GBT28080-2011小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法.pdf 21页

'ICS65．020．01B16a雪中华人民共和国国家标准GB／T28080--201小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofT／lletiaindicaMitra201卜12—30发布2012-06-01实施宰瞀徽鬻瓣訾糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会厘111 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28080--201目次前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯‘‘I1范围⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·····⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12规范性引用文件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13小麦印度腥黑穗病菌基本信息⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14方法原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15检疫鉴定流程⋯⋯······⋯······⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯···········⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．16取样方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯36．1未经加工小麦取样方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36．2加工小麦取样方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36．3袋装面粉抽样比例⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯·····⋯⋯⋯⋯‘37主要仪器设备和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·····⋯⋯⋯⋯。37．1主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯····⋯⋯⋯⋯⋯一37．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·48检测与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯········⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯·⋯⋯⋯48．1样品前处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯···⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·48．2形态学鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58．3单个冬孢子直接分子检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58．4孢子培养物的分子检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58．5序列测定与比对·⋯··⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯····⋯·⋯·⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘59结果判断与表述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯·59．1形态学鉴定结果判断和表述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59．2单个孢子直接分子检测结果判断和表述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘‘59．3孢子培养物分子检测结果判断和表述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·······⋯⋯⋯⋯⋯‘‘69．4序列测定与比对⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯。610样品和原始数据保存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯610．1样品保存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯一610．