffer(MgCl2plus)2．5上游引物(20pmol／L)0．5下游引物(20pmol／L)0．5n口酶(5U／vL)0．2cDNA模板2．0去离子水补足反应总体积为25“LC．2．3电泳C．2．3．1制备凝胶配制1．5％(质量：浓度)的琼脂糖凝胶。溴化乙锭可直接加入琼脂糖凝胶中(浓度为0．5pg／mL)，也可在电泳完成后使用溴化乙锭染色。C．2．3．2电泳用1,uL6×加样缓冲液与5,uL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。C．3结果判断C．3．1阳性对照在499bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。C．3．2阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确，且样品在499bp处无扩增条带，判定结果为阴性。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28064--2011D．1接种附录D(资料性附录)生物学测定病叶加1：1(质量：体积)的磷酸盐缓冲液(0．01mol／L，pH7．2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。D．2寄主症状D．2．1鉴别寄主(diagnosticspecies)菜豆：品种Tendergreen和CanadianWonder表现褪绿局部斑和系统褪绿花叶。品种Prince仅为局部侵染，BBSV不能侵染品种Pinto、IdahoRefugee、BlueLake和Tendercrop。豌豆：BBSV可侵染所有品种，产生系统褪绿斑驳症状，在冷凉气候下茎和叶片出现坏死。蚕豆：BBSV侵染品种“成胡10号”后表现花叶型，即接种叶片上有或无局部斑，新叶均呈褪绿条纹状、环状和块状花叶片上出现褪绿斑驳和花叶症状。BBSV不能侵染苋色藜(Chenopodiumamaranticolor)，千日红(Gomphrenaglobosa，普通烟(Nicotianatabacum)和克利夫兰烟(N．clevelandii)。D．2．2繁殖寄主(propagationspecies)豌豆品种Onward，菜豆品种Tendergreen和蚕豆品种“成胡10号”。D．2．3试验寄主(assayspecies)BBSV在菜豆品种Tendergreen上引起局部斑，在蚕豆上表现系统侵染。'