2原始数据保存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6附录A(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌其他信息⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7附录B(规范性附录)形态学鉴定·⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯·······⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一9附录C(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌与近似种的孢子显微形态图和扫描形态图⋯⋯⋯⋯⋯10附录D(规范性附录)单个冬孢子直接分子检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12附录E(规范性附录)孢子培养物常规PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14附录F(规范性跗录)孢子培养物实时荧光PCR检铡⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16附录G(规范性附录)序列测定与比对⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯18 标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖罱GB／T28080--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深：Orf出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杳元、龙海、陈枝楠、向才玉、杨伟东、缪建锟。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB／T28080--2011本标准规定了小麦印度腥黑穗病菌的检疫鉴定方法，包括形态学方法和分子生物学检测方法，规定了小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程，明确了取样和样品保存方法。本标准适用于小麦及其加工产品传带的小麦印度腥黑穗病菌的检测。本标准也适用于除小麦以外的该病菌其他寄主传带小麦印度腥黑穗病菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB／T19495．2转基因产品检测实验室技术要求3小麦印度腥黑穗病菌基本信息中文名：小麦印度腥黑穗病菌。学名：TilletiaindicaMitra。异名：Neovossiaindica(Mitra)Mundkur。病害英文名：karnalbuntofwheat(简称KB)，partialbuntofwheat。属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomyeetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉菌科Tilletiaeeae、腥黑粉菌属Tilletia。小麦印度腥黑穗病菌主要通过发病种子和附着于健康种子表面的冬孢子进行远距离传播，也可随土壤及其他农用工具进行传播。小麦印度腥黑穗病菌的其他信息参见附录A。4方法原理根据小麦印度腥黑穗病菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征，应用相关仪器，包括显微镜和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。5检疫鉴定流程检疫鉴定流程见图1。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28080--2012图1小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程图 标准分享网www.bzfxw.com免费下载6取样方法C．B／T28080--20”6．1未经加-T-d、麦取样方法按照GB／T18085取样方法进行取样。6．2加工小麦取样方法实施堆垛抽样时，在堆垛四周按正弦曲线从上、中、下层随机确定抽样点。实施船舱内货物抽样时，以50m2为一个抽样区，每区设中心及四角(距边缘1m处)五个抽样点每增加一个抽样区，增加三个抽样点。集装箱或车厢装载的麦麸、面粉抽样参照船舱抽样方法进行。6．3袋装面粉抽样比例10袋以下，逐袋抽样。i0～100袋，随机取10件。100袋以上，按一批货物总袋数的平方根数抽取见式(1)。n一俩式中：Ⅳ——一批货物的总袋数；n——应抽取件数(n值取整数，小数部分向上修约)。7主要仪器设备和试剂7．1主要仪器设备7．1．1摇床。7．1．2显微镜。7．1．3纯水器。7．1．4测序仪。7．1．5电泳仪。7．I．6低温冰箱。7．1．7显微操作仪。7．1．8超净工作台。7．1．9高压灭菌锅。7．I．10光照培养箱。7．1．11旋涡振荡器。7．1．12普通离心机。7．1．13冷冻干燥机。7．1．14凝胶成像仪。7．1．15核酸蛋白分析仪。7．1．16PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)。7．1．17破壁针(具有平截切面的针，能将孢子压碎)。7．1．18培养皿(9cm)。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28080--20117．1．197．1．207．1．217．1．227．1．237．1．247．1．257．1．26筛网(53pm、20pm)。孔径100pm的毛细管。锥形瓶(250mL、500mL)。盖玻片(18mill×18mm)。PCR反应管(O．2mL，0．5mL)。载玻片(25mm×76mm，厚(O．8mm～1．0mm)。Tip头(0．1btL～10FL，5弘L～200卜L，100btL～l000btL)。可调微量移液器(2pL，10pL，20pL，100pL，200pL，1000pL)。7．2主要试剂7．2．1三氯甲烷。7．2．2异戊醇。7．2．3异丙醇。7．2．4醋酸钠。7．2．5甲酰胺。7．2．670％乙醇。7．2．7无水乙醇。7．2．8Tris饱和酚。7．2．9Taq酶。7．2．10Gelatin。7．2．11溴化乙锭。7．2．12DNAMarker。7．2．13PDA培养基。7．2．14水琼脂培养基。7．2．15SDS提取液。7．2．16PCR缓冲液。7．2．17电泳缓冲液。7．2．18上样缓冲液。7．2．19Bigdye试剂盒。7．2．20TaqManUniversalPCRMasterMix。7．2．21席尔氏浮载剂，见GB／T18085。7．2．22dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。洼：赊另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。8检测与鉴定8．1样品前处理8．1．1实验室器皿和筛网的前处理将所有实验器皿和筛网浸泡于1．6％的次氯酸钠中15min，然后用无菌水冲洗5次。8．1．2面粉中孢子的获取将面粉样品充分混匀，称取509置于250mL锥形瓶中，加入100mL无菌水，搅拌均匀后倒人直径4 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28080--2011为9CIT／．的玻璃培养皿中，使面粉溶液在培养皿中均匀成一薄层，再将培养皿置于解剖镜下镜检，用解剖针挑取深色冬孢子用于形态学鉴定或分子生物学检测。8．2形态学鉴定对查找到菌瘿，或通过洗涤检验获得冬孢子的，先进行形态学鉴定。对菌瘿采用解剖针挑取菌瘿的冬孢子，置于席尔氏液中制片，对洗涤检验采用滴管吸取冬孢子悬浮液制片，待冬孢子胶质鞘充分展开后，进行封片，观察冬孢子的大小、形状、颜色、外孢壁结构，在100×油镜下测量冬孢子的大小，每个样品测量100个冬孢子。形态学鉴定的具体操作过程见附录B，KB与近似种的形态学图参照附录C。8．3单个冬孢子直接分子检测对未查找到菌瘿，但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌冬孢子的，要进行单个孢子分子方法检测。每个PCR反应检测1个冬孢子，共检测5个冬孢子。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。单个冬孢子直接分子检测具体操作过程见附录D。8．4孢子培养物的分子检测对未查找到菌瘿，但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌，而这些疑似小麦印度腥黑穗病菌通过形态学和单个孢子检测无法获得准确结果时，则要对孢子进行培养(培养方法见E．1)，用培养物进行分子检测。每次PCR检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。孢子培养物分子检测具体操作过程见附录E、附录F。8．5序列测定与比对将PCR产物纯化后，进行测序，或由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌相应序列进行比对。序列比对具体操作过程见附录G。9结果判断与表述9．1形态学鉴定结果判断和表述对查找到的菌瘿中的冬孢子或通过洗涤检验获取的冬孢子，所观察的症状和形态学特征与小麦印度腥黑穗病菌冬孢子的一致，且对其100个孢子大小测量平均值大于35pm，则判定该样品含有小麦印度腥黑穗病菌；对其100个孢子大小测量平均值小于25pm，则判定该样品不含有小麦印度腥黑穗病菌；对其100个孢子大小测量平均值介于25pm～35$zm，则判定该样品含有疑似小麦印度腥黑穗病菌，应进行进一步分子检测。9．2单个孢子直接分子检测结果判断和表述9．2．1常规PCR检测结果判断和表述对单个孢子进行PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如通过电泳获取260bp条带，且测序比对与小麦印度腥黑穗病菌一致的判定为该样品含有小麦印度腥黑穗病菌；如没有PCR扩增条带的则应挑取孢子进行萌发，进行分子检测。 标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T28080--20119．2．2实时荧光PCR检测结果判断和表述对单个孢子进行MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：——检测ct值小于或等于36，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性；——检测Ct值大于36，应重做实时荧光PCR，如再次扩增后，Ct值小于或等于36，判定同上，如Ct值大于36，则需要挑取冬孢子进行萌发，用孢子培养物进行分子检测。9．3孢子培养物分子检测缔果判断和表述9．3．1常规PCR检测结果判断和表述对孢子培养物进行常规PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品扩增产生414bp(引物Tin3／Tin4)或260bp(引物P12)的特异性条带，则初步判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性，但需进一步进行实时荧光PCR检测或序列测定与比对进行结果验证，按照实时荧光PCR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定；如样品无特异性扩增条带，则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。9．3．2实时荧光PCR检测结果判断和表述9．3．2．1普通探针实时荧光PCR检测结果判断和表述普通探针的实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则——检测ct值小于34，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性；——检测ct值大于或等于34，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。9．3．2．2MGB探针实时荧光PCR检测结果判断和表述MGB探针实时荧光PcR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：——检测ct值小于或等于36，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性；——检测ct值大于或等于40，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性；——检测Ct值在36～40之间，应重傲实时荧光PCR，再次扩增后，如ct值小于或等于36或者ct值大于或等于40，判定同上。9．4序列测定与比对把测序所得到的核苷酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌相应序列进行比对，如果与已知的小麦印度腥黑穗病菌序列完全一致，则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性，不一致则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。10样品和原始数据保存10．1样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现小麦印度腥黑穗病菌，该样品应保存1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。10．2原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。6 标准分享网www.bzfxw.com免费下载A．1分布附录A(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌其他信息小麦印度腥黑穗病大多分布于亚洲、北美洲、南美洲和非洲等少数几个国家。亚洲：印度、阿富汗、巴基斯坦、伊拉克、尼泊尔。北美洲：墨西哥、美国。南美洲：巴西。非洲：南非。A．2形态特征GB／T28080--2011病菌冬孢子堆(sporemass)粉状，褐黑色，由冬孢子及不孕细胞组成，新鲜时有恶臭。不孕细胞球形至长椭圆形，常呈泪珠状，淡黄色至淡黄褐色，具有光滑而厚的裂片状的胞壁，并常有一个菌丝附属丝。冬孢子无鞘，有时具有一个菌丝附属丝，球形或近球形，红褐色(几乎不透光)，直径25pm～43pmOF均35”m)，孢壁疣刺状，疣突截形，1．5pm～5pm。A．3寄主范围及症状小麦印度腥黑穗病菌自然寄主为小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)及小黑麦(Triticumaestivum×Secalecereale)。在人工接种条件下，尚可感染下列寄主植物：耐酸草(Bromusciliatus)、旱雀麦(B．tectorum)、加那利黑麦草(Loliumcanariense)、意大利黑麦草(L．multiflorum)、黑麦草(L．perenne)、波斯黑麦草(L．persicum)、一粒小麦(TriticumTItOnOCOCCU∞1．)、野生一粒小麦(Triticumboeticum)、提莫非氏小麦(Triticumtimopheevi)、Triticumopheeri、黑麦(Secalecereale)；山羊草属(Aegilops)：二角山羊草(A．bicornis)、尾状山羊草(A．caudata)、顶芒山羊草(A．COmOSa)、A．mutica、A．searsii、沙伦山羊草(A．sharonensis)、粗山羊草(A．tauschii)、A．triaristana、A．triunciale等。小麦印度腥黑穗病菌主要为害小麦穗部。其症状特点是对寄主穗部的局部侵染，当感病小麦进入糊熟期时，开始出现症状，在有的品种上，病穗一般较健穗短，感病麦株通常表现为部分麦穗发病，感病麦穗也常表现为部分小穗受到感染，病穗通常局部黑粉化。成熟时在受害籽粒的腹沟处果皮下形成黑粉菌腔。感病轻微的，腹沟症状不明显，仅在子粒表面形成暗褐色疱斑，种子发芽率不受影响；感病严重时则病粒全部或大部分形成黑粉腔，外表由菌体化果皮包被，病菌损伤胚及毗邻的胚乳，种子不发芽或虽发芽只形成畸形弱苗；病粒中的黑粉由于病原菌产生三甲胺而散发出腐鱼腥臭味。病菌孢子堆形成于子房中，轻微膨胀或不膨胀，几乎完全为颖片所覆盖。A．4传播途径病粒及附着于健康种子表面的冬孢子是病原菌进行远距离传播的主要途径，由于该病局部侵染的7 GB／T28080--2011特性，在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒，因而病粒可随同贸易性小麦或资源性引种或科研性引种而进行远距离传播。在小麦收获期间，散落到土壤中的菌瘿或从破碎菌瘿中落人土壤中的小麦印度腥黑穗病菌冬孢子，随同土壤进行传播。带有孢子的病土也可通过黏附在人、牲畜和农用收获机械等表面进行传播。 B．1菌瘿查找附录B(规范性附录)形态学鉴定GB／T28080--2011在体视显微镜下，检查小麦种子中有无菌瘿。感病较重的种子，菌瘿颜色多呈暗紫褐色，不同于健康种子，感病种子因腥黑粉菌孢子而散发出三甲胺气味。感病轻微的种子，可采用将小麦种子浸泡在水中检查菌瘿，即：将待检种子浸泡在水中，沿种子腹面对内稃进行观察。B．2洗涤检验B．2．1取50g样品放人250mL锥形瓶中，加入100mL无菌双蒸水(含0．01％Tween一20)，放于摇床200r／min振荡3min以便释放孢子。B．2．2将洗涤液倒在上层的53pm的筛网上，20pm筛网在下层，进行抽滤，用500mL的锥形瓶接收滤液。B．2．3用100mL无菌双蒸水冲洗250mL锥形瓶中样品2次，然后将洗涤液倒在53／Lm的筛网上，再用200mL～300mL无菌双蒸水冲洗53／zm筛网，确保孢子从样品上分离。B．2．4移去53pm筛网，将20／zm筛网倾斜成45。，用无菌双蒸水冲洗将筛网上的孢子冲洗下来，然后将孢子洗涤液倒人离心管中，1000g离心3min。B．2．5用移液管将上清液缓缓吸出，最后加入席尔氏液，定容至100ftL～500pL，混匀，镜检。B．3形态学鉴定用解剖针挑起孢子，置于席尔氏液中制片，在显微镜下观察孢子的大小、形状、颜色和孢壁结构，在100×油镜下测量100个冬孢子的大小。B．4结果判定形态学鉴定结果判定见9．1。 附录C(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌与近似种的孢子显徽形态囤和扫描形奄图CI小麦印度腥黑穗病荫孢子显微形态图(章挂明等，2005)参见圈C1。Jo圈CI小麦印度腥黑穗病苗孢子显微形态图C2小麦印度腥黑穗病菌孢子电镜扫描形态图(章桂明等，2005)参见图C2围C2小麦印度腥黑穗病菌孢于电镜扫描形态囤 c3黑麦草腥黑穗病菌孢子显微形态图(EPPO，2004)参见圈C34黑GB／T28080--20围C4蒜麦草腥黑穗病菌孢子电镜扫描形态围 GB／T28080--2011D．1单个孢子核酸制备附录D(规范性附录)单个冬孢子直接分子检测菌瘿中冬孢子获取方法：用针剌破菌瘿，挑取不带植物组织的少许孢子，将这些孢子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察孢子是否分散开，再将单个孢子挑起，直接转移到PCR管的管盖中，在低倍镜下确认孢子是否已被成功放置。孢子悬浮液中冬孢子获取方法：用显微操作系统(或在倒置显微镜下人工操作)从孢子悬浮液中吸取孢子，所用毛细管孔径为100btm，整个操作过程在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认孢子已被吸入毛细管内并被转移到PCR管的管盖内，用破壁针对放置在PCR管盖中的孢子实施破壁：在10x低倍镜下用破壁针头轻轻挤压孢子，促使孢子壁破裂，使孢子中的核酸释放出来，在显微镜下检测孢子壁是否已经被压破。快速将PCR反应混合液加到PCR管盖中，振荡混匀，然后离心，置于冰上，振荡后离心。D．2分子生物学检测D．2．1常规PCR检铡D．2．1．1常规PCR引物序列常规PCR引物序列为：正向引物P12—1：5’一GTAATAGCCCTGTGCAGAAG-3’反向引物P12—2：57一CGGCGAAGAAAGTCGGATTT-3’D．2．1．2常规PCR扩增体系及条件反应体系总体积为25”L，各成分为：2．5pLl0×PCR缓冲液[Tris—HCI(pH8．o)10mmol／L，Mg”1．5mmol／L，KCl50mmol／L"l，2／zLdNTPs(2．5retool／L)，0．25pL各引物(10／．￡mol／L)，0．3pLTaq酶(5U／,L)，2．5pLGelatin[0．01％(wt／v01)]，无菌双蒸水17．2pL。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个PCR反应检测1个冬孢子，共检测5个冬孢子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为96℃预变性3rain，然后进入循环反应：96℃变性15s，57．5℃退火30S，72℃延伸30s，共70次循环，72℃延伸10rain。D．2．1．3琼脂糖凝胶电泳每个样品取5gL的PCR产物与1pL的6×上榉缓冲液混合均匀，并加到含有溴化乙锭(o．5vg／mL)的1．2％琼脂糖凝胶的点样孔中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。12 D．2．2实时荧光PCR检测D．2．2．1实时荧光PCR引物及探针序列实时荧光PCR引物及探针序列为：正向引物SZFP254-1：5’-AGCCATCAcTGGAGTTGTCATG-3’反向引物SZFP254—2：5’一CCCAGCAAGGTCACCTTTGA一3’探针序列SZFPb255：5’一FAM—CCGACCGTATCGGTCT_MGl3-3’D．2．2．2实时荧光PCR反应体系及条件GB／T28080--2011反应体系总体积为5pL，各成分为：实时荧光反应混合液2．5pLTaqManUniversalPCRMasterMix，0．45pL各引物(10pmol／L)，0．1pL探针(10txmol／L)，无菌双蒸水1．5pL。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个实时荧光PCR反应检测1个冬孢子，共检测5个冬孢子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50℃预热2rain，95℃变性10rain，然后进入循环反应：95℃变性15s，60℃延伸1rain，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使仪器能进行FAM荧光的检测。D．3结果判定结果判定见9．2。 GB／T28080--2011E．1孢子萌发附录E(规范性附录)孢子培养物常规PCR检测挑取冬孢子，置于2％水琼脂培养基上，18℃～20℃、每日连续光照12h条件下培养10d，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的孢子用接种针挑取置于PDA培养基上，20℃～22℃培养20d。E．2孢子培养物的核酸制备E．2．1称取0．1g培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末。E．2．2立即转移到2mL的离心管中，加入65℃预热的SDS提取液700pL，置于水浴锅中65℃水浴30rain，期间不断混匀。E．2．3加入5pLlomg／mLRNA酶，充分混匀，在37℃放置30rain。E．2．4加入等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，在12000r／min下离心15rain。E．2．5取上清液，加入1：l三氯甲烷／异戊醇(24：1)，在12000r／rain下离心15rain。E．2．6再取上清液，加入1：1三氯甲烷／异戊醇(24：1)，在12ooor／rain下离心15min。E．2．7加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱静置30rain，在12000r／min下离心15rain。E．2．8弃上清液，加入70％乙醇500pL，12000r／rain下离心3rain，去上清液，重复2次。E．2．9得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入30pL～50pLTE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于--20℃冰箱中保存。注：该核酸制各也可采用DNA提取试剂盒法。E．3DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算见式(E．1)和式(E．2)：DNA纯度一ODze。／ODm⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(E．1)DNA浓度(／Lg／mL)一50×OD26。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(E．2)PCR级DNA溶液的OD：。。／o功80比值为1．7～1．9。E．4常规PCRE．4．1引物序列引物序列为：正向引物Tin3：5’一CAATGTTGGCGTGGCGGCG(>3，反向引物Tin4：5’一CAACTCCAGTGATGGcTCCG一3’也可以使用D．2．1中的P12引物。】4 GB／T28080--2011E．4．2扩增体系及条件引物Tin3／Tin4的反应体系总体积为25pL，各成分为：2．5pL10×PCR缓冲液[Tris-HCl(pH8．o)10mmol／L，Mg”1．5mmol／L，KCl50retool／L]，1pLdNTPs(10retool／L)，0．1pL各引物(25tlraol／L)，0．1／zLAmpliTaq(5U／tL￡L)，1pLDNA(10ng／／1L)，无菌双蒸水20．2pL。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为94℃预变性1rain，然后进入循环反应：94℃变性15S，65℃退火15s，72℃延伸15s，共25次循环，72℃延伸6rain。引物P12的扩增体系和反应条件见D．2．1．2。E．5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳见D．2．1．3。E．6结果判定结果判定见9．3．1。 GB／T28080--20”F．1孢子萌发孢子萌发见E．1。F．2孢子培养物的核酸制备孢子培养物的核酸制备见E．2。F．3DNA纯度与浓度的测定附录F(规范性附录)孢子培养物实时荧光PCR检测DNA纯度与浓度的测定见E．3。F．4普通探针实时荧光PCR检测F．4．1引物及探针序列引物及探针序列为：引物序列同E．4．1。探针序列为：5’一FAM—ATTcccGGcTTcGGCGTCACT—TAMRA一3，F．4．2反应体系及条件反应体系总体积为25pL，各成分为：实时荧光反应混合液12。5gLTaqManUniversalPCRMasterMix，1gL各引物(10pmol／L)，1pL探针(10pmo[／L)，1pLDNA(10ng／pL)。无菌双蒸水8．5pL。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50℃预热2min，95℃变性10min，然后进入循环反应：95℃变性15s，60℃延伸1min，共34次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使仪器能进行FAM荧光的检测。F．5MGB探针实时荧光PCR检测F．5．1引物及探针序列引物及探针序列同D．2．2．1。E5．2反应体系及条件反应体系总体积为5pL，各成分分别为：实时荧光反应混合液2．5pLTaqManUniversalPCR16 GB／T28080--2011MasterMix，0．45pL各引物(10t”mol／L)，0．1pL探针(10／1mol／L)，1tLLDNA(10ng／uL)，无菌双蒸水0．5pL。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50℃预热2min，95℃变性10min，然后进入循环反应：95℃变性15S，60℃延伸1min，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使仪器能进行FAM荧光的检测。F．6实时荧光PCR检测结果判定和表述实时荧光PCR检测结果判定和表述见9．3．2。 CB／T28080--20”G．1PCR扩增附录G(规范性附录)序列测定与比对用rDNAITS片段PCR扩增方法如下：ITs4引物序列：5oTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ITS5引物序列：5’。GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，反应体系总体积为25pL，各成分为：2．5pL10×PCR缓冲液ETris—HCl(pH8．o)10mmol／L，M92+1．5mmol／L，KCl50mmol／L]，2PLdNTPs(2．5mmol／L)，1．25pL各引物(10／_imol／L)，0．3／aLTaq酶(5u／pL)，1弘LDNA(10ng／t1L)，无菌双蒸水16．7pL。反应条件为95℃预变性10min，然后进入循环反应：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1rain，共35次循环，72℃延伸7min。电泳检测见D．2．1．3。对符合条件的PCR产物进行纯化，直接测序，具体操作步骤见相关试剂盒说明书。也可将PCR产物送到生物公司进行测序。也可以用附录D、附录E中的常规PCR引物进行PCR扩增。G．2序列比对把测序所得的核苷酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌的相对应的序列进行比对。G．3结果判定18结果判定见9．4。'